专利名称：当归复合多糖、制备工艺及用途的制作方法实施例1当归复合多糖的制备净制当归40kg，加水提取3次，每次加水160kg，提取3.0小时，提取温度为100℃。合并提取液65℃减压浓缩至稀稠膏状，调整体积至20L，静置过夜，加入95％乙醇至终浓度35％，搅拌均匀，4℃放置12小时，5000×g离心10min，收集上清液，喷雾干燥，得当归多糖粗品504g。将当归多糖粗品504g用水溶解，浓度为4％，用截留分子量为10K的超滤膜超滤，保留液体积为8.6L，上200×300mm SPSepharose阳离子交换柱，洗脱液为pH5.2 50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液，收集流出液共30L，用截留分子量为5K的超滤膜超滤，得保留液9.0L，保留液上DEAE Sepharose阴离子交换柱，洗脱液为pH5.2，50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液，收集流出液共28L，用截留分子量为5K的超滤膜超滤(MWCO＝5,000-8,000)，得保留液5.3L。加入95％乙醇至终浓度70％，4℃放置12小时，5000×g离心10min，收集沉淀。沉淀加水反溶至5.5L，，加入95％乙醇至终浓度70％，4℃放置12小时，5000×g离心5min，收集沉淀。沉淀加水反溶至6L，喷雾干燥，得当归复合多糖精品124g。当归复合多糖含量为97％。检测结果如下1.糖组成(Mol％) 2.氨基酸组成(mol％) 3.蛋白质含量和重均分子量蛋白质含量2.56％。重均分子量56,703道尔顿实施例2当归复合多糖冻干粉针剂的制备取实施例1所得50g当归复合多糖，用含1.0％氯化钠、0.4‰的吐温-80、pH5.2，50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，调整终体积至2000ml。0.22um滤膜除菌过滤，分装到1000个10ml西林瓶中，冻干即得。实施例3当归复合多糖诱导PHA活化的人的外周血单核细胞生成G-CSF、IL-6和IFN-γ从健康人全血中分离、洗涤得到人外周血单核细胞，用RPMI-1640培养基调整细胞数到4×106/ml。用RPMI-1640培养基配制不同浓度的实施例1、当归粗多糖(AP)(用现有实验室方法提取、纯化得到的当归粗多糖(AP))(商澎等，第四军医大学学报.2001，22(14)1311-1314)，和阳性对照药猪苓多糖(连云港东风制药厂)溶液，药物系列为400，200，100，50，25μg/ml，每个浓度做复孔。加入PHA液，终浓度4μg/ml。加入单核细胞悬液，细胞终浓度为2×106/ml。细胞对照孔只加单核细胞悬液和PHA液，培养液对照孔只加RPMI-1640培养基。37℃，5％二氧化碳培养箱培养24小时，离心，收集上清。用相应的ELISA试剂盒分别检测粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素6(IL-6)和干扰素-γ(IFN-γ)的生成量，用加药组产生的细胞因子量/细胞对照组产生的细胞因子量(S/C)表示活性。
下表显示不同浓度的当归复合多糖诱导生成G-CSF、IL-6和IFN-γ的数量

从以上结果可以看出当归多糖能诱导PHA活化的人的外周血单核细胞生成G-CSF、IL-6和IFN-γ，且生成量与药物浓度呈正相关。当归复合多糖的诱导效果明显优于同等剂量的当归粗多糖(AP)。
实施例4当归复合多糖刺激Balb/C小鼠脾细胞增殖制备Balb/C小鼠脾细胞悬液，调整细胞数到2.5×106/ml。配制不同浓度的实施例1、当归粗多糖(AP)和阳性对照药猪苓多糖溶液，药物系列为500，250，125，62.5和31.25μg/ml，每个浓度做复孔。加入脾细胞悬液，细胞终浓度为1.25×106/ml。细胞对照孔只加脾细胞悬液。37℃，5％二氧化碳培养箱培养48小时，每孔加入50μl 0.5μCi的3HTdR，继续培养18小时。用细胞收集器收集细胞，在液闪仪上读取cpm值，用给药组cpm值/细胞对照组cpm值(S/C)表示活性。
下表显示不同浓度的当归复合多糖刺激小鼠脾细胞增殖的情况

