编码截短的油酸去饱和酶蛋白质的通过插入突变的核苷酸序列、蛋白质、方法和用途[0001]本发明涉及编码突变的油酸去饱和酶向日葵蛋白质的分离核苷酸序列、突变蛋白质、产生该蛋白质的植物、由该植物产生的种子和油、用于获得该突变序列和植物的方法、以及该蛋白质和植物的用途。[0002]发明背景[0003]油酸去饱和酶酸性酶(OLD)涉及油酸至亚油酸的酶促转化。微粒体OLD已使用通过 T-DNA 的标记技术(T-DNA tagging, Okuley 等人(1994) Plant Cell6:147-158)进行克隆和表征。编码微粒体OLD的高等植物的核苷酸序列已在Lightner等人的文件W094/11516PCT 中描述。[0004]向日葵一般栽培为获得含有饱和脂肪酸(棕榈酸和硬脂酸)和不饱和脂肪酸(油酸和亚油酸)的油。硬脂酸含量始终低于10% (Guston等人(1986) The lipid handbook,Chapman and Hall Great Britain),通常为3_7%。与不饱和脂肪酸含量有关,存在两类向日葵种子:具有50%_70%的亚油酸含量的正常向日葵(Knowles( 1988)Recent advances inoil crops breeding,AOCS Proceedings)和具有高油酸含量的向日葵,其具有2%_10%的亚油酸含量和 75%_90% 的油酸含量(Soldatov (1976)Chemical mutagenesis in sunflowerbreeding,Proceedings of the7th International Sunflower Conference,352-357)。还存在具有22-40%的高棕榈酸含量的向日葵系(Ivanov等人(1988) Sunflower Breedingfor High Palmitic Acid Content in the Oil, Proceedings of thel2th InterntionalSunflower Conference,第II卷,453-465),和具有低饱和脂肪酸含量(小于6%)的另一个向日葵系(EP-A-0496504 )。[0005]为了响应对工业和人食物消耗有利的植物油的需要，例如借助于常规育种计划、诱变或转基因，作出在集中于修饰种子的脂肪酸组成来改善油料种子变种的努力。[0006]突变一般用极高剂量的福射或化学诱变剂进行诱导(Gaul (1964) RadiationBotany4:155-232)。高剂量超过致死剂量50% (LD50),并且一般90%的致死剂量(LD9tl)使可能突变的百分比达到最大。[0007]通过Soldatov在1976年在向日葵群体中进行的诱变允许获得所谓的Pervenets突变型群体。这个栽培变种的种子的油酸脂肪酸(18:1)平均含量高于65%，个体含量是60-80%，而在正常变种(低油酸，L0)中，这个含量是大约20%。Pervenets群体分布全世界，并且用于许多育种计划中，以便将在其种子中具有低18:1含量的特定基因型转换为具有高18:1含量的基因型。[0008]种子中的18:1累积取决于两个酶促反应:18:0(硬脂酸)至18:1的去饱和与18:1至18:2(亚油酸)的后续去饱和。油酸去饱和酶(OLD)催化18:1至18:2的去饱和(Ohlrogge和 Browse (1995)The Plant Cell,7:957-970,Somerville 和 Browse (1996)Trends CellBiol6:148-153 ；Schwartzbeck (2001) Phytochemistry,57:643-652)。
[0009]向日葵油天然富含18:2 (55-70%)且因而缺乏18:1 (20-25%)?常规变种被分类为低油酸的(L0)。因为在食用具有高油酸含量的更健康油的消费者中存在高兴趣，所以在开发高油酸向日葵植物中也存在兴趣，所述向日葵植物优选还导致与常规向日葵变种相似的作物产量。
[0010]由Garces等人在1989和1991年执行的研究(Garces等人(1989)Phytochemistry28:2597-2600 ；Garces 和 Mancha (1991) Phytochemistry30:2127-2130)显示高油酸表型(高油酸，HO)与OLD酶活性中的显著降低相关，所述OLD酶催化在脂质储备合成的关键阶段过程中HO种子中18:1至18:2的去饱和，这解释了 18:1的累积。
[0011]Pervenets突变已显示与OLD基因内的基因重复相关，导致基因沉默。OLD转录中的这种降低解释了酶量的降低，和因此证实的与向日葵种子中的18:1累积一致的低OLD活性(Hongtrakul等人(1998) Crop Sci38:1245-1249)。这个发现导致突变特有的分子标记的发现，所述分子标记可以用于育种计划中以促进HO基因型的选择(W02005/106022 ；Lacombe 等人(2001) Life Sci324:839_845)。
