专利名称：用于治疗组织缺血性疾病的干细胞制剂及其制备方法 众所周知，动脉硬化性血管闭塞以及血栓性缺血性疾病是当代社会的常见病、难治病。目前对这类疾病一般采用药物治疗、血管搭桥和介入手术等常规治疗方法。药物治疗疗效不理想，血管搭桥和介入手术虽然早期效果较好，但晚期效果不显著，因此致残致死率高。近年来，关于干细胞制剂的研究不断深入，干细胞制剂对某些疾病的独特疗效逐步受到重视。干细胞是人体各种组织器官的起源细胞，具有自我复制和多向分化的特征。在正常生殖生理过程中，干细胞由受精卵分化而来。受精卵最初发育形成原始胚胎干细胞，后者具有形成完整个体的全部潜能。原始胚胎干细胞进一步分化增殖形成囊胚样结构，其内层细胞群的细胞也称胚胎干细胞。囊胚内层的单个胚胎干细胞不能形成一个完整的个体，但具有形成人体各种组织的全能性。囊胚胚胎干细胞继续分化发育，逐步形成胎儿各器官的功能执行细胞，同时在机体部分组织特别是造血组织，包括连接胎儿和母体的胎盘脐带血、骨髓、外周血、肝和脾中保留有不同分化潜能的干细胞。在整个胎儿发育到成年这个漫长而复杂的过程中，干细胞逐级丧失其全能性，形成亚全能、多能干细胞和组织专能干细胞，后者按分化功能分别称造血干细胞、血管干细胞、皮肤干细胞，等等。由于人脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，目前利用此类干细胞移植治疗白血病、遗传性血液病、严重免疫缺陷性疾病、急性放射损伤等疾病在技术上趋于成熟，已经治愈十多万患者。但是，目前对人脐带血、外周血和骨髓中的干细胞移植后能否在体内分化参与形成新的血管、使组织缺血得到改善的问题还不清楚，国内外尚无应用脐带血CD144+细胞衍生的内皮祖细胞移植治疗缺血性疾病和用干细胞制剂促进血管新生治疗缺血性疾病的先例。因此，开发用于治疗组织缺血性疾病的干细胞制剂及其制备方法具有特别重要的临床意义。
本发明所要解决的技术问题是，克服上述动脉硬化性血管闭塞以及血栓性缺血性疾病常规治疗方法的缺点，提供一种新型的用于治疗组织缺血性疾病的干细胞制剂及其制备方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是本发明干细胞制剂可以是从外周血分离提取的单个核细胞；或从胎盘及脐带血中分离提取的CD133+细胞；或从其它人体组织分离提取的单个核细胞和CD133+细胞；或CD133+细胞衍生的血管内皮祖细胞；所述的干细胞制剂呈梭形贴壁生长、能与造血细胞形成血岛样结构，表达内皮细胞的特异标记包括VEGFR-2、VE-cadherin、vWF、CD31、结合UEA-1，体内移植后定向整合到缺血部位。本发明干细胞制剂的制备方法是 1.所述的从外周血分离提取的单个核细胞干细胞制剂的制备方法包括以下步骤rhG-CSF皮下注射进行外周血干细胞的动员；FACS监测外周血CD34阳性细胞数；五天后用血细胞分离机采集和分离单个核细胞；最后纯化、浓缩成单个核细胞混悬液，部分供移植用；富余部分贮存于液氮中供多次使用。外周血单个核细胞制剂的临床使用方法是进行单个核细胞混悬液的双下肢(细胞数各3×109)局部肌肉内注射。每间隔44天左右，进行冻存干细胞复苏，采用相同方法和细胞数再次进行单个核细胞混悬液的局部肌肉内注射。
2.所述的从胎盘及脐带血中分离提取的CD133+细胞干细胞制剂的制备方法包括以下步骤取正常的脐带血；采用磁珠亲和柱(MACS)分离法分离CD133+细胞；利用流式细胞仪(FACS)检测CD133+细胞纯度；移植前用无菌的细胞培养液稀释细胞至每毫升含2.5×106个CD133+细胞备用。
