专利名称：用于使所编码蛋白的表达增加的、包含或编码组蛋白茎-环和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷 ...的制作方法用于使所编码蛋白的表达增加的、包含或编码组蛋白 茎-环和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信号的核酸本申请描述了编码核酸序列以及其用于使所编码蛋白的表达增加的用途，所述编码核酸序列具体地是信使RNA(mRNA)，其包含或编码组蛋白茎-环和多聚腺甘酸(poly(A))序列或多聚腺苷酸化信号。还公开了其用于制备药物组合物(特别是疫苗)或在基因治疗中的用途，所述药物组合物例如用于治疗肿瘤和癌症疾病、心血管疾病、传染性疾病、自身免疫性疾病或遗传性疾病。本发明进一步描述了体外转录方法、利用包含或编码组蛋白茎-环和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信号的核酸使蛋白表达增加的体外方法以及间接体内和体内方法。除了心血管疾病和传染性疾病之外，肿瘤和癌症疾病的发生是现代社会中最常见的死因之一，并且在大多数情况下就治疗和随后的康复措施而言与昂贵的费用相关联。肿瘤和癌症疾病的治疗大大依赖于例如所发生肿瘤的类型、年龄、受治疗患者体内癌症细胞的分布等。除了侵入性手术以外，现今通过利用放射疗法或化学疗法传统进行癌症治疗。然而，这些传统疗法通常对免疫系统施加巨大压力，并且在一些情况下仅能在有限程度上使用。此外，这些传统疗法大部分在单次治疗之间需要很长的间隔期，以使得免疫系统能够再生。因此，近些年已经研究了除这些“传统治疗”以外的辅助方案，以避免或至少减少这些治疗对免疫系统的影响。这种辅助治疗之一具体地包括基因治疗方法或基因疫苗接种，已经发现其对于治疗或对于辅助这些传统疗法是非常有前景的。基因治疗和基因疫苗接种是分子医学方法，其在疾病的治疗和预防中已经得以证明，并且一般对日常医疗行为表现出巨大作用，特别是对于治疗如上所述的疾病。基因治疗还用于其他医学领域中，例如用于遗传性疾病的情况中，也即由既定的基因缺陷引起并且依照孟德尔(Mendel)定律遗传的(遗传性)疾病。这种遗传性疾病中最公知的代表包括粘液粘稠病(囊肿性纤维化)和镰状细胞性贫血以及其他疾病。基因治疗和基因疫苗接种两种方法均基于将核酸引入 患者的细胞或组织中，并随后对由已经引入细胞或组织中的核酸所编码的信息进行处理，也即期望多肽的(蛋白)表达。在基因治疗方法中，通常使用DNA，尽管最近的研究进展中已知还可以使用RNA。重要的是，在所有这些基因治疗方法中，mRNA用作所编码蛋白质序列信息的信使，无论使用DNA、病毒RNA或是mRNA。一般认为RNA是不稳定的分子RNA酶普遍存在并且众所周知其难于失活。而且，RNA在化学上也比DNA更不稳定。因此，或许令人惊讶的是，真核细胞中mRNA “缺省状态”的特征在于其相对稳定性，并且需要特定信号加速个体mRNA的降解。该发现的主要原因似乎是细胞内mRNA的降解几乎由外切核酸酶专门催化。然而，真核mRNA的末端受到特定末端结构以及其相关蛋白5’末端的m7GpppN CAP和通常3’末端多聚腺甘酸序列的保护，使其免受这些酶的降解。这两种末端修饰的去除因而被认为是mRNA降解的速率限制。尽管在α -球蛋白mRNA的3’ UTR中已经表征了稳定元件，然而影响真核mRNA周转的RNA序列通常通过加速脱腺苷化而作为降解的推动者(综述于Meyer, S. , C. Temme等，(2004), CritRev Biochem Mol Biol39(4) : 197-216 中)。如上面所述，真核mRNA的5’端通常经转录后修饰，以携带甲基化CAP结构，例如m7GpppN。除了在RNA剪接、稳定和运送中发挥作用以外，CAP结构显著地增强翻译起始期间40S核糖体亚单位至mRNA5’端的招募。