[0012]具有高18:2含量的常规向日葵油视为具有适当味道的健康植物油，并且由于其高百分比的多不饱和脂肪酸，在世界市场上已视为品质一流的油。它用作色拉油、食用油或用于生产人造黄油。
[0013]通过修饰向日葵油的脂肪酸概况，已开发与常规油相比较具有更高氧化稳定性的新油。这种油应至少含有与总脂肪酸有关的55%-65%的18:1水平。这种油的利益是其在提取过程后的高氧化稳定性和油炸产品风味的稳定性。具有高浓度18:1的向日葵油不需要氢化以改善稳定性，并且不形成反式脂肪酸。
[0014]发明概述
[0015]本发明的目的是提供编码具有较低酶活性的突变的油酸去饱和酶蛋白质(OLD)的分离核苷酸序列。这个较低酶活性在植物特别是向日葵植物中表达时，引起与现有植物相比较植物油或种子油 酸量中的增加。
[0016]本发明因此涉及包含改变读码框的插入的分离核苷酸序列，所述核苷酸序列编码截短的向日葵OLD蛋白质。在优选实施方案中，插入的核苷酸序列包含提前终止密码子且编码截短的向日葵油酸去饱和酶蛋白质，其包含SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸序列。截短的油酸去饱和酶蛋白质的编码序列可以是SEQ ID No:3或SEQ ID No:4中所示的核苷酸序列。
[0017]根据其进一步方面，本发明提供了包含N末端不超过110个氨基酸的截短的向日葵油酸去饱和酶蛋白质。在优选实施方案中，氨基酸序列由SEQ ID N0:1或SEQ ID No:2组成。
[0018]根据另一个方面，本发明涉及包含两个OLD等位基因的向日葵植物，所述OLD等位基因具有编码OLD截短蛋白质的插入。每个等位基因包含具有包含提前终止密码子的插入的核苷酸序列，并且其中所述序列编码OLD截短蛋白质。在优选实施方案中，核苷酸序列是SEQ ID No:3或SEQ ID No:4。突变的植物产生具有就种子的总脂肪酸百分比而言80%_95%的油酸含量的种子。
[0019]在其进一步实施方案中，本发明涉及能够产生具有就种子的总脂肪酸含量而言80%-95%的油酸含量的种子的向日葵植物，所述植物可通过下述获得:使具有登记号NCIMB41733的系29065或具有登记号NCMB41734的系29066的植物与另一种植物杂交，并且在F2中选择产生具有就种子的总脂肪酸百分比而言80%-95%的油酸含量的种子的植物。[0020]本发明还提供了包含两个OLD等位基因的向日葵种子，所述OLD等位基因具有编码截短的油酸去饱和酶蛋白质的插入。每个等位基因包含具有包含提前终止密码子的插入的核苷酸序列，并且其中所述序列编码截短的蛋白质油酸去饱和酶。核苷酸序列可以是SEQID No:3或SEQ ID No:4中所示的序列。油酸去饱和酶蛋白质的氨基酸序列可以是SEQ IDNo:1或SEQ ID No:2中所示的序列。在优选实施方案中，种子具有系29065或系29066，所述系29065的代表性种子例子在登记号NCMB41733下保藏，所述系29066的代表性种子例子在登记号NCMB41734下保藏。
[0021]根据本发明的另一个方面，提供了向日葵油，其具有就油的总脂肪酸含量而言80%-95%的油酸含量，所述油可得自或得自包含两个OLD等位基因的向日葵种子，所述OLD等位基因具有插入且编码截短的油酸去饱和酶蛋白质。在优选实施方案中，油得自系29065或系29066的种子，所述系29065的代表性种子例子在登记号NCMB41733下保藏，所述系29066的代表性种子例子在登记号NCMB41734下保藏。
[0022]本发明进一步提供了向日葵种子用于油提取的用途。在优选实施方案中，种子具有系29065或系29066，所述系29065的代表性种子例子在登记号NCMB41733下保藏，所述系29066的代表性种子例子在登记号NCMB41734下保藏。
[0023]本发明进一步涉及请求保护的种子的后代，其中所述后代在基因中包含编码油酸去饱和酶蛋白质的插入，其中此类插入导致截短的油酸去饱和酶蛋白质的合成。
[0024]本发明进一步涉及用于获得具有高油酸含量的向日葵植物的方法，其包括下述步骤:
[0025]a)向日葵 植物的部分的诱变；
[0026]b)获得突变植物的至少一个后代，和
[0027]c)鉴定且选择步骤b)中获得的至少一个植物，其包含具有包含提前终止密码子的插入的核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列编码截短的油酸去饱和酶蛋白质。在一个实施方案中，截短的油酸去饱和酶蛋白质包含向日葵油酸去饱和酶的N末端不超过110个氨基酸的序列，例如SEQ ID No:l或SEQ ID No:2中所示的蛋白质。
