专利名称：细脚拟青霉人工培养方法及其制药用途的制作方法细脚拟青霉[Paecilomycestenuipes (Peck) Samson]是高雄山虫草(Cordycepstakaomontana Yakushiji & Kumazawa)的无性型。研究表明，细脚拟青霉的主要化学组分如甾醇类、糖醇类、生物碱、有机酸类和微量元素与天然冬虫夏草十分相似，所含氨基酸种类亦相同，但是多种氨基酸却高出冬虫夏草。药理研究表明，细脚拟青霉在体外对乙型肝炎病毒、乙醇性肝损伤、肝纤维化，体内对四氯化碳急性肝损伤有很好的防护作用，且效果比同剂量的冬虫夏草更显著，因此认为细脚拟青霉可能是肝脏组织良好的保护剂或对治疗肝脏各种疾病具有较好的辅助作用。同时细脚拟青霉人工培养物来源简单易得，可以解决天然药用虫生真菌资源稀缺，生产周期长，产量低，质量不稳定等问题。
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种细脚拟青霉人工培养方法，及其产物在制药中的用途。本发明一方面提供了一种细脚拟青霉人工培养方法，包括下列步骤I)斜面菌种制备将细脚拟青霉菌株接种到斜面培养基上，20 25°C下，培养7 10天；所述斜面培养基为PSA (马铃薯蔗糖琼脂培养基)、PDA (马铃薯葡萄糖琼脂培养基)或YMB固体培养基。2)摇瓶种子液的制备从步骤I)中制得的斜面上刮取菌丝接种到以PSB (马铃薯蔗糖液体培养基)或TOB (马铃薯葡萄糖液体培养基)为种子培养基的培养液中，24 26°C下，140 160rpm,培养3 5天即制得细脚拟青霉摇瓶种子液；3)将步骤2)中制得的摇瓶种子液按重量百分比为5% 10%接入灭菌后的PSB或PDB液体培养基为种子培养基的发酵罐中，24 26°C下，140 160rpm，培养I 2天即制得细脚拟青霉发酵罐种子液；4)将步骤3)中制得的发酵罐种子液按重量百分比为5% 10%接入灭菌后的固相培养基中，在温度为23 26°C，湿度为50 90%的条件下，静置封闭式培养30 35天；湿度优选为70-80%。5)采收。所述细脚拟青霉子实体的固相培养基的组分及各组分的重量份为大麦30-40H2O70-60用此种培养基培养出来的细脚拟青霉产量分别比用小米、小麦、大米、大麦加高粱、小麦加大麦为培养基培养的细脚拟青霉产量分别高90%、31%、200%、250%和30%。步骤I)所述菌株优选菌种保藏号为CGMCC NO. 4176的细脚拟青霉菌株。此菌种为申请人从采集的鳞翅目幼虫感病体中分离纯化后筛选获得。 该菌株已于2010年9月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 4176,分类命名为细脚拟青霉Paecilomyces tenuipes,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。经中国科学院微生物研究所形态特征鉴定，细脚拟青霉菌CGMCC No. 4176的主要形态特征为在马铃薯蔗糖琼脂培养基上菌落白色，致密，初期背面浅黄色，后期菌落上形成大量孢梗束，背面呈浅黄褐色。菌丝无色，分枝，平滑，具隔膜，宽I. 5-3. Oy m。分生孢子梗从菌丝上伸出，无色，平滑，分枝，长达110. 0 y m，宽达4. 0 y m。孢梗束白色至奶油黄色，长10-30厘米，产孢细胞瓶状，无色，2-6个簇生在孢子梗上呈帚状，顶部变细窄，5. 0-8. 0 X 2. 5-3. 2 u m。分生孢子大部分圆柱形，部分椭圆形，也有腊肠形弯曲，单孢，无色，平滑，链生，5. 0-6. 7X2. 0-2. 5 (3.0) Um0在查氏培养基上，灰白色，拱起，蓬松，绒毛状，孢梗束生长差或不长。在萨氏培养基上未见菌落生长。该菌生长最适温度为24-26°C，在pH 3-11之间均能够生长，但pH5. 0-6. 7之间生长最佳。在固体谷物培养基上发酵，菌苔灰白色，子实体(孢梗束)色泽鲜黄，生育甚佳，采收期30-40天。此菌培养产物通过分析表明，化学组分均含天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等；微量元素含钾、钙、镁、铁、锌、铜、锰、镍、硒等；此外，多糖、腺苷、甘露醇、留醇、有机酸和生物碱类与冬虫夏草活性成分上基本一致或超过冬虫夏草。