后者的功能需要通过真核起始因子复合物eIF4F识别CAP结构。多聚腺甘酸序列额外地通过增加40S亚单位至mRNA的招募从而另外地刺激翻译，该作用需要多聚腺甘酸结合蛋白(PABP)的干预。最近表明PABP转而表明与eIF4G物理相互作用，所述eIF4G是与CAP结合的eIF4F复合物的一部分。因此，假设了在经加帽的多聚腺苷酸化mRNA上进行翻译起始的闭环模型(Michel, Y. Μ. , D. Poncet等，(2000), JBiol Chem275(41) :32268_76)。几乎所有的真核mRNA以这种多聚腺甘酸序列结尾，所述多聚腺甘酸序列通过普遍存在的剪切/多聚腺苷酸化机制加入到其3’端。3’端多聚腺甘酸序列的存在是真核mRNA最可识别的特性之一。剪切后，除了复制依赖型组蛋白转录体，大部分mRNA前体需要多聚腺苷酸化尾。在上下文中，3’端加工是一种核共转录过程，其促进mRNA从核运送至细胞质，并且影响mRNA的稳定性和翻译。该3’端的形成发生于由剪切/多聚腺苷酸化机制指导的两步反应中，并且依赖于mRNA前体(pre-mRNA)中存在的两个序列元件高度保守的六核苷酸AAUAAA (多聚腺苷酸化信号)和下游富含G/U的序列。在第一步骤中，mRNA前体在这两个元件之间裂解。在紧接第一步骤的第二步骤中，通过加入由200-250个腺苷酸组成的多聚腺甘酸序列，使新形成的3’端延伸，这随后影响mRNA代谢的所有方面，包括mRNA输出、稳定性和翻译(Dominski, Z.和 W. F. Marzluff (2007)，Gene396 (2) :373_90)。该规律唯一已知的例外是复制依赖型组蛋白mRNA，其末端以组蛋白茎-环代替多聚腺甘酸序列。示例性组蛋白莖-环序列描述于Lopez等，(Ddivila Lopez, Μ.,&Samuelsson, T. (2008)， RNA(New York, Ν· Y.)，14(1)，1-10. doi 10. 1261/rna. 782308.)中。组蛋白mRNA前体中的茎-环通常后接富含嘌呤的序列，其被称为组蛋白下游元件(HDE)。这些mRNA前体在核内通过在茎-环下游单次内切核苷酸式剪切大约5个核苷酸而被加工，其由U7snRNP通过U7snRNA与HDE的碱基配对而催化。由于需要将新合成的DNA包装成染色质，组蛋白合成与细胞周期一同被调控。通过组蛋白基因的转录活化以及组蛋白mRNA水平的后转录调控，S阶段期间组蛋白的合成增力口。这可以表明组蛋白茎-环对于组蛋白表达调控的所有后转录步骤是关键的。其对于充分加工、mRNA输出进入细胞质中、加载到多聚核糖体上以及调控mRNA稳定性来说是必需的。在上文中，鉴定出32kDa的蛋白，其在核和细胞质中均在组蛋白信息的3’端处与组蛋白茎-环相连。该茎-环结合蛋白(SLBP)的表达水平受到细胞周期的调控，其在S阶段期间当组蛋白mRNA水平增加时最高。SLBP对于U7snRNP对组蛋白mRNA前体进行充分的3’端加工来说是必需的。完成加工后，SLBP保持在成熟组蛋白mRNA的末端与茎-环相连，并且刺激其在细胞质中翻译成组蛋白(Dominski，Z.和W. F. Marzluff (2007)，Gene396 (2)373-90)。有趣的是，SLBP的RNA结合结构域在后生动物和原生动物中都是保守的(DdvilaLopez, Μ.，&Samuelsson, T. (2008)，RNA(New York, Ν· Υ· )，14(1)，1-10. doi 10.1261/rna. 782308)，可以显示其与组蛋白茎_环序列的结合依赖于茎_环结构，并且最小结合位点含有至少茎-环5’端的3个核苷酸和3’端的2个核苷酸(Pandey，N. B.