专利名称：一种植物水通道蛋白及其编码基因的应用的制作方法自然界中存在多种如盐、碱、高温、低温、干旱、病虫害等多种生物和非生物胁迫， 限制了作物的生长发育，从而影响作物产量直接威胁到粮食安全，因此，将抗逆境胁迫的基因转入作物中进行分子育种改良作物性状引起了科研工作者的兴趣。而克隆逆境相关基因及其功能的研究能够为通过基因工程进行植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。但是， 当前很多研究主要集中在草本植物，很少对木本植物特别是盐生木本植物进行分子遗传学的研究。木本植物和草本植物应对生物和非生物胁迫时在结构、生长、发育以及生理等方面存在差异性，因此克隆和研究木本植物中与抗逆相关的基因能够为通过基因工程提高作物对生物和非生物胁迫的耐受力提供更多的候选基因。四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是藜科，滨藜属木本植物，是干旱、 半干旱地区的典型植物，在年降雨量180mm以上，年均气温5°C左右，极端最低温度_40°C的干旱、半干旱荒漠、盐碱地生长良好，种源产地海拔2377m，人工栽植区已达3150m。据报道四翅滨藜被有些国家称为“生物脱盐器”，种6. 07亩四翅滨藜，一年能从土壤中吸收It以上的盐分，是荒漠、半荒漠山旱地极有价值的优良饲料灌木，高产优质、富含营养，枝叶含12% 以上的粗蛋白，生物量达15t/hm2，同时有积累硒的能力，在美国广泛用于路坡固定和水土保持，但主要还是用于牧场改良。近几年先后在我国甘肃、青海、新疆、宁夏等地进行了区域性引种栽培试验，显示了极强的耐干旱、耐低温、贫瘠、抗盐碱等优良特性。酿酒酵母菌&iccharomyces cerevisiae不仅具有生长快、容易培养和易于遗传操作等优点，而且具有典型真核系统的特性，具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程，其表达模式与植物表达模式更为接近，所以用酵母筛选植物抗逆基因具有原核表达系统不可替代的优越性。采用酵母突变体筛选植物的不同cDNA文库来鉴定和挖掘新基因的方法已经广泛应用于植物功能基因的研究。用酵母的2种不同氨基酸转运缺陷突变体筛选拟南芥cDNA文库，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆到相应的编码相同氨基酸透过酶的NAT2/AAP1。酵母表达系统还被广泛地应用到植物耐盐基因功能研究中，Yamada等(2002年)利用酵母表达体系验证了丙二烯环化氧化酶(AOC)基因大大增强转化子的耐盐性，从而表明AOC基因在真核表达系统中增强抗盐胁迫的功能。唐玉林等 (2007年)利用酵母表达系统研究大豆SALI3-2蛋白功能，将大豆SAL 13-2蛋白cDNA及其缺失片段构建到酵母表达载体PYES2上，并转化酵母菌INV&1，检测酵母重组子在胁迫条件下的生长状况，结果表明，SALI3-2基因可明显提高酵母转化子的耐盐能力。酿酒酵母菌株INVkl (基因型为MATa his3Dl leu2 trpl-289 ura3_5W是一种二倍体，并且生长迅速的理想酵母表达菌株，该菌株是人工改造的尿嘧啶营养缺陷型菌株，运用SC-U培养基筛选转化子，假阳性率低，能够保证转化效率。水通道蛋白，也称水孔蛋白(简称AQP)，普遍存在于动物，植物及微生物中。到目前为止，植物中已发现了多种水通道蛋白水通道蛋白具有MIP家族结构的典型特征，序列亲水性分析表明，水通道蛋白具有由5个短环(loop)相连的6个跨膜α螺旋及伸入细胞质的N端和C端组成。水通道蛋白含有特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSI/FGAAI/ VI/VF/YN。水通道蛋白的一级结构呈现出内部同源性，也就是说它的N端蛋白与C端蛋白具有同源性，这被推测为是基因内部扩增而成在平衡细胞水分的过程中，可阻止因干旱、盐害、高温等胁迫下的水分丢失，降低外界环境胁迫的渗透伤害。在植物发育过程中水通道参与多种生理过程包括气孔的关闭，器官运动，细胞伸长以及细胞分裂，而且它还在植物种子萌发，韧皮部的装卸及逆境应答等过程中调节水分跨膜快速流动，因此植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运输通道，介导胞内或胞间的水分跨膜运输，调节植物体内的水分快速平衡，对于提高植物抗盐及抗旱性可能发挥着重要作用大量的研究表明，在植物受到干早或者土壤盐渍化时，植物体就处于一种渗透胁迫的状态，而植物AQPs具有防止渗透伤害、缓冲渗透振荡、参与渗透胁迫响应等作用，调节体内外水分平衡，维持植物的正常生长发育状况，为植物抵御环境胁迫起着重要的作用。其中，转化pYES-AcAQP重组载体的酵母INVkl菌株在抗干旱和盐碱胁迫中表现出较强抗性，在众多的研究中，还未看到有关含AQP功能域的四翅滨藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆生理功能方面的相关报道。
