专利名称：一种载蛋白类药物磁性复合纳米材料的制备方法及其应用的制作方法磁性纳米材料因具有强磁性和低细胞毒性，在生物医学上有巨大的应用潜力，如在蛋白或细胞的纯化、药物或基因的投递、免疫检测和磁共振成像等方面都有广泛的应用。它具有集靶向治疗、成像、低细胞毒性等于一身的优势。无机材料存在分散性好、尺寸和形貌易控以及均一性好等在可控性上的优势，有机材料具有毒性小、体内可降解和易于多功能化等在应用性上的优势，因此结合两者的长处构建新的多功能磁性材料将弥补相互间的不足和拓展它们在生物医学上的应用。 肿瘤是威胁人类健康的主要疾病，目前主要治疗手段仍限于手术、放疗及化疗。随着现代分子生物学、分子遗传学及免疫学的迅速发展，人们对免疫系统的作用机制、肿瘤抗原及其相关基因，机体抗肿瘤效应，肿瘤逃逸机制等有了更深入的认识。人们对免疫系统能够识别并杀伤肿瘤已深信不疑，并做了许多应用免疫治疗肿瘤的尝试，取得了一些令人鼓舞的结果，其中细胞因子治疗是这个领域中的ー个重要组成部分。临床上常用治疗肿瘤的细胞因子包括干扰素(IFN)、白介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。其中白介素-2(IL-2)又称为T细胞生长因子，是调节机体免疫功能最主要的淋巴因子之一。它能促进T、B细胞活化、増殖和分化，还能活化NK细胞及单核-巨噬细胞，并增强NK细胞杀伤肿瘤的细胞毒作用。大剂量的IL-2诱导活化后的NK细胞称为LAK细胞，从而产生细胞毒作用。早在20世纪80年代IL-2或与LAK细胞联合应用就开始应用于临床，尤其在转移性肾癌中作用明显。⑶8+T细胞、⑶4+T细胞、单核-巨噬细胞受到IL-2的持续作用后，其抗原递呈能力、杀菌力、细胞毒性均明显增强，分泌某些细胞因子的能力也得到加强，使用IL-2治疗肿瘤取得了一定的疗效。但是这些用于治疗的细胞因子在体内半衰期短，需反复大剂量给药，系统性应用这些蛋白类细胞因子药物常常导致严重的毒副作用，例如IL-2可引起发热、呕吐等一般症状，还可导致水盐代谢紊乱和肾、肝、心、肺等功能异常，最常见、最严重的是毛细血管渗漏综合症，使患者不得不中止治疗，限制了细胞因子IL-2的广泛应用。为减轻IL-2的毒副作用，改全身用药为局部用药，起到了一定作用，但靶向作用不足。纳米技术应用于药物的缓释开辟了新的途径，探索ー种集多种功能于一身的纳米材料，即可缓释，又可靶向，将可克服目前的细胞因子治疗肿瘤时的因用量大带来的毒副作用，从而使细胞因子有效的发挥治疗肿瘤作用。
本发明的目的在于针对目前纳米材料应用上的単一化，提供一种制备多功能的载蛋白类药物(细胞因子)磁性复合纳米材料的方法，所制备的载药磁性复合纳米材料可以集磁靶向、缓控释和蛋白类药物治疗于一身。本发明的目的在于针对目前肿瘤治疗中存在的问题，如因靶向不好而产生的治疗效率低、毒副作用大，提出了ー种制备载蛋白类药物磁性复合纳米材料的制备方法，得到的载蛋白类药物磁性复合纳米材料可通过磁性靶向提高靶向和治疗效率，通过缓控释性能降低药物毒副作用，从而实现肿瘤的高效、低毒的治疗。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案ー种载蛋白类药物磁性复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤I)制备表面包覆油酸的Fe3O4磁性纳米颗粒，或者表面亲油的Y _Fe203、FePt、MgFe2O4^ MnFe2O4 或 CoFe2O4 磁性纳米颗粒；2)制备蛋白类药物的水溶性溶液； 3)配制聚乳酸/こ醇酸共聚物(PLGA)的ニ氯甲烷溶液，其中PLGA的浓度为5 200mg/ml ；4)将步骤I)制备的磁性纳米颗粒加入到步骤3)配制的PLGA ニ氯甲烷溶液中，混匀；5)将蛋白类药物的水溶性溶液与步骤4)制得的液体混匀，并在0°C下超声乳化；6)在步骤5)所得的乳化液中加入1-3倍体积的I %聚烯こ醇(PVA)，0°C下超声乳化，再将所得乳化液缓慢加到大量O. 1% PVA中以稳定乳化液，随后置于室温振荡以挥发ニ氯甲烷，最后4°C离心收集载药磁性复合纳米材料。上述步骤I)制备的磁性纳米颗粒的尺寸(粒径)优选为2 20nm，所述磁性纳米颗粒最常使用的是利用共沉淀方法合成的Fe3O4磁性纳米材料。通过Fe3+和Fe2+共沉淀方法得到Fe3O4颗粒是亲水性的，为了实现与PLGA的相互融合，需要将磁颗粒表面进行改性使其亲油，通过油酸对磁颗粒的表面包覆实现了磁颗粒的亲油性。上述步骤2)中所述蛋白类药物是水溶性的，通常是细胞因子，例如白介素-2，其浓度优选 100-200 μ g/ml。