专利名称：纳米磷灰石晶体复合组织工程支架材料的制备方法 组织工程关键技术之一是支架材料的研究和制备。自然骨是由纳米磷灰石和高分子胶原纤维构成的无机/有机复合材料，具有良好的力学性能。基于仿生的概念，人们希望能制备出一种机械强度和韧性良好，而且在弹性模量方面接近自然骨的生物活性材料。作为细胞外基质的组织工程支架材料，其必须具备良好的机械强度，单一材料很难满足骨组织工程细胞支架材料的要求。如在组织工程支架材料中，已有采用的生物陶瓷支架如羟基磷灰石(hydroxyapaite，HA)、双相磷酸钙陶瓷和生物活性玻璃等。钙-磷材料由于是构成人体硬组织无机质的主要成分，与人体组织有天然的亲和性，能和人体的软、硬组织形成牢固的生物键合。钙-磷生物活性陶瓷曾以块状和颗粒形式在临床广泛地用于肌肉-骨骼系统修复和重建。但块状陶瓷的脆性大，加工难，易断裂；颗粒陶瓷则有游走、移位的缺点。这些都限制了它们作为骨组织工程支架材料的应用。作为硬组织修复材料的主体，复合生物材料受到广泛重视，它具有强度高、韧性好特点，通过具有不同性能材料的复合，可以达到“取长补短”的效果，可以有效解决材料的强度、韧性及生物相容性问题。如将韧性好和较接近人骨弹性模量的聚合物有机材料和有生物活性无机材料通过合适的方法复合，模拟天然骨组成成份构建新型的组织工程支架材料。钙-磷材料的生物活性好，能与骨组织形成牢固的键合，但材料脆性大、抗折强度低及成型困难。聚酰胺由于和人体的胶原蛋白在分子结构上十分相似，所以和人体组织有良好的相容性，是一类优良的医用高分子材料，且具有较高的韧性和强度，在临床有广泛而长期的应用，其主链上含有许多重复的极性基团，和极性无机材料相容性好，可用来提高羟基磷灰石的韧性。为了提高钙-磷材料的柔韧性和可加工性，模仿天然骨的组成结构特点，把HA与既有强度又有韧性的医用聚酰胺等高分子材料复合，特别是采用纳米磷灰石与高分子成分复合，使磷灰石以纳米级颗粒分散于高分子基体中，有利于提高HA在复合材料中的含量和更优良的分散效果，并可将二者性能充分结合起来，从而得到力学性能好，弹性模量与人骨接近且有好的生物相容性和生物活性的骨修复和重建支架材料。因为，虽然羟基磷灰石在复合材料的含量越高，复合材料的生物活性越好，但羟基磷灰石在复合材料中的含量与其颗粒大小有关，作为又与复合材料两相之间的界面结合状况有关颗粒大、含量越高，其力学性能就会下降。以往研究的HA与高分子复合材料由于作为填充体的HA粉体与高分子两者的界面结合力较弱，在应用时其复合界面处首先遭到破坏，从而导致该复合材料机械强度丧失过快。因此，提高HA与高分子之间的界面相容性和分散性就成为制备性能优异的HA/高分子材料的关键技术。采用纳米羟基磷灰石是制备具有生物活性和力学性能良好的无机/有机复合组织工程支架材料的一个很好方法，也是近年来骨组织工程技术研究的热点。组织工程材料的目的是为构建组织的细胞提供一个三维支架，为细胞生长提供合适的环境，用于引导种植的细胞或迁移到支架周围的细胞生长或增殖。因此其首先应是能使细胞粘附、分化、增殖或迁移的底物。支架材料又是细胞附着的基本框架和代谢场所，为新生组织提供支架，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性；支架在组织工程中不仅起支撑作用，保持原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增殖的场所，让细胞在基质中粘附和适度生长，并诱导细胞正常形态和功能的表达，引导受损组织的再生，让基质具有合适的机械强度以支撑组织或传递应力，以便细胞能按照预先设计在三维形状支架上生长。