本发明采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低温(-10°C )和盐GOOmM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用hvitrogen公司 SuperScript Full-LengthcDNA Library Construction Kit 构建全长 cDNA 文库，并通过 Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES_DEST52中，混合质粒转化酵母菌株INVkl，通过多种模拟逆境胁迫(盐碱、冻害、高温、SOS胁迫、干旱胁迫)筛选出与逆境胁迫相关的基因，为今后利用耐盐碱、干旱、冻害、SOS胁迫基因获得抗相应逆境胁迫的转基因农作物和林木奠定基础，同时也为四翅滨藜耐盐碱和耐低温分子机制研究提供依据。本发明使用酵母表达载体pYES_DEST52(购自^witrogen公司)，插入本发明 AcAQP蛋白核苷酸编码序列以及得到重组表达载体pYES-AcAQP，它除了携带有AcAQP蛋白核苷酸编码序列外，还有T7启动子、GALl启动子、CYCl终止转录信号、URA3基因、fl复制基因、PUC复制基因、酵母2 μ复制序列、氨苄青霉素抗性基因、attRl和attR2用于LR重组的重组位点、致死基因ccdB用于逆向筛选转化子、氯霉素抗性基因用于对阳性转化子的双重筛选、Vkpitope便于重组后蛋白表达检测、6xHis Tag用于重组基因纯化，以及为外源蛋白高效表达所需的各种调控元件。从四翅滨藜全长uncut cDNA文库中EST测序得到AcAQP(Atriplex canescens Aquaporin)基因，并通过Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES_DEST52中。AcAQP基因由1243个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架(Open Reading Frame) 930bp，同时还提供5，-UTR和3，-UTR序列，AcAQP为序列表中的SEQ ID NO 1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。本发明的一个目的是提供含水通道蛋白功能域的四翅滨藜中与植物抗逆相关的蛋白及其编码基因，并进行应用。本发明提供一种植物抗逆相关蛋白耐Na2C03、NaHCO3、低温和干旱等胁迫，名称为 AcAQP (Atriplex canescens Aquaporin)，一种植物抗逆相关蛋白AcAQP，其中包含如下两类蛋白质(a)由序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆相关的由序列SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。序列表中SEQ ID NO :2由311个氨基酸残基组成，其中177疏水氨基酸，134亲水氨基酸，31碱性氨基酸，22酸性氨基酸，蛋白质分子量为33. lkD，等电点为8. 29，其中富含甘氨酸(Lys)和脯氨酸。四翅滨藜AcAQP蛋白未见报道。植物抗逆性相关蛋白AcAQP的编码基因AcAQP的编码序列为序表中SEQ ID NO 1 的5’端第87-1020位脱氧核苷酸。植物抗逆相关蛋白AcAQP的编码基因AcAQP的编码序列为下列之一1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示；2)编码序列表中SEQ ID NO 2蛋白质序列的核苷酸分子；3)与1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码植物抗逆相关蛋白 AcAQP的核苷酸分子；4)在高严谨条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且编码植物抗逆相关蛋白AcAQP 的核苷酸分子；以上4)中所述高严谨条件是指可为在0. 1XSSC，0. 1% SDS的溶液中、65°C下杂交并洗膜的条件。一种重组表达载体含有植物抗逆相关蛋白AcAQP的编码基因AcAQP。一种重组菌含有植物抗逆相关蛋白AcAQP的编码基因AcAQP (以下简称编码基因 AcAQP)。为了使(a)中的AcAQP便于纯化，可在由序列表中SEQ ID NO 2示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或梭基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc—my c10EQKLISEEDL重组酿酒酵母表达载体含有编码基因AcAQP，重组酵母表达载体转化的宿主细胞为酿酒酵母INVkl。重组酵母菌株表现出抗逆性，所述酵母抗逆性具体可为对非生物胁迫的抗逆性，特别是对干旱和低温，Na2CO3, NaHCO3胁迫的抗逆性。将AcAQP导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐干旱耐盐碱能力。 图1为四翅滨藜总RNA提取图片