等，(1994)，Molecular and Cellular Biology, 14(3), 1709-1720 以及 Williams, A. S. , &Marzluff,ff. F. , (1995)，Nucleic Acids Research,23(4)，654-662.)。即使一般将组蛋白基因归类为产生末端为组蛋白茎-环的mRNA的“复制依赖型”或者产生作为替代带有多聚腺甘酸尾的mRNA的“替换型”，在非常罕见的情况中已经鉴定出了在其3’端同时含有组蛋白茎-环和多聚腺甘酸或寡聚腺甘酸(oligo(A))的天然存在的mRNA。Sanchez等利用突光素酶作为报告蛋白，检验了非洲爪蟾(Xenopus)卵子发生期间组蛋白mRNA的组蛋白茎-环3’端附带的天然存在的寡聚腺甘酸的作用，并发现寡聚腺甘酸尾是翻译阻遏机制的活性部分，其在卵子发生期间使组蛋白mRNA沉默，其去除是组蛋白mRNA 翻译活化机制的一部分(Sanchez, R.和 W. R Marzluff (2004)，Mol Cell Biol24(6)2513-25)。此外，已经利用编码标志物蛋白α -球蛋白的人工构建体研究了在mRNA前体加工和mRNA稳定性水平上调控复制依整型组蛋白的需要，其中利用与无内含子的组蛋白基因相反球蛋白基因含有内含子的事实。为此目的，制备了构建体，其中α-球蛋白编码序列后接组蛋白茎-环信号(组蛋白茎-环后接组蛋白下游元件)和多聚腺苷酸化信号(ffhitelaw, E.等，(1986) · N ucleic Acids Research,14(17),7059-7070. ；Pandey, N. B.,&Marzluff, ff. F. (1987). Molecular and Cellular Biology,7(12),4557-4559. ；Pandey,N. B.等，(1990). Nucleic Acids Research, 18 (11)，3161-3170)。在另一种方法中，LUscher等研究了重组组蛋白H4基因的细胞周期依赖性调控。制备了构建体，其中H4编码序列后接组蛋白茎-环信号和多聚腺苷酸化信号，这两个加工信号附带地被半乳糖激酶编码序列分开(Liischer, B.等，(1985). Proc. Natl. Acad. Sc1.USA,82(13),4389-4393)。此外，Stauber等鉴定出了在组蛋白H4mRNA水平上赋予细胞周期调控所需的最小序列。对于这些研究，使用了包含选择标志物黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT)编码序列的构建体，所述序列的前面是组蛋白茎-环信号后接多聚腺苷酸化信号(Stauber，C.等，(1986). EMBO J，5 (12)，3297-3303)。Wagner等在对组蛋白mRNA前体加工进行检验时，利用报告构建体鉴定出了组蛋白mRNA前体剪切所需的因子，所述报告构建体使EGFP置于组蛋白茎-环信号和多聚腺苷酸化信号之间使得EGFP仅在组蛋白mRNA前体加工被破坏的情况下表达(Wagner，E. J.等，(2007). Mol Cell28(4)，692-9)。需要注意的是，多聚腺苷酸化mRNA的翻译一般需要使3’多聚腺甘酸序列位于5’CAP附近。这通过多聚腺甘酸结合蛋白与真核起始因子eIF4G之间的蛋白-蛋白相互作用而介导。关于复制依赖型组蛋白mRNA，已经揭示了相似的机制。在上下文中，Gallie等显示组蛋白茎-环在功能上与多聚腺甘酸序列类似之处在于其增强翻译效率并且共依赖于5’CAP以达到有效的翻译水平。他们显示出组蛋白茎-环对于增强经转染的中国仓鼠卵巢细胞中报告mRNA的翻译是充分且必要的，但是其必须位于3’末端以发挥最佳功能。因此，与其他mRNA上的多聚腺甘酸尾类似，这些组蛋白mRNA的3’端似乎对于体内翻译十分关键，并且在功能上与多聚腺甘酸尾相似(Gallie，D. R.