3.上述的CD133+细胞进一步用来制备血管内皮祖细胞，制备方法包括以下步骤用CD133+分离试剂盒从脐血或骨髓中分离CD133+细胞；接种于包被4μg/cm2纤连蛋白(Fibronectin)的T25培养瓶中；在添加了50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF，)，20ng/ml白介素3(IL-3)和50ng/ml干细胞生长因子(SCF)的M199+10％FCS体系中培养7到10天，其梭形贴壁细胞为内皮祖细胞。通过静脉输注扩增后的贴壁内皮祖细胞，用来治疗缺血性疾病。
本发明的有益效果是1.按照本发明提供的制备技术，可以将干细胞从自体或他人的胎盘脐带血、外周血、骨髓等造血组织中分离出来，制备成单个核细胞、CD133阳性细胞和内皮祖细胞，以便进一步制备适宜的干细胞制剂；2.按照本发明制备技术制备的干细胞制剂可以通过病变局部或静脉全身移植治疗脑血管、心血管和周围血管闭塞性疾病；4.按照本发明制备技术制备的干细胞可以用作基因治疗载体，转染促血管新生基因后直接移植到缺血组织，进行基因治疗，治疗多种脑血管、心血管和周围血管闭塞性或基因缺陷性疾病。


图1为对小鼠移植CD133+细胞衍生的血管内皮祖干细胞制剂的试验中移植后的组织分析图。

下面结合附图和
对本发明作进一步详细说明实施方式1从外周血分离提取的单个核细胞干细胞制剂的制备方法是用重组人造血生长因子国产金磊赛强(rhG-CSF)300单位给患者皮下注射Bid，进行外周血干细胞的动员；采用FACS CD45射门CD45/CD34双荧光标记法，监测外周血CD34阳性细胞数；第五天用COBE Spectra Version 4血细胞分离机单独采集和分离单个核细胞；然后纯化、浓缩成单个核细胞混悬液供移植用；根据细胞数将多余的细胞按每袋3×109细胞数，严格按干细胞低温保存步骤，贮存于液氮中供多次使用。
临床使用方法移植和过程均在无菌手术室，严格无菌操作。进行单个核细胞混悬液的双下肢(细胞数各3×109)局部肌肉内注射。每间隔44天左右，进行冻存干细胞复苏，采用相同方法和细胞数再次进行单个核细胞混悬液的局部肌肉内注射。
实施方式2从胎盘及脐带血中分离提取的CD133+细胞制剂的制备方法是取正常分娩的脐带血，用CD133+磁珠分离试剂盒(MACS，Miltenyi Biotec公司，Germany)免疫磁珠细胞分选从脐血中分离CD133+细胞，分离的CD133+细胞置细胞培养液中备用。
实施方式3CD133+细胞衍生的血管内皮干细胞制剂的制备方法是采用磁珠亲和柱(MACS)分离法分离CD133+细胞，接种于包被4μg/cm2纤连蛋白(Fibronectin，Calbiochem公司)的T25培养瓶中；在添加了50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF，Pepro Tech，UK)，20ng/ml白介素3(IL-3，Kirin，Japan)和50ng/ml干细胞生长因子(SCF，Kirin)的M199(Gibco公司)+10％FBS(Hyclone公司)体系中培养2-4周，每周换液两次；培养4-7天后可见细胞团和梭形贴壁细胞。
临床应用实例利用外周血干细胞制剂移植治疗动脉硬化性下肢闭塞症1).患者蔡某某，男，48岁，体重87公斤，病程2年，有脑梗塞病史2年。按诊断标准确诊动脉硬化性下肢闭塞症，左下肢尤其严重。治疗前患者双足色泽紫暗，疼痛、冷感、间歇性跛行，尤以左足趾明显。左足第一、二、三、四趾间和右足第三趾间皮肤溃疡，以左足第二趾间溃疡为严重，深达肌键。研究以三个月为一观察期，分阶段进行综合评估、统计分折。
