纳米微粒形式的磁铁矿制作方法

F·伊诺森蒂, 吉奥瓦尼·巴迪, 马克·比托斯

2012年9月19日

2010年12月15日

2009年12月15日

卡罗比亚意大利(共同)股份公司

A61K49/06GK102686519SQ201080056420

磁铁矿 纳米 微粒 形式

1.用于制备磁铁矿纳米微粒的多元醇型方法，所述方法包括步骤(ii)，其中在催化剂和合适量的水的存在下，在多元醇溶剂中由金属铁和Fe111开始制备所述纳米微粒2.根据权利要求I所述的方法，其中水以等于所使用的Fe111盐的摩尔数的I.5-5倍的摩尔量存在3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述多元醇溶剂选自甘油、丙二醇和乙二醇的组4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述催化剂选自无机酸5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述Fe111的前体是溶于多元醇溶剂中的盐6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述Fe111以多元醇溶液的形式被添加到反应混合物中7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述Fe111以连贯的部分或以受控的速率被添加到反应混合物中，使得在所述添加过程中，所述反应混合物不经历显著的温度变化8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在所述方法之前进行从Fe°开始的Fe111的多元醇溶液的制备步骤(i)，其中所述步骤(i)包括以下步骤 (a)在多元醇溶剂中且在有机酸的存在下，由Fe°开始制备Fe11溶液； (b)通过将空气鼓入从步骤(a)获得的溶液中来制备Fe111溶液； 并且其中从步骤(b)获得的所述Fe111溶液被用于步骤(ii)中9.纳米微粒磁铁矿，其通过根据权利要求1-8中任一项所述的方法获得10.根据权利要求9所述的磁铁矿在制备用于肿瘤的高热治疗和/或诊断性治疗(借助于MRI)的治疗诊断学组合物中的用途