，Lewis, N. J.，&Marzluff, ff. F. (1996)，Nucleic Acids Research,24(10),1954-1962)。此外，可以显示SLBP与细胞质组蛋白mRNA结合，并且是其翻译所需的。即使SLBP不直接与eIF4G相互作用，组蛋白mRNA翻译所需的结构域与最近鉴定出的蛋白SLIPl相互作用。在进一步的步骤中，SLIPl与eIF4G相互作用并允许组蛋白mRNA环化，并且通过与多聚腺苷酸化mRNA翻译类似的机制辅助组蛋白mRNA的有效翻译。如上面所述，基因 治疗方法一般利用DNA将编码信息转移至细胞中，然后编码信息转录成mRNA,其携带mRNA的天然存在的元件,具体地是5’ CAP结构和3’多聚腺甘酸序列，以确保所编码的治疗性蛋白的表达。然而，在很多情况下，无论使用DNA或RNA，基于将这些核酸引入患者的细胞或组织中并且随后的由这些核酸编码的期望多肽的表达的表达系统不会表现出可以允许进行有效治疗所期望或甚至是所需的表达水平。在现有技术中，迄今已经进行了使所编码蛋白的表达产率增加的不同尝试，具体地是通过在体外和/或体内利用改进的表达系统。现有技术中一般描述的使表达增加的方法传统地基于利用含有特定启动子和相应调控元件的表达载体或表达盒。由于这些表达载体或表达盒通常局限于特定的细胞系统，因此必须对这些表达系统进行改造，以用于不同的细胞系统中。接着一般将这种经改造的表达载体或表达盒转染到细胞中，并通常根据具体的细胞系进行处理。因此，主要优先考虑能够在靶细胞中通过细胞内固有的系统而不依赖于特定细胞类型特异性启动子和调控元件使所编码蛋白表达的那些核酸分子。在上下文中，mRNA稳定元件和增加mRNA翻译效率的元件之间可以具有区别。编码序列经优化以及一般适用于此目的的mRNA描述于申请W002/098443 (CureVac GmbH)中。例如，W002/098443描述了一般形式下稳定并且在其编码区中优化翻译的mRNA。W002/098443进一步公开了确定序列修饰的方法。W002/098443额外地描述了将mRNA序列中的腺嘌呤和尿嘧啶替换掉以使序列的鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C)含量增加的可能性。根据W002/098443，这种用于使G/C含量增加的替换和改造可以用于基因治疗应用中，还可以用于治疗癌症或传染性疾病的基因疫苗中。在上下文中，W002/098443总体上提及的序列是用于这些修饰的碱基序列，其中经修饰的mRNA编码在将要待治疗的患者中例如完全不或不足地或错误地翻译的至少一种生物活性肽或多肽。或者，W002/098443以进行这些修饰的碱基序列提出了编码抗原(例如肿瘤抗原或病毒抗原)的mRNA。在使所编码蛋白的表达增加的又一种方法中，申请W02007/036366描述了长多聚腺甘酸序列(部分长于120bp)和β-球蛋白基因的至少两个3’非翻译区的组合对mRNA稳定性和翻译活性的正面效应。然而，尽管所有后面这些现有技术文献已经尝试为基因治疗方法提供非常有效的工具以及额外地改进的mRNA稳定性和翻译活性，仍然存在相对于DNA疫苗和基于DNA的基因治疗方法基于RNA的应用稳定性普通较低的问题。因此，本领域仍然需要提供改进的工具，以用于基因治疗方法和基因疫苗中或者作为如上面所讨论的传统治疗的辅助疗法，例如通过进一步改善的mRNA稳定性和/或翻译活性，优选基因疗法。因此，本发明的目的是提供额外的和/或替代性方法以使所编码蛋白的表达增力口，对于本领域已知用于治疗应用(例如基因治疗和基因疫苗)中的核酸优选通过使mRNA进一步稳定和/或使该mRNA的翻译效率增加。该目的由所附权利要求的主题解决。