从以上结果可以看出当归复合多糖能刺激Balb/C小鼠脾细胞增殖，生成量与药物浓度呈正相关。且当归复合多糖的效果明显优于等量的当归粗多糖(AP)。
实施例5当归复合多糖促进接受辐射小鼠骨髓造血前体细胞的恢复将雌性Balb/c小鼠(体重18-22g)，随机分为5组，每组10只第1组正常对照组。第2组照射+生理盐水组。第3组照射+实施例1，用量100mg/kg/d。第4组.照射+当归粗多糖(AP)，用量100mg/kg/d。第5组.照射+猪苓多糖，用量200mg/kg/d。
0天除正常对照组外，用全身亚致死量(总量600cGy)X线照射小鼠。从0天开始，各给药组小鼠皮下注射给药，每日一次，连续给药7天。正常对照组0天、照射+生理盐水组0-6天皮下注射等体积的生理盐水。于实验的8、11、16天分批处死小鼠，无菌取股骨，制备骨髓细胞悬液，调整细胞数为1×105/ml，加入培养基，置CO2培养箱，37℃培养6天，计数骨髓粒、单系祖细胞(CFU-GM)。37℃培养7天，计数骨髓红系爆增式集落形成细胞(BFU-E)。37℃培养8天，计数骨髓巨核造血前体细胞(CFU-MEG)。
下表显示当归复合多糖促进接受辐射小鼠骨髓造血前体细胞的恢复

备注各组与生理盐水组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
从以上结果可以看出当归复合多糖可促进接受辐射小鼠的骨髓粒-单系祖细胞、红系祖细胞、巨核造血前体细胞的恢复，当归粗多糖(AP)只能促进前两种骨髓细胞的恢复，且效果弱于当归复合多糖。
实施例6
当归复合多糖促进接受放疗小鼠外周血象的恢复Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组第1组为实施例1，用量为50mg/kg/d。第2组为实施例1，用量为200mg/kg/d。第3组为当归粗多糖(AP)，用量为200mg/kg/d。第4组为猪苓多糖，用量为200mg/kg/d。第5组为生理盐水组。第6组为正常对照组。
1-5组小鼠在0天接受X射线照射，照射总量为550cGy。从照射当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药一周。第7、10、14、17、21、24日分别取尾静脉血，计数外周血白细胞(WBC)，红细胞(RBC)，血红蛋白(Hb)，红细胞压积(HCT)和血小板(PLT)。
外周血WBC(×109/L)的变化

外周血RBC(×1012/L)的变化

外周血Hb(g/L)的变化

外周血HCT(％)的变化

外周血PLT(×109/L)的变化

备注各组与生理盐水组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
从以上结果可以看出当归复合多糖的用量在50-200mg/kg/d时，可以促进接受放疗小鼠外周血RBC，Hb，HCT，PLT和WBC的恢复，且恢复的情况与用药量呈正相关。当归粗多糖(AP)不能促进PLT的恢复，且效果差于同等剂量的当归复合多糖。
实施例7当归复合多糖促进化疗小鼠外周血象的恢复Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组第1组为实施例1，用量为50mg/kg/d。第2组为实施例1，用量为200mg/kg/d。第3组为当归粗多糖(AP)，用量为200mg/kg/d。第4组为猪苓多糖，用量为200mg/kg/d。第5组为生理盐水组。第6组为正常对照组。
1-5组小鼠在-1，0天接受丝裂霉素，尾静脉给药，给药剂量为3mg/kg/d。化疗当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药7天。第2、5、7、9、12、14、16、19、22日分别尾静脉采血1次，计数外周血白细胞(WBC)，红细胞(RBC)，血红蛋白(Hb)，红细胞压积(HCT)和血小板(PLT)。
外周血WBC(×109/L)的变化