2).外周血干细胞的制备、移植方法和过程按实施方式1所述的制备方法进行了二次干细胞移植。
3).并发症的防治动员过程中为避免因白细胞增多或高凝状态导致急性动脉血栓形成或心脑血管意外，用肝素钙10000单位加入250ml生理盐水静脉点滴，每日一次，共5天。细胞注射后，为预防感染，予青霉素400万单位加入生理盐水100ml中静脉点滴Bid。
4).患者主要临床症状体征的评分标准a.疼痛0分无疼痛；1分偶有疼痛，被问时能回忆起；2分疼痛经常出现但能耐受，不用或偶用一般止痛剂；3分经常用一般止痛剂；4分因疼痛影响睡眠，一般止痛剂难以缓解。
b.患肢冷感0分无冷感；1分患者偶述受累肢体有发凉、怕冷的感觉；2分经常述受累肢体有发凉、怕冷的感觉；3分受累肢体有明显的冷、凉感觉，需采用局部保温措施，症状能得到一定程度的缓解；4分受累肢体有明显的冷、凉感觉，采用局部保温措施，症状亦无明显改善。
c.下肢间歇性跛行按正常速度(60-70米/分)步行，以米为单位，四舍五入。0分行走≥500米，无疼痛；1分行走400-499米，有疼痛；2分行走300-399米，有疼痛；3分行走100-299米，有疼痛；4分静息痛，无法行走或行走＜100米，有疼痛。
5).检查指标在北京301医院做激光多谱勒扫描检查，观察双下肢皮肤血流灌注的改变情况。用美国产Medacord PVL肢体血流仪检测双下肢末稍血流和ABI的改变。用天津市交通电子仪表实验厂生产的SDW数字点温仪测双下肢皮温改变(室温21℃)。数字减影动脉血管造影观察侧支血管形成数量，新生侧支血管评估分4级0(无新生侧支血管)；+1(少许新生侧支血管)；+2(中量新生侧支血管)；+3(丰富新生侧支血管)。
6).不良反应观察观察有无异常症状体征出现；观察血尿便三大常规、肝肾功能、出凝血时间的改变。
7).统计学处理均采用t检验。
8).结果(1).症状体征移植后疼痛、冷感、间歇性跛行有显著好转，其中以疼痛缓解最快。
1.2色泽移植前双足色泽紫暗，尤以左足响明显。移植后双足色泽逐渐好转，1个月后右足色泽正常，3个月后左足色泽接近正常。
1.3溃疡移植前左足第一、二、三、四趾间和右足第三趾间皮肤溃疡，以左足第二趾间第二趾溃疡为严重，深达肌键，半边足趾均为皮损区，有少许分泌物。移植后第二周右足溃疡愈合，左足溃疡逐渐有好转。移植后1月，左足一、四趾间溃疡愈合。移植后3月左足四趾间溃疡愈合，左足第二趾外侧干燥结痂近愈。
(2).皮温移植前后双下肢各选足背第三趾根后1cm(DF)、小腿外侧踝上5cm(LL)、小腿内侧踝上5cm三个点测皮温，结果以左足背上升明显，其它部位也有不同程度上升。
(3).PVL末稍血流和ABI移植后1月和移植后2月双足10趾血流波幅均值(单位毫米)与移植前相比均有显著性增加(p＜0.01)。移植后LABI由0.49上升至0.5；RABI由0.69上升至0.85。
(4).激光多谱勒扫描选择双下肢各4个具有代表性的区域进行激光多谱勒扫描测定血流灌注量，结果移植后1个月8个区域的血流灌注量均值有显著性增加(p＜0.01)。
(5).CD34阳性细胞数检测和外周血象外周血CD34阳性细胞数动员前为0.18％；动员后第五天即单采干细胞前为0.75％。外周血白细胞动员前为7.88×109/L；动员后第五天即单采干细胞前为35.11×109/L，其中中幼粒2％，晚幼粒1％，中性粒细胞75％，淋巴细胞14％，单核细胞6％，嗜酸2％。单采出的PB-MNCs中，中幼粒6％，晚幼粒1％，中性粒细胞74％，淋巴细胞14％，单核细胞6％。