上述步骤3)配制的聚乳酸/こ醇酸共聚物(PLGA)的ニ氯甲烷溶液，PLGA浓度优选为 15 150mg/ml。上述步骤5)形成的混合液中磁性纳米颗粒的终浓度优选为O. 01 10mg/ml,更优选为O. 05 5mg/ml ;蛋白质药物的终浓度优选为10-20 μ g/ml。上述步骤5)利用超声乳化法将水溶性药物和脂溶性溶液混合，超声乳化的过程可以用带探头的细胞破碎仪在功率50-100W的情况下，冰浴条件下超声O. 5 Imin ；上述步骤6)采用超声乳化方法实现载蛋白类药物磁性纳米材料的制备，所使用的PVA是水溶性高分子聚合物，有较强的粘接性，并有分散成膜性，用于增强PLGA对水溶性蛋白类药物的包裏。步骤5)制备的乳化液(记作初乳)与1% PVA混合后超声乳化的过程可以用带探头的细胞破碎仪在功率IOOW的情况下，冰浴条件下超声O. 5 2min，得到复乳，其中初乳与1% PVA的体积比优选为I : (1-3)，更优选为I : 2。再将复乳缓慢加入O. 1% PVA中，复乳与O. 1% PVA的体积比优选为I : (30-40)，更优选为3 100。然后将溶液置于室温振荡过夜，挥发ニ氯甲烷，再9000-1200()rpm低温离心5 20min，收集携载了蛋白类药物的多功能磁性复合纳米材料。本发明通过超声乳化法制备出了多功能磁性复合纳米材料,该纳米材料中含有磁性纳米颗粒、PLGA和蛋白类药物(如细胞因子白介素-2)。所得到的多功能纳米材料单分散性较好，颗粒大小从几十纳米到几微米大小不等，粒径分布在200nm-2 μ m，平均粒径为697. 6±0. 51nm(參见图1，图2)。该多功能磁性复合纳米材料具有很好的磁性，能够对药物有很好的控制释放，在PH7. 4的磷酸盐缓冲溶液中能持续释放IL-2，第一天突释率为10%左右，5天以后释放量较恒定，15天内总共释放约13. 59% (參见图3)。本发明得到的多功能磁性复合材料其磁性強度可以通过加入磁颗粒的浓度来调节，在外加磁场的作用下可以实现对此纳米药物的定位进行控制。磁性纳米材料一般是通过Fe3+和Fe2+共沉淀方法得到Fe3O4颗粒，是亲水性的，为了实现与PLGA的相互融合，需要将磁颗粒表面进行改性使其亲油，通过油酸对磁颗粒的表面包覆实现了磁颗粒的亲油性。本发明得到的纳米材料产量、尺寸分布以及蛋白类药物的包封率和载药率与PLGA的用量有重要的关系。为了实现PLGA对磁颗粒和蛋白类药物的有效包覆，需要合适的PLGA用量。随着PLGA量的増加，包封率会提高。而为了提高载药率，PLGA与蛋白类药物需要一个合适的比例。由于PLGA对蛋白类药物的包裏，使得药物可以通过PLGA的链间缝隙或降解作用得到释放，从而可以有效的控制蛋白类药物的浓度，减少对体内的毒副作用。 在本发明的一些实施例中，所述多功能磁性复合材料包覆小鼠重组IL_2(通过基因工程方法人工合成的细胞因子)，得到的载IL-2磁性复合纳米材料，能够延长IL-2的半衰期，降低反复大剂量给药的频率，在体外磁场的作用下可达到靶向作用，降低了 IL-2对全身的毒副作用。实验证明，本发明得到的载IL-2磁性复合纳米材料，保持了其细胞因子IL-2的生物学活性，促进淋巴细胞増殖，从而实现机体抗肿瘤免疫作用。图I是实施例I制备的载IL-2磁性纳米粒的粒径图。图2是实施例I制备的载IL-2磁性纳米粒的两张扫描电镜图。图3是实施例I制备的载IL-2磁性纳米粒在pH7. 4PBS溶液中的缓释曲线图。图4显示了实施例I制备的载IL-2磁性纳米粒包裹的IL_2在体外刺激T淋巴细胞增殖的作用。图5显示了载IL-2磁性纳米粒(PLGA/IL_2/Fe304)注射至荷瘤小鼠肿瘤区，在体外磁场作用下，包裹的IL-2在体内吸引大量淋巴细胞包围及浸润至肿瘤区(A)，而不加磁场的情况下，肿瘤区内无淋巴细胞浸润(B)。图6显示了载IL-2磁性纳米粒注射至荷瘤小鼠肿瘤区，鉄染色见在体外磁场作用下，铁颗粒富集于肿瘤区(A)，而不加磁场组无铁颗粒沉积(B)。

5)将复乳缓慢加入IOOml O. I % PVA中，放入恒温磁力搅伴器上搅匀，室温放置摇床上过夜，让其挥发其残余有机溶剂；最后将乳液在低温离心机上离心15min(12000r/min,4°C )，用蒸馏水洗涤3適，上清液收集待测其包封率，沉淀为载药微球，用适量无菌水超声分散，放入4°C无菌保存。所制备的载IL-2磁性复合纳米材料(表示为PLGA/IL_2/Fe304)的粒径分布图如图I所示，扫描电镜图如图2所示。从图I和图2中可以看出，载IL-2磁性复合纳米材料的颗粒大小从几十纳米到几微米大小不等，粒径分布在200nm_2 μ m,平均粒径为697. 6±0. 51nm。图3是PLGA/IL-2/Fe304在pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液中的缓释曲线图，PLGA/IL-2/Fe3O4颗粒能持续释放IL-2，第一天突释率为10%左右，5天以后释放量较恒定，15天内总