本发明涉及用于制备纳米微粒形式的磁铁矿的方法的领域 现有技术磁铁矿是具有铁磁性的矿物，其化学式是Fe304磁铁矿的结构式还可以写成FeO Fe2O30已知当浸没在无线电波段中的磁场中时，纳米微粒形式(即具有在几纳米至数十纳米的范围内的尺寸)的磁铁矿发热并随后向其周围释放热能，因此导致通常所说的高热效应(hyperthermic effect)或磁高热在肿瘤学中，利用高热来改善化学治疗或放射治疗的有效性且在这方面，将实体瘤的温度提高至41°C和45°C之间导致癌细胞的凋亡为了实现这一目的，可以通过使磁性纳米微粒与肿瘤接触以利用其高热效应来使用磁性纳米微粒因此，例如包括纳米微粒磁铁矿核和聚合物涂层或蛋白质涂层、可能装有药物并用合适的靶向剂修饰的生物相容的纳米杂化物是潜在的治疗诊断剂，其中在电磁场的作用下产生热(高热效应)的能力、药物递送和在其与成像技术(MRI) —起作用的过程中被检测的能力是协同组合的通常，高热值以SAR(比吸收率(Specific Absorption Rate))表示，SAR是依赖于所施加的磁场的强度和根据以下等式的场转换频率两者的值SAR = K*f (d) *F*f (H0)其中K =常数F =场转换频率f(d)=与微晶尺寸相关的可变函数f(H0)=与所施加的磁场的强度相关的可变函数(根据某些著者，大约至H/-H3)为了施加在肿瘤学中有效的高热影响，生物相容的纳米微粒必须具有高SAR水平首先使生物相容的纳米微粒位于肿瘤内并随后在100-400kHz范围内的频率F下由中等振幅 H(12_25mT)的交变磁场激发[P. ffust, U. Gneveckow, M. Johannsen, D. Bohmer,T. Henkel，F. Kahmann, J. Sehouli, R. Felix, J. Ricke，A. Jordan，Int. J. Hyperthermia 22，673 (2006)]oR. Hergt 和 S. Dutz 在 J. Magn. Magn. Mater. 311，187 (2007)中已评价具有高于lkW/g的SAR的生物相容的纳米微粒能有效地治疗直径为3mm的肿瘤到目如为止，关于磁1 热的最为广泛研究的材料是铁的氧化物，因为它们总的生物相容性以及它们相对简单的合成在文献中，通过合成获得的最有效的磁铁矿已呈现出在 400kHz 下高至 0. 6W/g 的 SAR 值(R. Hergt, R. Hiergeist, I. Hilger，W. A. Kaiser,Y. Lapatnikov, S. Margel 和 U. Richter, J. Magn. Magn. Mater. 270，345 (2004))目前，从高热观点来看，磁小体(在某些动物细胞中存在的磁铁矿晶体)被认为是用于生物医学应用最有效的磁结构(R. Hergt, R. Hiergeist, M. Zeisberger, D. Schiller,U. Heyen, I.Hilger, ff. A. Kaiser, J. Magn. Magn. Mater. ,2005, 293,80) 纳米微粒形式的磁铁矿合成在文献中及在许多专利中被广泛描述所使用的方法可以被分类为3个主组，即I)碱化包含以I 2的化学计量比的Fe11和Fe111离子的溶液(水性的或在多元醇中)；2)多元醇型合成，其中Fe11和Fe111的混合物再次以I 2化学计量比使用；3)在既作为还原剂，又作为稳定剂的试剂(例如油酸)的存在下分解铁化合物(无机的或有机的)所有所描述的合成在评价其实际应用时呈现显著的缺陷·I)碱化方法产生具有控制不佳的尺寸和低的高热的聚集的微粒(其易于形成沉淀)2) “多元醇合成”要求仔细控制醋酸亚铁的化学计量比和用法，醋酸亚铁是很难获得的、昂贵的且很难储存的原料(它是强吸湿性的且对氧化作用极其敏感)3)使用油酸及类似物的还原性合成导致微粒的形成，微粒的表面用亲液基团官能化并因此不溶于水性环境中然而，在2和3的情况中获得的微粒还具有在与磁小体所呈现的值相比较时低的SAR 值因此，显然，需要提供一种方法使得磁铁矿能够以具有足够高的SAR值的纳米微粒形式获得，使磁铁矿能够用于生物医学领域中的磁高热定义和缩写SAR=比吸收率SARN =关于场转换频率的归一化的SAR术语“纳米微粒”意指尺寸在Inm和IOOnm之间的微粒多元醇溶剂是诸如甘油的醇，其包含两个或更多个醇官能度(function)且具有高于250°C的沸点和高于0°C的熔点发明概述本发明借助于其中获得磁铁矿纳米微粒的多元醇型方法解决了上述问题，所述方法包括步骤(ii)，其中在催化剂和合适量的水的存在下，在多元醇溶剂中由金属铁和Fe111开始制备所述纳米微粒本发明的方法使磁铁矿纳米微粒能够具有均匀的和可控的尺寸，由此呈现高的高热效力根据本发明的方法是容易的和有效的且允许避免存在上述缺陷的Fe11盐的使用附图简述图I显示与表1-5相关的图形，其中y轴表示SARN值而x轴表示关于所施加的磁场振幅的值发明详述本发明的方法优选借助于以下步骤从Fe°开始进行i)从Fe°开始制备Fe111的多元醇溶液；ii)借助于如上所述的本发明的方法的磁铁矿纳米微粒的多元醇型制备，其中从步骤(i)获得的溶液被用作Fe111的源上述步骤(i)不是别的反应正是根据下面的反应式的众所周知的且充分描述的对铁的酸侵蚀(甚至诸如醋酸的弱酸)的反应Fe°+2H+ — Fe2++2H2 f (I)在文献中，该反应通常在水性环境中描述，但是已发现其也可以在“多元醇合成”条件下进行同时保持缺乏氧化剂(例如大气氧)的环境通过在低于100°C的温度下将空气鼓入反应介质中，Fe11的多元醇溶液可以随后被完全氧化成Fe111 (例如，醋酸盐)因此在一个优选的形式中，在本发明的方法的步骤(i)中包括借助于以下步骤制备Fe111的多元醇溶液a)在多元醇溶剂中且在有机酸的存在下由Fe°开始制备Fe11溶液； b)通过将空气鼓入到从步骤a)获得的溶液中制备Fe111溶液，随后滤掉任何残留的金属铁优选地，步骤a)在130°C和200°C之间的温度下进行而步骤b)在低于100°C的温度下进行所述有机酸优选选自形成溶于多元醇溶剂的Fe11化合物的酸，特别是醋酸、丙酸、乳酸、乙醇酸优选地，在步骤a)中以等于金属Fe的摩尔数的4_5倍的摩尔量使用酸优选地，对于步骤a)金属Fe悬浮于按重量计等于Fe°重量的80-120倍的量的多元醇中上述步骤(ii)是其中在多元醇溶剂中的Fe°和Fe111离子的混合物在合适量的水的存在下和在酸催化剂的存在下被加热的步骤已发现在“多元醇合成”的条件下(溶剂是诸如甘油或丙二醇或二甘醇的多元醇，在优选包括在130°C和200°C之间的温度下)，当存在合适的催化剂时，铁(III)根据下面的反应式被金属铁还原2Fe3++Fe° — 3Fe2+ (2)该Fe11形成反应通过酸性环境被催化特别地，如盐酸或硫酸的无机酸、或显示酸解的盐如氯化铁(FeCl3)可用作催化剂由于氧化还原反应(2)的动力学是相对慢的而在所选择的温度条件下从Fe11和Fe111形成磁铁矿是快的，因此形成的铁(II)根据下面的反应式与存在的过量的Fe (III)完全反应形成磁铁矿2Fe3++Fe2++4H20 — Fe304+8H+ (3)因此形成磁铁矿的完整反应可以描述为8Fe3++Fe°+12H20 — 3Fe304+24H+ (4)根据本发明，纳米微粒磁铁矿可以优选地在诸如甘油、丙二醇、二甘醇以及所有类似的多元醇的溶剂中，方便地在130°C和200°C之间的温度下制备溶剂中的水量是控制通过DLS (动态光散射)测量的所获得的磁性纳米微粒的流体动力学半径的尺寸的关键因素；磁铁矿晶体的尺寸实际上由操作浓度和反应环境中存在的水的浓度决定优选地，水以等于步骤(ii)中使用的Fe111盐的摩尔数的I. 5-5倍的摩尔量存在优选地，Fe°以等于步骤(ii)中使用的Fe111盐的摩尔数的0. 2-1倍的摩尔量存在优选地，对于步骤(ii)金属Fe悬浮于按重量计等于Fe111溶液重量的0.5-4倍的量的多元醇中还注意到，通过以连贯添加Fe111溶液(或可选择地，醋酸铁111或其它溶于乙二醇溶剂(glycolic solvent)的盐)的半连续方式，即以使得磁铁矿形成反应以连贯的步骤来进行的方式操作，可以获得更高的高热效力值(参见在实验部分中给出的实施例B3-B6 用于测量高热效应的方法)类似的便利的方法是控制Fe111溶液的添加速率使得在添加过程中温度不经历明显变化(即保持稳定，AT < 10°C )(参见实施例B-5和B-6)优选地，Fe111以2-5wt%浓度的多元醇溶液的形式被添加优选地，酸催化剂以等于步骤(ii)中使用的Fe111盐的摩尔数的0. 