(6).动脉造影患者移植前和第一次移植后3个月做双下肢数字减影血管造影，介入导管的位置、造影剂的使用方法相同。评分结果为+3。
(7).相关并发症和不良反应移植后无异常症状体征出现；外周血象恢复正常；心电图和肝肾功能无特殊改变。出凝血时间正常。
通过对ABI、PVL末稍血流、LDP扫描血流灌注量、间歇性跛行和动脉造影等指标显著改善的综合评估，证明采用动员后的自体周血干细胞制剂移植刺激血管新生，有效地增加动脉硬化性下肢闭塞症患者的下肢血流。移植后患者疼痛得到了快速而显著改善，溃疡也逐渐愈合，最终成功地挽救了患肢。移植后未出现相关并发症和不良反应，表明该细胞制剂不仅仅有效，而且安全。有关动员后的自体周血干细胞制剂移植有效治疗动脉硬化性下肢闭塞症，目前尚未见有报道。
动物试验实例对小鼠移植CD133+细胞衍生的血管内皮祖干细胞制剂的试验1).按照实施方式3所述的制备方法制备CD133+细胞衍生的血管内皮祖细胞干细胞制剂备用。
2).小鼠单侧后肢缺血模型的建立及细胞移植将BALB/c无胸腺裸鼠(雄性，8-9周，16.5-21g，中国医学科学院实验动物研究所)饲养于SPF级层流架中；在无菌超净台中用2％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉，沿左侧腹股沟中点至膝内侧作约2.5cm长的切口，钝性分离皮下组织，暴露股神经血管鞘及其分支，解剖显微镜下分离出股动脉及大隐动脉、旋髂外动静脉及股动静脉肌支，分别用3/0号线结扎后切断；手术后第二日，用0.1％胰酶/EDTA消化CD133+细胞诱导出的贴壁内皮祖细胞及常规培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)，离心后重悬于M199中，调整浓度为5×105/200μl；手术后将裸鼠随机分为三组，分别对每只小鼠通过尾静脉输注5×105扩增后的贴壁内皮祖细胞(n＝12)、5×105HUVEC(n＝10)或200μl M199(n＝10)；为跟踪注射入体内的细胞去向，内皮祖细胞组及HUVEC组各取3只小鼠，其移植细胞先用碳花青荧光染料CM-DiI(Molecular Probes公司)标记，即细胞在贴壁状态下2μg/ml CM-DiI PBS溶液中，37℃下孵育5分钟，4℃下孵育15分钟，PBS洗两遍后，胰酶/EDTA消化。
2).小鼠缺血后肢血流恢复的监测手术后第2天和14天，各组动物麻醉后用激光多普勒血流成像仪(Laser Doppler PerfusionImaginer，LDPI，Lisca公司，Sweden)扫描其双下肢。LDPI利用激光探测皮肤下血管中血细胞运动产生的多普勒效应工作，再将其转化为电流值表示，并对应于不同的颜色红色表示最大血流灌流量，而深蓝色则相反。为消除环境中光线和温度的影响，以手术肢/未手术肢血流的比值作为血流灌流恢复的指标。
3).肌肉标本的免疫化学染色在手术后第4天、7天、14天、21天，每组各取2～4只裸鼠处死后，取双后肢小腿腓肠肌(垂直于肌肉纤维垂走向作切面)，10％甲醛固定24小时后，常规石蜡切片。用大鼠抗小鼠CD31(1∶200，BD PharMingen)作一抗，按碱性磷酸酶组化试剂盒(迈星公司)说明用1％固红显色，2％苏木精复染胞核。在光学显微镜下，每张切片计数10个×200倍视野内的肌纤维束间的红色管状染色区表示每mm2的毛细血管数。
4).统计学分析所有计量型资料以均值±标准误表示，组间统计处理用不配对t检验或ANOVA分析，计数型资料用Fisher’s精确概率检验分析。