外周血RBC(×1012/L)的变化

外周血Hb(g/L)的变化

外周血HCT(％)的变化

外周血PLT(×109/L)的变化

备注各组与生理盐水组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
从以上结果可以看出当归复合多糖的用量在50-200mg/kg/d时，可以促进接受放疗小鼠外周血RBC，Hb，HCT，PLT和WBC的恢复，且恢复的情况与用药量呈正相关。当归粗多糖(AP)不能促进PLT的恢复的作用，且效果差于同等剂量的当归复合多糖。
实施例8当归复合多糖刺激免疫功能低下的Balb/c小鼠脾细胞分泌IFN-γBalb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组10只。试药分为4组第1组为实施例1，用量为25mg/kg/d。第2组为实施例1，用量为100mg/kg/d。第3组为当归粗多糖(AP)，用量为100mg/kg/d。第4组为胸腺肽，用量为5mg/kg/d。第5组为生理盐水组。第6组为正常对照组。
从第1天起，1-5组皮下注射给药，连续给7天。第4天，除正常对照组外，各组腹腔注射环磷酰胺1次，剂量为200mg/kg。第11天处死小鼠，制备脾细胞悬液，调整细胞数为2×106/ml，每孔加入1ml，做复孔。加入ConA至终浓度2.5μg/ml，无ConA者为对照。在5％二氧化碳孵箱，37℃孵育48小时。离心，收集上清液，用ELISA法检测细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的含量。
下表显示当归复合多糖刺激免疫功能低下Balb/c小鼠脾细胞分泌IFN-γ

备注各组与生理盐水组比较。
从以上结果可以看出当归复合多糖的用量在25-100mg/kg/d时，可以刺激免疫功能低下小鼠脾细胞分泌IFN-γ。且生成量与用药量呈正相关。当归粗多糖(AP)的效果弱于同等剂量的当归复合多糖。
实施例9当归复合多糖对鸡法氏囊病毒的体内抗病毒作用4周龄雏鸡，体重200-250g，经鸡法氏囊病毒攻毒后随机分为3组，每组25只，雌雄各半。第1组对照组，不给药。第2组口服给药组，实施例1加入饮水中，50mg/天。连续给药5天。第3组，肌肉注射给药组，实施例1用量为50mg/天，注射总体积为1ml。连续给药5天。连续2周观察用药组和对照组动物的死亡情况。实验期间，死亡动物需取出法氏囊，称重。第14天，处死所有存活动物，取出法氏囊，称重。
下表显示第14天用药组和对照组动物的一般状态，死亡率和法氏囊重量

从以上结果可以看出口服或肌肉注射给予当归复合多糖，用量在50mg/天时，可以明显减轻鸡法氏囊的感染和病变，防止鸡法氏囊病毒攻毒动物的死亡。
实施例10当归复合多糖在临床上对犬瘟热和犬细小病毒感染的疗效实验共分4组。第1组临床确诊为犬细小病毒感染的小型犬41只，体重1500-4000g，静脉给实施例1。体重1000-2000g的动物100mg/d，体重＞2000g的动物200mg/d，每天1次，连续用药3-7天。第2组临床确诊为犬细小病毒感染的小型犬20只，体重1000-4600g，按常规疗法治疗，作为对照。第3组临床确诊为犬瘟热的小型犬47只，体重1000-5000g，静脉给实施例1，用法同上。连续用药3-7天。第4组临床确诊为犬瘟热的小型犬28只，体重1000-5000g，按常规疗法治疗，作为对照。观察动物的治愈情况和死亡情况，随访至4周，了解有无复发。
下表显示不同时间段各组动物的死亡情况和疾病复发情况

犬瘟热和犬细小病毒感染是两种严重的动物传染性疾病，不经治疗死亡率＞95％。当归复合多糖用量在100-200mg/d时，与目前临床采用的治疗方案比较，患病动物的死亡率低，治愈动物在28天内没有复发。
根据以上结果可以将当归复合多糖用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症、免疫力低下、病毒感染性疾病和作为抗癌辅助药。


本发明涉及一种从中药材当归(Angelica Sinensis(Oliv)Diels)的干燥根中提取、分离、纯化得到的重均分子量在20,000－80,000道尔顿之间，主要由半乳醛酸聚糖(Polygalacturonic acids)，阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)，鼠李半乳醛酸聚糖(Rhamnogalacturonans)和α－葡聚糖(α－Polyglucans)组成的复合多糖。含量＞80％。取适量的当归复合多糖，不加入或加入一种至多种药学上可以接受的辅剂，制成注射剂。每个注射剂量单位至少含50mg本发明物质。用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症、免疫力低下、病毒感染性疾病和作为抗癌的辅助剂。