其中NaCl为400mM NaCl处理四翅滨藜后提取叶片和茎部总RNA电泳图；丽为 Ikb Plus 核苷酸 Ladder Marker 由核苷酸片段 10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、 300(^口、200(^ 、150(^ 、100(^ 、80(^ 、50(^ 、以及30(^ 构成，其中 3000bp 的核苷酸量为 lOOng，其余条带核苷酸量约为50ng ；Cold为_10°C处理四翅滨藜后提取叶片和茎部总RNA 电泳图。图2为cDNA文库插入片段长度PCR检测图片其中1-8，9-16为挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定结果；丽为11Λ Plus核苷酸 LadderMarker 由核苷酸片段 10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、 1500bp、1000bp、800bp、500bp、以及300bp构成，其中3000bp的核苷酸量为lOOng，其余条带核苷酸量约为50ng。图3为重组pYES-AcAQP质粒PCR扩增电泳图其中M :marker 自上到下大小为:2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp 1， 2:目的条带图4为AcAQP在GenBank中功能域比对结果图5为AcAQP与其他物种Aquaporin蛋白系统进化树图 6 为 pYES-AcAQP 和 pYES_DEST52 酵母转化图其中A为INVScl酵母菌株；B为重组质粒pYES-AcAQP转化INVScl酵母菌株；C 为INVScl酵母菌株；D为pYES-DEST52质粒转化INVScl酵母菌株。图7为pYES-AcAQP酵母阳性转化子PCR鉴定图其中M:marker 自上到下大小为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp 1， 2，3:阳性转化子目的条带图8为pYES-AcAQP酵母阳性转化子加入半乳糖诱导后生长曲线图其中横坐标表示加入半乳糖后生长时间；纵坐标表示吸光度OD6tltl值。图9为pYES-AcAQP酵母阳性转化子生长中全蛋白表达量曲线图其中横坐标表示生长时间；纵坐标表示pYES-AcIPR酵母全蛋白量。图10为pYES-AcAQP酵母和pYES_DEST52酵母各种胁迫处理效果的照片I其中A为4M KCl处理酵母效果图；B为5M NaCl处理酵母效果图；C为高温处理酵母效果图；D为低温处理酵母效果图。图11为pYES-AcAQP酵母和pYES_DEST52酵母胁迫处理效果的照片II其中A为6 % NaHCO3处理酵母效果；B为8% NaHCO3处理酵母效果；C为6% Na2CO3 处理酵母效果；D为8% Na2CO3处理酵母效果。图12为pYES-AcAQP酵母和pYES_DEST52酵母胁迫处理效果的照片III其中A为40% PEG6000处理酵母效果；B为5M山梨醇处理酵母效果；C为4mM百草枯处理酵母效果。

1. 1将含有目标基因的pYES-AcAQP接种于含有2%葡萄糖的SC-U培养基中， 30°C，过夜摇培；1. 2测算过夜菌液的0D_，保证能够使接种于50mL SC_U(含半乳糖)培养基中 OD600 等于 0. 4 ；1. 3吸出步骤2中计算的酵母细胞体积，3500rpm，5min，4°C离心，弃上清；1. 4将步骤3中的细胞重悬于50mL诱导培养基(SC-U，半乳糖)中，30°C摇培；1. 5分别在0,4,8,12，16，和24h处取出相同体积的诱导细胞，并且测量OD600值；1.6将取出的细胞3500rpm，5min，4°C离心，收集菌体；1.7弃上清，将细胞重悬于500 μ L无菌水中；1. 8将细胞转移到灭菌的1. 5mL的离心管中，12000rpm，30s，弃上清；1.9将细胞保存在_80°C，备用。2.重组蛋白定量将酵母细胞用裂解Buffer裂解之后，运用Bradford法进行总蛋白量的测定，模拟酵母细胞生长曲线和总蛋白表达曲线2. 1准备好细胞裂解液，在准备实验之前最好能够了解裂解细胞的OD6tltl ；2. 2将细胞重悬于500 μ 1裂解缓冲液中，3500rpm，5min，4°C离心，收集菌体；2. 3取出上清，然后加入适量(计算加入裂解缓冲液的体积)裂解缓冲液，使0D_ 至 50-100 ；2. 4加入等量的酸洗玻璃珠；2.5将步骤4中的处理液放在涡旋仪上涡旋lmin，冰上放置lmin，重复该步骤20 次，裂解细胞。细胞能被机械剪切力裂解，可以显微镜下边观察裂解效果；2. 6将步骤5中裂解之后混合液，12000rpm, 10s，4°C离心；2. 7将上清转移到新的1.5mLEP管中，可以用BSA进行蛋白质定量。实施例五阳性转化酵母逆境胁迫处理1.逆境胁迫前处理吸取酵母INVk 1 (pYES-DEST52)和验证正确的INVk 1 (pYES2_AcAQP)的保存菌液或者挑取单菌落，接种于SC-U液体培养基(加入终浓度2%的葡萄糖)中，30°C摇床振荡培养Mh，测量其0D_值，并用SC-U液体培养基(葡萄糖)将菌液浓度调整0D_为0. 4，体积为5mL，8000g离心lmin，加入2mL诱导培养基(SC_U+2%半乳糖)重悬菌体，接于5mL的诱导培养基中，30°C振荡培养 Mh，测量 INVkl(pYES-DEST52)和 INVScl (pYES2-AcAQP)的 0D_值，并将两种重组酵母的浓度统一调整到OD6tltl值为2，取等量的酵母，8000g离心lmin， 弃上清。对这两种酵母进行不同的胁迫处理，比较(pYES-DEST5》和INVkl (pYES2_AcAQP) 的抗性，每种实验重复3次。2.模拟逆境胁迫处理植物存在于自然界中要面对各种生物和非生物逆境，其中最主要的有以下几种 盐害(NaCl、KCl等)，碱害(Na2C03、NaHCO3等)，干旱胁迫，冻害低温胁迫，高温胁迫以及植物病原菌胁迫。