具体地，根据第一个实施方案，本发明的潜在目的由包含或编码以下的本发明的核酸序列解决a)编码区，优选编码肽或蛋白；b)至少一个组蛋白茎-环；和c)任选地多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信号，优选其用于使所编码蛋白的表达水平增加，其中所述所编码的蛋白优选不是组蛋白，不是报告蛋白(例如荧光素酶、GFP、EGFP、β -半乳糖苷酶、特别是EGFP)，以及不是标志物或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。在上下文中，特别优选根据本发明第一实施方案的本发明的核酸至少部分地通过DNA或RNA合成产生,或者其是经分离的核酸。本发明基于本发明人的惊人发现，即多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信号和至少一个组蛋白茎-环的组合(尽管自然界中二者代表相互替代的机制)协同作用，这是因为该组合使蛋白表达增加至数倍于利用单个要素的任一个时观察到的水平。无论多聚腺甘酸和组蛋白茎-环的次序如何，也无论多聚腺甘酸序列的长度如何，均可见多聚腺甘酸和至少一个组蛋白茎-环的组合的协同效应。因此，特别优选本发明的核酸分子包含或编码a)编码区，优选编码肽或蛋白；b)至少一个组蛋白茎-环；和c)多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信号，优选其用于使所编码蛋白的表达水平增加，其中所述所编码蛋白优选不是组蛋白，不是报告蛋白(例如荧光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、特别是EGFP)和/或不是标志物或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。在本发明第一实施方案的又一替代性方面中，本发明的核酸不包含组蛋白下游元件(HDE)。在上下文中，特别优选本发明的核酸在5’ -至3’ -方向包含或编码a)编码区，优选编码肽或蛋白；b)至少一个组蛋白茎-环，任选地组蛋白茎-环3’端无组蛋白下游元件c)多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信号。术语“组蛋白下游元件(HDE) ”是指天然存在的茎-环的3’端延伸大约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多聚核苷酸，其代表U7snRNA的结合位点，参与将组蛋白mRNA前体加工成成熟的组蛋白mRNA。例如在海胆中，HDE是CAAGAAAGA (Dominski，Z.和ff. F. Marzluff (2007)，Gene396 (2) :373_90)。 此外，优选根据本发明第一实施方案的本发明的核酸不包含内含子。在另一个特别优选的实施方案中，根据本发明第一实施方案的本发明的核酸序列从5’至3’包含或编码a)编码区，优选编码肽或蛋白；b)多聚腺甘酸序列；和c)至少一个组蛋白茎-环。 根据本发明第一实施方案的本发明的核酸序列包含任何适宜的核酸，其选自例如任何(单链或双链)DNA，优选但不限于例如基因组DNA、单链DNA分子、双链DNA分子，或者其可以选自例如任何PNA (肽核酸)，或者其可以选自例如任何(单链或双链)RNA,优选信使RNA(mRNA),等。本发明的核酸分子还可以包含病毒RNA(vRNA)。然而,本发明的核酸序列可以不是病毒RNA或可以不含病毒RNA。更具体地，本发明的核酸序列可以不含病毒序列元件，例如病毒增强子或病毒启动子(例如不是失活的病毒启动子或序列元件，更具体地不因替换方法而失活)，或者其他病毒序列元件，或者病毒或逆转录病毒核酸序列。更具体地，本发明的核酸序列可以不是逆转录病毒或病毒载体或者经修饰的逆转录病毒或病毒载体。在任何情况下，本发明的核酸序列可以含有或不含增强子和/或启动子序列，所述增强子和/或启动子序列可以经过或不经修饰，或者可以是活化的或失活的。