01-0. I倍的摩尔量使用在步骤(ii)的结尾，通过过滤将固体残余物(金属铁)与液相分离以获得显示出显著磁性的透明的深褐色产品(包含纳米微粒形式的磁铁矿)对于相同频率和强度的所施加的磁场，所发现的通过本发明的方法获得的纳米微粒的SAR值可与文献中已知的和报导的关于磁小体的SAR值相当或高于文献中已知的和报导的关于磁小体的SAR值(参见表1-5和图I)具有所述磁高热性质的通过合成获得的磁铁矿纳米微粒在文献中没有先例；观察到的高热影响是由于通过本发明的方法获得的磁铁矿的结构中特定的和高的结晶度通过上述方法获得的磁铁矿潜在地用于制备用于肿瘤的高热治疗和/或诊断性治疗(通过MRI)的治疗诊断学组合物对于生物医学应用，磁铁矿纳米微粒在生理环境中即在水性环境中且在相对高盐度的存在下是稳定的是特别重要的通过用磷酸处理反应产物(4)可以易于使根据本发明获得的纳米微粒磁铁矿在水中稳定地分散以这种方式，通过离心法获得固体沉淀，该固体沉淀(在用水洗涤以除去过量的磷酸后)可以容易地溶于稀释的氨溶液以获得最终弱碱性pH的分散体根据下面的可实行的实施例可以更好地理解本发明实验部分A)醋酸铁m溶液的制备实施例A-I将以下物质引入到配备有滴液漏斗、温度计、冷却器和用于用气体冲洗的系统的500ml烧瓶中试剂量(g)含量DEG150.00>99%金属 Fe1.5099%醋酸8 0099%首先用氮气流过系统，随后(仍在虜性气体下)开始加热，将温度设定在150°C12小时后，注意到金属基质铁几乎完全消失以及溶液中的颜色改变当将系统保持在氮气下时，将温度降低至85°C，此后开始鼓入空气立即注意到溶液中的颜色改变，其颜色变成暗红保持空气鼓入持续2小时，随后将系统冷却至环境温度通过布氏漏斗过滤溶液以除去残留铁痕迹，此后溶液可用于后续步骤B)磁铁矿的制备实施例B-I 将以下物质引入到配备有滴液漏斗、温度计、冷却器和氮气惰化系统的500ml烧瓶中试剂量(g) 含量DEG150.00 > 99%H2OI. 50 100%在150°C的温度下添加以下物质Fe 錢I. 50 99%随后立即添加在DEG中的Fe (CH3COO) 3 溶液 30.004. 34%使温度下降到低于140°C (138°C )，并随后返回到150°C并保持在此温度持续25分钟随后添加以下物质32% HCl0. 10 32. 00%使温度达到160°C并保持在此温度持续3小时在此时间快结束时，将液相与金属铁残余物分离获得具有显著磁性的黑棕色溶液使用DLS (动态光散射)的粒度分析PDI 0. 230 ;Z平均15. 86nm ;平均体积11. 43nm ;峰百分比 99. 9%0磁铁矿含量(ICP) 2650ppm理论磁铁矿含量0.26%30 秒高热0.6°C特定高热1% (specific hyperthermia) 2. 4°C实施例B-2将以下物质引入到配备有滴液漏斗、温度计、冷却器和氮气惰化系统的500ml烧瓶中试剂量(g) 含量DEG150. 00 > 99%H2OI. 50 100%将T设定在150°C一达到此温度就添加以下物质FeI. 5099%在缓慢滴加以下物质之后立即确保温度不降低到低于145°C在DEG中的Fe(CH3COO)3溶液120.00 4. 34%使温度返回到150°C并保持在此温度持续25分钟随后添加以下物质32% HCl0. 10 32. 00%使温度达到170°C并保持在此温度持续3小时在此时间快结束时，将液相与金属铁残余物分离获得具有显著磁性的黑色溶液动态粒度分析PDI 0. 130 ；Z 24. 00 ;平均体积21. 29nm ;峰百分比100%磁铁矿含量(I.C.P.) 0. 70% 理论磁铁矿含量0. 71%30 秒高热4.2°C特定高热1%5.9°C实施例B-3将以下物质引入到配备有滴液漏斗、温度计、冷却器和用于用气体冲洗的系统的500ml烧瓶中试剂量(g) 含量DEG150. 00 > 99%H2OI. 50 100%将温度设定在150°C一达到此温度就添加以下物质FeI. 50 99%随后立即添加在DEG中的Fe (CH3COO) 3 溶液 30.004. 34%温度降低至138°C使温度返回到150°C并保持在此温度持续25分钟随后添加以下物质32% HCl0. 10 32. 00%使温度达到160°C并保持在此温度持续30分钟随后添加以下物质在DEG 中的30.00 4. 34%Fe (CH3COO)3ga使温度返回到160°C并保持在此温度持续45分钟重复该过程三次以便总共添加120克溶液仍在惰性气体下，将悬浮液保持在160°C持续I小时随后允许其冷却最后，将液相与金属铁残余物分离获得具有显著磁性的黑色溶液动态粒度分析=PDI 0. 074 ；Z 20. 93 ;平均体积18. 27nm ;峰百分比100%磁铁矿含量(I.C. P. ) 0. 74%理论磁铁矿含量0. 71 %30 秒高热8.4°C特定高热1% 11.4°C实施例B-4将以下物质引入到配备有滴液漏斗、温度计、冷却器和氮气惰化系统的500ml烧瓶中试剂量(g) 含量DEG150. 00> 99%H2OI. 50100%将温度设定在150°C一达到此温度就添加以下物质FeI. 5099%之后随后立即添加在DEG 中的30.004. 