在实验室条件下，运用高浓度NaCl和KCl模拟盐胁迫，运用高浓度Na2CO3和 NaHCO3模拟碱胁迫，运用PEG6000和山梨醇模拟干旱胁迫，运用低温(_20°C )模拟冷冻胁迫，运用高温(53°C )模拟高温胁迫，运用百草枯可以产生活性氧模拟植物病原微生物侵染植物过程中产生的活性氧物质从而模拟植物病原菌等生物胁迫。运用以上处理，模拟生物和非生物胁迫对转基因酿酒酵母的影响，从而评价基因对各种胁迫的应答效果(图10，图 11，图⑵。2. INaCl处理将上述菌体重悬于5mol/L NaCl溶液，混勻后30°C振动放置Mh， 然后将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μ L点样在SC-U(含 2%葡萄糖)的固体培养基上，30°C培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。2. 2KC1处理将菌体重悬于4mol/L KCL溶液中混勻，30°C振动胁迫Mh，然后将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μ L点样在SC-U(含2%葡萄糖)的固体培养基上，30°C培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。2. 3Na2C03处理将菌体分别重悬于6%和8%的Na2CO3溶液，混勻30°C振动胁迫 2h,将然后将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2 μ L直接点样在 SC-U(含2%葡萄糖)的固体培养基上，30°C恒温培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。2. 4NaHC03处理将菌体重悬于6 %和8 %的NaHCO3溶液，混勻后，30°C振动胁迫 2h,将然后将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2 μ L直接点样在 SC-U(含2%葡萄糖)的固体培养基上，30°C培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。2. 540% PEG6000处理将菌体重悬于40 %的PEG6000和5mol/L的山梨醇中， 30°C振动胁迫Mh，然后将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μ L点样在SC-U(含2%葡萄糖)的固体培养基上，30°C恒温培养48h，比较两种菌的菌落的生长差已升。2. 65mol/L山梨醇(Sorbitol)处理将菌体重悬于5mol/L的山梨醇中，30°C振动胁迫Mh，然后将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2 μ L点样在SC-U (含 2%葡萄糖)的固体培养基上，30°C恒温培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。2. 7冷冻处理将菌体重悬于SC-U液体培养基，冷冻(_20°C )胁迫48h，其间每隔 6h把菌体冻融一次。将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μ L点样在 SC-U(含2%葡萄糖)的固体培养基上30°C培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。2. 8高温处理将菌体重悬于SC-U液体培养基，53°C胁迫lh。将不稀释和分别稀释100、1000、10000倍的菌体，取2μ L点样在SC-U(含2%葡萄糖)的固体培养基上30°C 培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。2. 9百草枯(Paraquat)将菌体重悬于4mM百草枯溶液中，30°C胁迫池。将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μ L点样在SC-U(含2%葡萄糖)的固体培养基上30°C培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。其中，pYES-AcAQP转化酵母对于 4M KC1、5M NaCl、6 % NaHC03、8 % NaHC03、6 % Na2CO3,8% Na2CO3,40% PEG60005M山梨醇等逆境效果明显强于空白质粒pYES_DEST52转化酵母。


一种植物水通道蛋白及其编码基因的应用属植物基因工程技术领域，本发明提供的植物抗逆相关蛋白AcAQP包含由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成、将SEQ ID NO2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆相关的由SEQ ID NO2衍生的蛋白质；编码基因AcAQP的编码序列如下之一a.编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；b.编码SEQ ID NO2蛋白序列的核苷酸分子；c.与a核苷酸序列具有90％以上同源性且编码蛋白的核苷酸分子；d.与a的核苷酸序列杂交且编码蛋白的核苷酸分子；将AcAQP导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐干旱耐盐碱能力。