因此作为支架材料的基本要求是要具有多孔性和高强度。其中的多孔性是非常重要的，因为它能使细胞迁移或增殖。孔径大小影响细胞的长入和支架的内表面积。具有较大内表面积的支架可为培养更多细胞的种植、生长以及分泌细胞外基质的足够空间，为再生器官提供足够数量的细胞，提供给细胞生长所必须的气体和养分交换环境，有助于种植细胞的营养交换和废物排出。孔径大小已被证明是影响纤维血管组织内生的重要参数。孔径大小对于新生骨组织长入载体有着重要影响，合适的孔径为200～400微米。大孔壁上富含微孔的多孔支架材料可吸附细胞因子、生长因子、蛋白质等有利组织生长的诱导因子。如何制备既具有良好的生物学功能，又要满足力学性能的高强度要求的支架材料，是目前组织工程研究的重点方向。
针对上述情况，本发明将提供一种制备多孔型的纳米磷灰石晶体复合组织工程支架材料的方法，能得到既具有良好的生物学功能，又要满足力学性能的高强度要求的多孔型组织工程支架材料。本发明的纳米磷灰石晶体复合组织工程支架材料的制备方法，是将以摩尔比为(0.25～1.5)/1的纳米羟基磷灰石和医用聚酰胺成分组成的复合物，与在分解温度下可产生气体的发泡剂成分均匀混合，其中发泡剂成分为总重量的2％-5％，其分解温度应低于且靠近所用聚酰胺成分的熔融温度，在使该混合物料处于熔融状态的温度条件和30～50Mpa的压力条件下，将该熔融态混合物料以注塑方式充注于能使支架材料成型的装置中，由发泡剂成分在熔融态物料的注塑和成型过程中分解产生的气泡形成占位孔隙，最后去除已成型支架材料的孔隙封闭结构的表层。
在上述的制备方法中，纳米羟基磷灰石、医用聚酰胺成分及其复合材料，均可以采用目前已有报导的方法制备得到。
由于本发明在制备具有多孔结构的纳米磷灰石晶体/聚酰胺成分复合组织工程支架材料时，是利用发泡剂成分在使复合材料处于熔融状态的温度下分解所产生的气体——如在加热时能分解产生氮气、氨气或二氧化碳气体中的至少一种，在熔体物料中形成占位性的空隙结构，因此熔融注塑的加工温度一般不必过高，以能使复合物料能保持为注塑加工所需的基本熔融流动状态即可。发泡剂的选择，可以根据复合物中所选用聚酰胺成分的特性选用。实验结果显示，所选用的发泡剂以使其分解温度与复合物所用聚酰胺成分的熔融加工温度相适应，即其分解温度以接近且略低于该熔融加工温度为宜。因为，优良的均质复合物发泡制品，应该是使发泡剂分解产生的气体所形成的空隙能以均匀状态存在于制品中。为此，在注塑定型的加工过程中，应该使发泡剂分解产生的气体能够尽量地在含有聚酰胺成分的熔融态物料中以适当的速度均匀扩散。如果熔融加工温度过高和/或发泡剂的分解温度低于熔融加工温度过多，则熔融粘度过低和/或发袍剂分解形成较多孔径不均气泡增长速度快，且泡孔易于被气压冲破，使气体逃逸，造成泡孔塌陷。若熔融加工的温度偏低和/或发泡剂的分解温度与熔融加工温度的温差过小，则熔体的粘度增高，其应力松弛较慢，使发泡剂分解产生的气泡在熔体中扩散系数降低，和/或使发泡剂分解不充分导致气泡形成较少，气泡增长慢，且随着加工过程中的温度降低，熔体粘度相应增大，气泡在熔料流中释放变慢，显著影响气泡在材料体中的分散和分布的均匀性。磷灰石和聚酰胺类成分复合材料一般情况下的加工温度260℃～290℃，因此所用发泡剂成分的分解温度，以比所用聚酰胺成分熔融温度低10℃～30℃即可。