[0028]根据其另一个方面，本发明提供了用于获得高油酸向日葵油的方法，其包括从种子中提取油，所述种子的代表性种子例子在登记号NCMB41733或NCMB41734下保藏。
[0029]附图简述
[0030]图1 展示对于在杂交 20342x29065 ；20342x29066 ；20340x29065 和 20340x29066 中获得的系29065和29066，对于高油酸Pervenets突变的纯合植物与所有主要脂肪酸有关的油酸百分比的图表。在所有情况下，携带以纯合状态的本发明突变(分别为mut29065Hm和mut29066Hm)的F2植物中的油酸百分比与携带以纯合状态的Pervenets突变(mutPervenets Hm)的F2植物相比较。点代表平均值，并且在框内的区段代表中值。
[0031]发明详述
[0032]本发明涉及具有插入的编码油酸去饱和酶的突变的核苷酸序列，其中所述插入序列包含提前终止密码子且因此向日葵油酸去饱和酶蛋白质是截短的。所编码的截短的油酸去饱和酶蛋白质具有较低酶活性，导致植物或植物部分例如种子累积大量油酸。
[0033]截短的氨基酸序列可以是包含向日葵油酸去饱和酶蛋白质的N末端不超过前110个氨基酸的任何序列。在优选实施方案中，截短的氨基酸序列可以是SEQ ID No:1中所示的序列或SEQ ID No:2中所示的序列。
[0034]通过插入突变的核苷酸序列包含导致合成向日葵截短的OLD蛋白质的提前终止密码子。应当理解编码油酸去饱和酶蛋白质的任何核苷酸序列都在本发明的范围内，所述油酸去饱和酶蛋白质包含野生型向日葵OLD (例如来自系HA89的OLD)的N末端不超过前110个氨基酸。
[0035]包含具有提前终止密码子的插入的核苷酸序列，例如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4中所示的序列在本发明的范围内。
[0036]不同向日葵系例如系HA89和29010已得到突变，以获得产生具有高油酸含量的种子的植物。在向日葵油酸去饱和酶基因的编码序列中的所选突变是通过插入包含提前终止密码子的序列的突变，所述核苷酸序列编码截短的油酸去饱和酶蛋白质。
[0037]本发明的突变型种子于2010年7月20日以下述登记号保藏在Budapest Treatyin the National Library of Industry,Food and Marine Bacteria (NCIMB)保藏中心:系29065是登记号NCMB41733，并且系29066是登记号NCMB41734。
[0038]本发明涉及在其基因组中携带突变的所有种子和植物，特别是向日葵种子和植物，所述突变导致截短的油酸去饱和酶蛋白质的产生，所述截短的油酸去饱和酶蛋白质具有与现有油酸去饱和酶相比较降低的酶活性，导致种子油中更高的油酸含量。在一个实施方案中，突变是携带终止密码子的插入。导致油酸去饱和酶平截至最多110个氨基酸的其他突变也在本发明的范围内。在油中具有更高的油酸含量的此类植物和种子可以通过下述获得:与保藏的系29065 (NCMB41733)或29066 (NCMB41734)的植物杂交，并且选择具有更高的油酸含量的后代植物。选择在F2中适当地进行，因为导致平截的突变对于较低酶活性必须优选纯合存在，以导致更高的油酸含量。备选地，突变的基因可以借助于基因工程特别是cisgenesis带进向日葵植物内，其中使用本文描述的突变型油酸去饱和酶基因或导致相同的不超过110个氨基酸的截短表达产物的任何其他基因。
[0039]本发明的突变植物和种子可以使用不同诱变方案获得。在优选实施方案中，将浓度为5-15%的诱变剂例如EMS注入植物的花(flower head)内，收获种子且随后应用X射线辐射。
[0040]在诱变后，分析突变的M2种子和亲本种子的脂肪酸概况，并且选择显示高油酸含量的那些，例如相对种子的脂肪酸含量超过80%，优选相对种子的总脂肪酸含量约90%的那些。
[0041]在另一个优选实施方案中，通过X射线应用获得突变的植物和种子。随后，使M2种子的脂肪酸概况与亲本种子的脂肪酸概况相比较，并且选择显示高油酸含量的那些，例如具有就种子的总脂肪酸含量而言超过80%，优选与种子的总脂肪酸含量相比较约90%的那些。
[0042]由本发明的向日葵种子中的任何产生的油具有就种子的总脂肪酸含量而言高于80%、优选高于85%、且更优选高于90%的油酸含量。