共释放约13.59%。ニ、PLGA/IL_2/Fe304磁性复合纳米材料在体外刺激T淋巴细胞增殖取BALB/C小鼠的脾脏，剪碎，筛取细胞，Fecol离心，收集单个核细胞，体外1640培基培养，分组后，加入上述制备的PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米材料或单纯IL-2，于24，42，72小时分别取细胞，用MTT法检测细胞数，结果PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米材料及单纯的IL-2均有明显刺激淋巴细胞增殖的作用，但PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米材料作用稍低于单纯的IL-2，因为前者具有缓释的作用(见图4)。实施例2PLGA/IL_2/Fe304磁性复合纳米材料在体内刺激T淋巴细胞增殖取实施例I制备的PLGA/IL_2/Fe304磁性复合纳米材料进行如下实验，观察到PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米粒在体内刺激T淋巴细胞増殖，并聚集淋巴细胞于肿瘤区，增强了其攻击肿瘤的作用。BALB/C小鼠皮下接种S180肉瘤细胞5X 104，待肿瘤长至绿豆大，瘤内及瘤周注射PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米材料，其中IL-2为2万单位，给药后ー组加体外磁场固定于瘤上，磁力为4.0tesla，共24小吋。对照组只给药，不加磁场，另设不给药组(生理盐水注射)，单纯给IL-2组及只给PLGA/Fe304组，给药后观察肿瘤生长情況，小鼠死亡或于20天后活杀，取肿瘤及肝、脾、肾脏器，进行病理观察。结果PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米粒注射入小鼠肿瘤后，在体外磁场作用下，淋巴细胞包围及浸润至肿瘤区，表明IL-2浓集于肿瘤区，IL-2释放后促淋巴细胞増殖，从而加强杀伤肿瘤作用，用吋，IL-2释放，导致脾脏増大，为对照组的I. 5倍(见图5)。实施例3PLGA/IL_2/Fe304磁性复合纳米材料在体外磁场的作用下，药物富集于肿瘤区取实施例I制备的PLGA/IL_2/Fe304磁性复合纳米材料进行如下实验，可以看到在体外磁场的作用下，PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米粒富集于肿瘤区。BALB/C小鼠皮下接种S180肉瘤细胞5X 104，待肿瘤长至绿豆大，瘤内及瘤周注射PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米材料，其中IL-2为2万单位，给药后ー组加体外磁场固定于瘤上，磁力为4.0tesla，共24小吋。对照组只给药，不加磁场，另设不给药组(生理盐水注射)，单纯给IL-2组及只给PLGA/Fe304组，给药后观察肿瘤生长情況，小鼠死亡或于25天后活杀，取肿瘤及肝、脾、肾脏器，进行病理及鉄染色观察。结果PLGA/IL-2/Fe304磁性复合纳米粒注射入小鼠肿瘤后，在体外磁场作用下可使药物浓集于肿瘤区，鉄染色见铁颗粒富集于肿瘤区,而不加磁场的PLGA/IL-2/Fe304组及PLGA/Fe304组均无铁颗粒沉积(见图6)。虽然，说明书通过一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本 发明基础上，可以对之作ー些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。


本发明公开了一种载蛋白类药物磁性复合纳米材料的制备方法及其应用。将表面亲油的磁性纳米颗粒和水溶性蛋白类药物加入到聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)的二氯甲烷溶液中混合，并0℃下超声乳化成初乳，再将初乳与1％聚烯乙醇混合并0℃下超声乳化成复乳，最后在聚烯乙醇的稳定作用下挥发除去二氯甲烷，4℃离心收集得到载蛋白类药物磁性复合纳米材料。实验证明，该方法制备的载白介素-2磁性复合纳米材料在体外磁场作用下可使药物浓集于肿瘤区，白介素-2在一段时间内慢慢释放，并活化T细胞、NK细胞等免疫细胞，进而杀伤肿瘤细胞。