例如，可以作为参考实施例之一的，是复合物中的医用聚酰胺成分采用熔点为260℃～270℃的聚酰胺66(PA66)，熔融注塑的加工温度可为260℃～290℃，选用在250℃～270℃温度时能分解产生氮气和氨气的三肼基三嗪为发泡剂。其它情况下也可选用如分解温度为240℃～260℃的偶氮二羧酸钡等常用聚酰胺发泡剂。
发泡剂成分的用量对在制备的支架材料中孔隙的数量及孔径大小有影响。随着发泡剂用量的减少，可使材料中的孔隙孔径增大。这是因为发泡剂用量减少导致气体量减少，气体在高聚物熔体中扩散速度降低，作用于单个气泡腔壁的时间增大。这将使气泡腔室扩大，腔壁变得更薄。实验结果显示，发泡剂的用量控制在上述的2％-5％范围内是适宜的。
对注塑时的操作压力与支架材料中的孔隙孔径关系的实验研究表明注塑操作的压力高，带有应力的熔体经过流道向前流动时，气泡形成的量多，然后在成型装置容腔内熔体应力开始松弛，气泡逸出，所形成的气泡孔径小，且孔隙率多，分散均匀度好，且孔隙的孔壁厚。一般以控制在30～50Mpa的压力下进行注塑操作是适宜的。
发泡过程的时间也将影响所形成孔隙的孔径发泡时间长，孔隙率减少，产生的气体多，且孔径大。一般可以采用以1～2秒的快速充注方式进行注塑，注塑时的充注速度为110％～120％，使受压熔料以极短时间注入成型装置容腔。为便于熔体物料在注塑和成型过程中因发泡产生气泡的体积膨胀，并有利于对其泡孔的孔径进行控制，以使向支架材料成型装置中对物料注塑的充注量为该成型装置容腔容积的75％～85％为好，使熔熔融物料被快速注入成型装置容腔后，由发泡剂开始发泡膨胀而将容腔充满。
当熔融态的物料体被充注到能使支架材料成型的模具等成型装置的容腔中后，若该成型装置的温度与熔体温度的温差过大，则易使与成型装置接触的熔体温度过快降低，粘度迅速增加，抑制了气泡的形成，致使在靠近外周部分的气泡孔隙很少；而在远离模腔壁的芯部却是相反的情况，那里的气泡容易形成和增长，从而使成型装置容腔中心部位的气泡孔隙多。为此，在上述制备方法中，较佳的方式是使注塑时所用的能使支架材料成型的装置应预热至130℃～150℃，以免因模具的温度而对泡孔孔径的大小及其分布造成不利影响。但注塑时使成型装置的温度过高也将会增长冷却时间。
根据上述的影响因素，为使所制备的上述多孔型复合组织工程支架材料具有更为满意的综合性能，在上述的制备方法中，可以通过对上述各项因素的改变和调整，将熔融态物料的注塑和成型过程中由发泡剂成分分解产生的气泡所形成的孔隙孔径控制为1～500微米，且孔隙间相互贯通，材料中的孔隙率为40％-70％。
通过上述内容可以理解，本发明上述制备方法的显著优点之一，就是可不受所制备的支架材料的厚度的限制，因而特别适于制备尺寸较大的材料。
本发明上述方法制备的多孔型复合支架材料的另一个有意义的应用，是利用其孔隙与其它材料进一步复合，以制备具有新功能的骨修复材料。例如其可以与生物活性大分子复合而形成骨修复材料，如制备多孔生物陶瓷与骨形成蛋白(BMP)的复合体，以达到加速骨组织生长的目的；其也可以同某些药物相复合，制成一种在人体中逐渐扩散药物的药物缓释载体。
根据上述内容，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，根据本领域的普通技术知识和惯用手段，对其内容还可以有多种形式的修改、替换或变更。
以下结合由附图所示实施例的
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为下述的实例是对本发明主题所涉及范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。