5).结果a.脐血CD133+细胞体外诱导后的表型脐血CD133+细胞体外培养4天后，纤连蛋白层上出现细胞团，并有梭形贴壁细胞从其边缘不断生成，至10～14天时可达到60％汇合。这种中心为圆形细胞周围为梭形细胞的细胞团与胚胎发育早期的造血岛(中心是圆形的造血干细胞，而周边的细胞则分化为伸展的血管内皮祖细胞)结构相似。7天左右可见内皮细胞特征样网状、索条状结构。贴壁细胞消化后流式检测，发现这些细胞不同程度上表达内皮细胞特异性抗原VEGFR-2(33.5±4.1％)，VE-cadherin(39.1±2.4％)，vWF(44.2±2.7％)，CD31(80.4±3.4％)，71.0±4.2％可结合UEA-1，而CD133则转为阴性。而对照HUVEC的表达水平相似VEGFR-2(60.2±5.1％)，VE-cadherin(85.3±6.1％)，vWF(78.4±5.1％)，CD31(73.4±5.6％)。这表明诱导出的梭形贴壁细胞是分化中的内皮祖细胞。
b.移植后的组织分析移植标记细胞的单侧后肢缺血手术后小鼠的冰冻组织切片在荧光显微镜下观察，发现内皮祖细胞组缺血后肢肌肉中有分散不均的能激发出红色(代表CM-Dil)和绿色(代表FITC-UEA-1)双荧光的细胞。这说明移植的内皮祖细胞定向整合到了缺血局部。而除脾中表现少量双色荧光外，其它脏器包括对侧未手术肢，未见双色荧光。如图1所示，HUVEC组各部位未见明显双色荧光。CD31组化染色可见内皮祖细胞组的缺血手术侧腓肠肌中的毛细血管密度，较HUVEC组、M199组增加，说明内皮祖细胞组的血管重建过程增强(7天，14天，21天，P＜0.05)。
c.移植内皮祖细胞后缺血肢体血流的恢复LDPI检测皮下血流速度，是反映肢体血流灌注的一个客观指标。缺血手术后第二日，实验组和对照组小鼠的左侧后肢血流都明显降低，缺血肢/正常肢的血流比为19.1％±3.1％。但内皮祖细胞组的缺血肢体血流恢复明显较HUVEC组、M199组改善手术后2周，内皮祖细胞组的血流比为77.3％±5.6％。而HUVEC组、M199组的血流比仅分别恢复为47.5±2.6％、40.6％±3.4％(P＜0.05)。
d.移植内皮祖细胞后缺血肢体的存活内皮祖细胞的移植极大地改善了缺血肢体的恢复。对照组M199组中仅有1只完全恢复。4只足部坏死，5只出现自小腿的自动脱落。而在内皮祖细胞组，有7只未见明显坏死，4只足部坏死，仅1只出现肢体脱落，两组间有统计学差异(P＜0.05)。而HUVEC组的坏死情况介于两者之间。
上述动物试验证明在体外培养诱导部分脐血CD133+细胞成为内皮祖细胞，体内在小鼠单侧后肢缺血模型上利用荧光标记细胞示踪、毛细血管密度检测、LDPI扫描血流灌注量，发现采用脐血CD133+细胞来源的内皮祖细胞制剂移植刺激血管新生，有效地增加缺血肢的血流。移植后缺血肢坏死程度减轻，最终提高了缺血肢体的挽救率，表明该细胞制剂的移植是有效的。这是首次发现脐血CD133+细胞衍生的内皮祖细胞体内移植后可促进血管重建过程。


本发明公开了一种用于治疗组织缺血性疾病的干细胞制剂及其制备方法，该干细胞制剂包括从外周血分离提取的单个核细胞；或从胎盘及脐带血中分离提取的CD133+细胞；或从其它人体组织分离提取的单个核细胞和CD133+细胞；或CD133+细胞衍生的血管内皮祖细胞；其制备方法包括干细胞的分离纯化、培养和细胞悬液等步骤。其有益效果是该干细胞制剂对脑血管、心血管和周围血管闭塞性和相应基因缺陷性疾病疗效高、无毒副作用；其制备方法简便易行、经济实用。