[0043]直接杂交在属于具有高油酸表型的Advanta Semillas的系(其是Pervenets突变的携带者(20342和20340))和本发明的高油酸突变型29065和29066之间执行:20342x29065 ；2042x290 66 ；20340x29065 和 20340x29066。使在每次杂交中获得的 Fl 植物自花授粉，并且收获其种子(F2)。在2008/2009季节过程中，将来自每次杂交的F2种子种植在Balcarce的田间。
[0044]借助于使用特异性分子标记,鉴定在每次杂交中获得的,对于Pervenets突变纯合以及对于突变29065和29066突变纯合的植物。使所述植物自花授粉，并且分别收获种子。从每个植物中获得一组30粒种子，在小块中研磨，并且通过气相色谱法测定油的脂肪酸组成。
[0045]在所有情况下，对于突变29065和29066纯合的植物显示高于其具有Pervenets突变的相应配对物的平均油酸百分比(参见表3和图1)。
[0046]核苷酸和氨基酸序列与向日葵野生型系HA89的相应序列(SEQ ID No: 5和SEQ IDNo:6)相比较。这些序列等同于29010野生型向日葵系的相应序列。
[0047]本发明通过下述实施例举例说明，所述实施例不应解释为限制其范围。相反，应明确理解在阅读本公开内容后本领域技术人员能够采用本发明的其他实施方案、修饰和等价物，而不背离本发明的精神和/或附加权利要求的范围。
实施例
[0048]实施例1
[0049]1.1通过X射线辐射的诱变(系29065的生成)
[0050]通过应用X射线诱变Advanta Semillas SAIC有专利权的系29010的MO种子。照射在 Institute of Genetics^Edward A.Favret”, CICVyA-CNIA, INTA-Castelar,阿根廷进行。用于X射线发射的装置是Philips MG160，4KW，具有160KV，19mA的最大输出和120KV，15mA的功率使用。使用的暴露时间和剂量分别为7分55秒和144戈瑞，在来源焦点和目标(种子)之间具有40厘米的 距离。
[0051]被照射的种子在2005年12月12日播种在Balcarce长100米的12行中，使用批号CA05-6347。将获得的1606个植物的花(flower head)在开花前装袋，以便通过自花授粉产生种子，M2。收获每行中的花，并且分别脱粒。通过气相色谱法(GC)分析1606个植物的M2种子，以测定30粒个体M2种子/植物中的脂肪酸组成。显示具有高油酸含量的表型的突变型植物CA05-6347-725被称为29065。
[0052]1.2通过EMS注入诱变和后续用X射线照射(系29066的生成)
[0053]在季节2004/5中，将七十五行系HA89的种子播种在Balcarce(Buenos Aires,阿根廷)中的 Biotechnology Research Center of Advanta Semillas SAIC 中，并且在批号CA04-3下鉴定，并且40行在批数CA04-1501下。每行长6米。
[0054]使用合适的诱变方案，以5、10和15%的剂量通过EMS注入(甲磺酸乙酯)诱变植物的花。将每个MO植物在开花前装袋，以便产生自花授粉的Ml种子。收获每次EMS处理的植物的花，脱粒且贮存。使用W02006/024351和W02008/071715中所述的方案，以5、10和15%的剂量通过用EMS (甲磺酸乙酯)注入诱变植物的花。EMS是诱导G/C至A/T转变的诱变剂(Jander等人(2003)Plant Physiol.131:139-146)。为了产生自花授粉的Ml种子，将每个MO植物在开花前用尼龙网袋覆盖。收获各5%EMS处理的植物的花，脱粒且鉴定(批次CA04-3)。
[0055]随后通过X射线应用诱变所述Ml种子。照射在Institute of Genetics^EdwardA.Favret”，CICVyA-CNIA，INTA-Castelar,阿根廷进行。X 射线发射装置是 Philips MG160,4KW，具有160KV，19mA的最大输出和120KV，15mA的功率使用。使用的暴露时间和剂量分别为7分55秒和144戈瑞(Gray)，在来源焦点和目标(种子)之间具有40厘米的距离。
[0056]被照射的种子在批号CA05-6362下在2005年12月12日播种在Balcarce长100米的16行中。将获得的555个植物的花在开花前装袋，以便通过自花授粉产生种子，M2。收获每行中的花，并且单独脱粒。通过气相色谱法(GC)分析来自555个植物的M2种子，以测定30粒各M2种子/植物中的脂肪酸组成。显示具有高油酸含量的表型的突变型植物CA05-6362-263 被称为 29066。
[0057]表1显示用于本发明的每个突变系的诱变方法、截短的油酸去饱和酶蛋白质的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0058]表1
[0059]