专利名称：一种细脚拟青霉诱变菌株及其培育方法细脚拟青霉PaeciAw ァces tenuipes (Peck) Samson是ー种常见的昆虫病原真菌，分类上隶属于鳞翅目半知菌亚门，丝孢纲，拟青霉属，为高雄山虫草的无性型。以天然冬虫夏草做对照分析表明，细脚拟青霉的主要化学组分如留醇类、糖醇类、生物碱、有机酸类和微量元素与前者十分相似，所含氨基酸种类亦相同，但多种氨基酸含量却高于冬虫夏草。 药理作用方面研究表明细脚拟青霉具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化和免疫调节功能，具有良好的药用前景和开发价值。在本发明中，选育了一株细脚拟青霉优良菌株，其菌丝体内多糖、甘露醇和腺苷含量均较野生型细脚拟青霉有显著提高，对其深入研究和广泛应用具有重要意义。
本发明的目的在于提供一种细脚拟青霉诱变菌株，为ー种新的菌株，其菌丝体内多糖、腺苷、甘露醇含量和野生菌相比有显著提高。本发明还提供了该菌株的培育方法，适用于エ业化生产。本发明的细脚拟青霉诱变菌株在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址 武汉武汉大学，保藏日期2011年4月28日，分类名称细脚拟青霉N45 Paecilomyces tenuipes Samson N45 ；保藏登记号为 CCTCC NO. M 2011145。本发明所述的细脚拟青霉菌株培育方法，包括以下步骤1)将细脚拟青霉原始菌株PaeciAw ァcestenuipes Samson Ptl96，接种于PDA斜面， M-26°C恒温箱中培养3-7天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为3 X IO7个/mL的孢子悬液；2)取制备得到的孢子悬液5mL，转入灭菌包装袋内进行高压处理。在温度州で、压カ 200M Pa条件下处理30min后。取高压处理后孢子悬液于无菌蒸馏水中逐级稀释，PDA培养基平板培养3-4天后，将菌株于96孔板保存；3)利用平板初步筛选生长迅速的菌株；4)将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，传代后沈で，150rpm恒温摇床中培养4天，得菌丝体，測定菌丝体干重、多糖、甘露醇、以及腺苷含量，筛选高产的细脚拟青霉菌株。5)获得的高产细脚拟青霉诱变菌株经过连续传代，培养条件为州で，150rpm恒温摇床中培养96h，測定菌丝体干重、多糖、甘露醇、以及腺苷含量，考察诱变菌株的遗传稳定性，从而最终确定目的菌株。本发明培养细脚拟青霉菌株的培养基，其特征在于是由以下药物按重量份数比制成的葡萄糖40 g/L、牛肉膏10 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、KH2PO4 0.688 g/L、 MgSO4 · 7H20 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、VB1 0.201 g/L、VB12 0.130 g/L ； 本发明所述的细脚拟青霉诱变株的特征为1)细脚拟青霉诱变菌株菌丝体干重及腺苷、粗多糖和甘露醇四种有效成分的含量与原始菌株相比均有明显提高，其中，菌体体干重达15. 83g/L，较原出发菌提高了 3. 735%;腺苷含量可达0.054 g/L，较原出发菌提高了 80% ；多糖含量可达0ル42 g/L，较原出发菌提高了 44. 15% ；甘露醇含量可达2. 019 g/L，较原出发菌提高了 78.989%。2)细脚拟青霉诱变菌株经过20次以上的连续传代培养不退化，具有遗传稳定性。本发明的积极效果在于诱变的细脚拟青霉新菌株经10次以上传代培养不退化， 具有遗传稳定性，并且胞内多糖、腺苷和甘露醇含量远远比原始菌高出许多倍。


图1、碳源对期望值的影响； 图2、氮源对期望值的影响；
图3、无机盐对期望值的影响； 图4、各因素间的响应面及等高线图； 图5、隐含层节点数与ife相关图； 图6、遗传代数与拟合值相关图。具体实施方法
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例1 :细脚拟青霉突变株的诱变和选育方法 (1) 细脚拟青霉诱变
将细脚拟青霉原始菌株PaeciAw ァCe1S tenuipes Samson Pt 196，接种于PDA斜面，26°C 恒温箱中培养5天，向斜面试管中注入无菌生理盐水1. 5mL，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为3 X IO7个/mL的孢子悬液。在无菌条件下装入铝箔聚丙烯袋中，封ロ。在温度沈。C、压カ200M 1 条件下处理30min后，取孢子悬液于无菌蒸馏水中逐级稀释，PDA培养基平板培养4天后，将菌株于96孔板保存。用灭菌的牙签将96孔板中菌株挑到PDA培养基的平板上，每板20个菌落，^TC恒温培养箱中培养3天；将生长较迅速的菌落，再次挑到 PDA培养基中，每板10株左右，26°C恒温培养箱中培养3天；将生长较迅速的菌落挑到盛有 PDA培养基的摇瓶中复苏5天；将菌株传代培养，在盛有IOOmL PDA培养基的250mL锥形瓶中，接种细脚拟青霉诱变菌株菌悬液2mL，沈。C恒温摇床中培养4d。将诱变得到的突变菌株保存于48孔板中，离心菌丝体，5000rpm，离心lOmin，水洗一次，菌丝体铺于平板冻干，冻干粉末称重，粉碎，过60目筛。(2)四种有效成分的提取及含量的測定
称取细脚拟青霉菌丝体干粉0. lg，加入5mL蒸馏水，80°C水浴浸提池，8000 g/min离心10 min，取上清測定菌丝体多糖含量。称取细脚拟青霉菌丝体干粉0. lg，加入5mL蒸馏水，45°C水浴浸提池，8000 g/min离心10 min,取上清測定菌丝体腺苷和甘露醇含量。采用蒽铜-硫酸法测定总糖含量；DNS方法测定还原糖含量，多糖含量=总糖含量-还原糖含量；采用HPLC法測定细脚拟青霉菌丝体中腺苷含量；利用分光光度法測定甘露醇含量。(3)高产诱变株的筛选
从诱变的细脚拟青霉突变体中，筛选出菌丝体干重和四种有效成分含量明显提高的优良菌株(见表1)，然后进行传代培养，每隔一代测定菌株干重及三种有效成分含量，測量方法同步骤(2)，共培养10代，考察筛选得到高产诱变株的稳定遗传特征。表1诱变菌株四项指标提高值


诱变的细脚拟青霉新菌株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，并且胞内多糖、腺苷和甘露醇含量远远比原始菌高出许多倍。