增强子和/或启动子可以在植物中可表达或不可表达，和/或在真核细胞中可表达或不可表达，和/或在原核细胞中可表达或不可表达。本发明的核酸分子可以含有或不含编码(自剪接)核酶的序列。优选本发明的核酸分子是RNA。在本发明第一实施方案的特定方面中，本发明的核酸是包含于适于进行体外转录的核酸中的核酸序列，尤其是适宜的体外转录载体(例如包含用于进行体外转录之特定启动子(例如T3、T7或Sp6启动子)的质粒或线性核酸序列)。在本发明第一实施方案的又一个特别优选的方面中，本发明的核酸包含于适于在表达系统中(例如表达载体或质粒中)转录和/或翻译的核酸中，所述表达系统尤其是原核(例如细菌，例如埃希氏大肠杆菌(E. coli))或真核(例如哺乳动物细胞(例如CHO细胞、酵母细胞或昆虫细胞或完整的有机体(例如植物或动物))表达系统。术语“表达系统”是指适于产生肽、蛋白或RNA(尤其是mRNA)的系统(细胞培养物或完整的有机体)。 根据本发明第一实施方案的本发明的核酸序列包含或编码至少一个组蛋白茎-环。在本发明的上下文中，所述组蛋白茎-环通常来源于组蛋白基因，其包含两个相邻的、完全或部分反向互补的序列的分子内碱基配对，因而形成茎-环。茎-环可以出现于单链DNA中，或更常出现于RNA中。该结构还被称为发卡或发卡环，其一般由连续序列内的茎和(末端的)环组成，其中所述茎由两个相邻的、完全或部分反向互补的序列形成，其被作为间隔子类别的短序列分开，构建成茎-环结构的环。两个相邻的完全或部分反向互补的序列可以定义为例如茎-环元件茎I和茎2。当这两个相邻的完全或部分反向互补的序列(例如茎-环元件茎I和茎2)相互形成碱基对时形成茎-环，产生双链核酸序列，其末端包含由连续序列上位于茎-环元件茎I和茎2之间的短序列形成的未配对的环。未配对的环因而通常表示不能与这些茎-环元件任何一个发生碱基配对的核酸区域。所得棒棒糖形状的结构是很多RNA 二级结构的关键构建区块。因此茎-环结构的形成依赖于所得茎-环区域的稳定性，其中首要先决条件通常是存在能够自身回折从而形成配对双链的序列。配对茎-环元件的稳定性由长度、其含有的错配或鼓胀(bulge)数量(少量错配通常是可以容忍的，特别是在长的双链中)以及配对区域的碱基组成所决定。在本发明的文本中，最佳的环长度是3-10个碱基，更优选3至8个、3至7个、3至6个或者甚至更优选4至5个碱基，最优选4个碱基。根据本发明，根据权利要求1成分(b)的组蛋白茎-环序列可以不是来源于小鼠组蛋白。更具体地，组蛋白茎-环序列可以不是来源于小鼠组蛋白基因H2A614。本发明的核酸还可以既不含小鼠组蛋白茎-环序列，也不含小鼠组蛋白基因H2A614。进一步地，本发明的核酸序列可以不含茎-环加工信号，更具体地是小鼠组蛋白加工信号，最具体地可以不含小鼠茎-环加工信号H2kA614。本发明的核酸分子还可以含有至少一种哺乳动物组蛋白基因。然而，所述至少一种哺乳动物组蛋白基因可以不是W001/12824的Seq.1D No. 7。根据本发明第一实施方案的一个优选方面，本发明的核酸序列包含或编码至少一个组蛋白茎-环序列，优选根据以下式(I)或(II)的至少一个式⑴(无茎边缘元件的茎-环序列)本申请描述了编码核酸序列以及其用于使所编码蛋白的表达增加的用途，所述核酸序列具体地是信使RNA(mRNA)，其包含或编码组蛋白茎-环和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信号。还公开了其用于制备药物组合物(特别是疫苗)或在基因治疗中的用途，所述药物组合物例如用于治疗肿瘤和癌症疾病、心血管疾病、传染性疾病、自身免疫性疾病或遗传性疾病。本发明进一步描述了体外转录方法、利用包含或编码组蛋白茎-环和多聚腺甘酸序列或多聚腺苷酸化信号的核酸使蛋白表达增加的体外方法以及离体和体内方法。