34%Fe (CH3COO)3ga温度降低至138°C使温度返回到150°C并保持在此温度持续25分钟随后添加 以下物质32% HCl0. 1032. 00%使温度达到160°C并保持在此温度持续30分钟随后将温度升高至170°C，保持此170°C的温度持续30分钟随后添加以下物质在DEG 中的30.004. 34%Fe (CH3COO)3ga使温度返回到170°C并保持在此温度持续45分钟重复该过程五次以便总共添加180克溶液仍在惰性气体下，将悬浮液保持在170°C持续I小时随后允许其冷却最后，将液相与金属铁残余物分离获得具有显著磁性的黑色溶液动态粒度分析PDI 0. 051 ；Z 24. 00 ;平均体积21. 29nm ;峰百分比100%磁铁矿含量(I.C. P. ) 0. 86%理论磁铁矿含量0. 88 %30 秒高热25. 8°C特定高热1% 29. 3°C实施例B-5将以下物质引入到配备有滴液漏斗、温度计、冷却器和氮气惰化系统的IOOOml烧瓶中试剂量(g)含量 DEG300.00>99% H2O1.50100%Fe金属3,00100%将温度设定在170°C一达到此温度就添加以下物质32% HCl0. 2532.00%保持在此温度持续5分钟，此后添加以下物质Fe (CH3COO) 3 溶液 60.00 g由于此添加，温度降低，使悬浮液返回到设定温度(170°C )，随后在搅拌下在恒温下放置40分钟后缓慢滴加以下物质(100g/h)Fe (CH3COO) 3 溶液 480.00 g且监测温度以确保其总是保持在168°C和172°C之间在完成添加时，将系统再次保持在170°C持续另外2小时，随后冷却至环境温度，此后将液相与金属铁残余物分离获得具有显著磁性的黑色溶液动态粒度分析PDI 0. 030 ；Z 23. 82 ;平均体积21. 43nm ;峰百分比100%磁铁矿含量(I.C. P. ) 1.07%理论磁铁矿含量1. 04% 30 秒高热31. 4°C特定高热1% 29. 35°C实施例B-6将以下物质引入到配备有滴液漏斗、温度计、冷却器和氮气惰化系统的IOOOml烧瓶中 试剂量(g)含量 DEG300.0099% H2O1.50100% Fe 金眞3.00100%将温度设定在170°C一达到此温度就添加以下物质32% HCl0.2532. 00%保持此温度持续5分钟，此时间后添加以下物质Fe (CH3COO) 3 溶液 60. OOg由于此添加，温度降低，使悬浮液返回到设定温度(170°C )随后在搅拌下在恒温下放置40分钟后缓慢滴加以下物质(50g/h)Fe (CH3COO) 3 溶液 540. OOg且监测温度以确保其总是保持在168°C和172°C之间在完成添加时，将系统再次保持在170°C持续另外2小时，随后冷却至环境温度，此后将液相与金属铁残余物分离获得具有显著磁性的黑色溶液动态粒度分析=PDI 0. 144 ；Z 47. 78 ;平均体积38. 67nm ;峰百分比100%磁铁矿含量(I.C. P. ) 1.07%理论磁铁矿含量1. 07%30 秒高热58. (TC特定高热1% 54. 20°C_9] C)磁铁矿在水中的增溶作用实施例C-I将300g的2%磷酸水溶液引入到500ml锥形瓶中，随后在搅拌下添加IOOg实施例B-6的溶液将溶液在搅拌下保持30分钟，允许倾析已形成的黑色絮凝物将沉淀物磁性分离并用软化水洗涤两次，每次将悬浮液在搅拌下保持20分钟，随后倾析并磁性分离由此获得的湿的固体用200g 0. 05M氢氧化铵处理并在搅拌下放置20分钟获得澄清的溶液，呈现与实施例B-6的产物相当的动态粒度分析产物可以在pH 7. 4-7. 8的磷酸盐-氨缓冲液中稀释D) 30秒高热和特定高热的测暈SAR的计算 为了测量高热数据，我们使用Ameritherm Inc.的固态感应加热设备(AmerithermInc. solid state induction heating equipment)，将磁场H0设定在2lKA/m(千安培/米)且将频率F设定在17KHz (千赫)温度升高测量在如所描述的各个实施例中获得的悬浮液的样品上的50mm直径的线圈的中心处(在环境温度下，约22°C )进行即将测试之前，测量样品的温度，随后激活装置持续30秒并测量相同样品的最终温度(30秒高热)对已知样品体积(0. 5ml)进行测量；由于不同样品中的磁性纳米微粒的浓度相似且假定高热效应和浓度之间线性相关，因此为了获得可比较的值，可以归一化在1%浓度(特定高热)下获得的值材料的高热效力(比吸收率-SAR)定义为样品所散逸的总热除以吸收剂相(absorbent phase)的总质量和照射时间