图1是以本发明方法制备的复合组织工程支架材料的整体结构形式照片图2是显示图1所示材料多孔微观结构的扫描电镜照片
纳米磷灰石晶体/聚酰胺66复合材料的制备将164克分析纯硝酸钙和98.4克磷酸钠加入到3000ml带有分水装置、搅拌装置和冷凝装置的三颈瓶内，然后加入1500ml N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)。温度逐步升至140℃，加入55克聚酰胺66(分子量为23000，Asahi Chemical Industry公司提供)，并在140℃保持4小时。直到聚酰胺66全部溶解，冷却至室温，将混合物在不断搅拌状态下缓慢地滴入装有去离子水的不锈钢锅中，加热，使混合物的温度逐步升至70℃，保温2个小时，然后冷却至室温，陈化24小时。产物用去离子水洗涤3次，倒入烧杯中，使温度上升至95℃-100℃，保温3小时；进行水热处理，水热处理完成后冷却至室温，离心过虑，将得到的产物在80-100℃干燥24小时，磨细，过200目筛，得到纳米磷灰石晶体/聚酰胺66的复合材料粉末，其中纳米磷灰石中的钙/磷摩尔比为1.60～1.67。
多孔型复合材料的组织工程支架材料的制备选用在加热分解时能产生气体N2和NH3的上述三肼基三嗪(THT)作为发泡剂成分。
将均经过真空干燥处理的上述制备的纳米磷灰石晶体/聚酰胺66的复合物粉料和占总重量2％的发泡剂均匀混合后，加入到注塑机中，在260℃-270℃的温度和35Mpa的压力条件下，以螺杆推进速度为110～120％在1～2秒向以预热至130℃～150℃的成型模具中充注熔融状的复合物料充注量为模具容腔容积的75％～85％，发泡成型。注塑后将成型的支架材料体从模具中取出。由于其内表面是闭孔的，内部则为多孔型的结构，故需削去外层的闭孔表面，即得到可供使用的多孔型复合组织工程支架材料体。图1照片所示的是其中的一种结构形式。
对上述材料体内部多孔结构部分的微观结构进行测试的扫描电镜照片如图2所示。由图2的扫描电镜分析结果表明，多孔复合材料不仅有大孔，而且大孔壁含有丰富微孔，孔与孔之间是相互贯通的；材料的孔径在100μm至500μm之间，孔间连贯，平均孔径为250μm左右；孔隙率分析结果为，多孔复合材料的孔隙率在40-70％之间。
在下述表1中给出了对采用本发明方法制备得到的不同孔隙率的多孔支架材料的抗压强度、弯曲强度及拉伸强度等力学性能进行测试的结果。测试结果显示，随着孔隙率的增大，抗压强度减小。其综合力学性能指标完全能满足作为组织工程支架材料使用的要求。
表2注塑发泡法所制多孔复合结构的力学性能孔隙率 抗压强度弯曲强度 拉伸强度(％) (MPa) (MPa) (MPa)n-HA/PA66 4010 9 11复合支架527 6 8材料 704 2.5

纳米磷灰石晶体复合组织工程支架材料的制备方法，将以摩尔比为(0.25～1.5)/1的纳米羟基磷灰石和医用聚酰胺成分组成的复合物，与在分解温度下可产生气体的发泡剂成分均匀混合，其中发泡剂成分为总重量的2％－5％，其分解温度应低于且靠近所用聚酰胺成分的熔融温度，在使该混合物料处于熔融状态的温度条件和30～50MPa的压力条件下，将该熔融态混合物料以注塑方式充注于能使支架材料成型的装置中，由发泡剂成分在熔融态物料的注塑和成型过程中分解产生的气泡形成占位孔隙，最后去除已成型支架材料的孔隙封闭结构的表层。本方法尤适宜制备大尺寸的多孔组织工程支架材料，所得材料的力学性能较高。