优选的，步骤3)接种固体培养基后，静置固体发酵，加人工散射光源(连续增加光照强度100-150LUX)，并定时通风排气(间隔6-8小时进行通风排气，每次送风、排气30-40分钟)，调节空气中氧气、二氧化碳浓度。上述培养条件更利于形成子实体。本发明的培养方法获得的细脚拟青霉子实体，腺苷含量可达I. 4mg/g以上，虫草酸含量可达47mg/g,总糖含量可达186mg/g。本发明第二方面提供了一种细脚拟青霉人工培养产物，为上述培养方法培养后采收获得。进一步的，所述细脚拟青霉人工培养产物可以是采收获得的子实体。本发明第三方面提供了上述细脚拟青霉人工培养产物在制备预防及治疗肝脏疾病的药物或保健品中的应用。所述肝脏疾病可以是化学性肝损伤、病毒性肝炎或肝纤维化等。本发明第四方面，提供一种预防及治疗肝脏疾病的中药制剂，所述中药制剂的主要药效成分为所述细脚拟青霉人工培养产物或所述细脚拟青霉人工培养产物的有效成分提取物。本发明还提供了所述预防及治疗肝脏疾病的中药制剂的制备方法，所述制备方法选自如下方法中的任一种I)粉碎将所述细脚拟青霉人工培养产物干燥后直接粉碎，过筛制得所述中药制剂；2)将所述细脚拟青霉人工培养产物提取有效成分后干燥获得所述中药制剂。所述细脚拟青霉人工培养产物提取有效成分的方法可以采用常规的中药有效成分提取方法来提取其有效成分，如采用溶剂提取。较佳的，所述采用溶剂提取为采用有机溶剂、水或有机溶剂与水的混合液提取；所述有机溶剂可选自乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮和石油醚中的一种或多种的混合物；所述有机溶剂和水的混合溶液优选为乙醇水溶液。进一步优选为水提。较佳地，所述水提的方法为将所述细脚拟青霉人工培养产物加水煎煮(所用水量为细脚拟青霉人工培养产物重量的6-10倍)，过滤，浓缩至适量。所述煎煮次数较佳为2 3次，每次煎煮时间为15 60分钟。优选地，所述水提法中，煎煮后得到的煎液先过80目筛，抽滤除杂。优选地，所述水提法中，所述浓缩为减压薄膜浓缩。进一步的，水提法浓缩后采用喷雾干燥法干燥。本发明的中药制剂中除含有所述细脚拟青霉人工培养产物或细脚拟青霉人工培养产物的有效成分提取物外，还可含有药物可接受的载体，载体的重量百分比含量可为1-50%，优选为 20%-38%。本发明的中药制剂可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的制剂形式，包括口服制剂。优选的是胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、糖浆剂，最优选为胶囊剂。本发明的中药制剂可用于预防及治疗化学性肝损伤、病毒性肝炎、肝纤维化等肝脏疾病。安全有效、无明显毒副作用。本发明的发酵方法而获得的细脚拟青霉人工培养产物人具有产量高的优势。用此种发酵方法培养出来的细脚拟青霉产量分别比用小米、小麦、大米、大麦加高粱、小麦加大麦为培养基培养的细脚拟青霉产量高90%、31%、200%、250%和30%。细脚拟青霉的人工培育将细脚拟青霉菌株(CGMCC NO. 4176)接种到PSA斜面培养基上，23°C下，培养9天；从斜面上刮取菌丝接种到以PSA液体为基础的三角瓶液体培养基中，25 °C下，150rpm，培养3天即可制得蝉拟青霉摇瓶种子液；将细脚拟青霉摇瓶种子液按体积百分比为5%接入灭菌后的PSB液体为种子培养基的发酵罐中，25°C下，搅拌速率150rpm，培养2天即可制得细脚拟青霉发酵罐种子液；将制得的发酵液按重量百分比为10%接入灭菌后的所述固相培养基中，在温度为25°C，湿度为75%的条件下，固体发酵时，固体发酵时，增加人工散射光源(连续增加光照强度140Lux)，并定时通风排气(间隔6小时进行通风排气，每次送风、排气40分钟)静置封闭式培养33天后采收。 本实施方式所述的固体培养基配比为大麦30重量份，水为70重量份；其制备方法为将大麦和水按比例混合，高压蒸汽灭菌后，即得。实施例3细脚拟青霉的人工培育将细脚拟青霉菌株(CGMCC NO. 4176)接种到PSA斜面培养基上，24°C下，培养8天；从斜面上刮取菌丝接种到以PDA液体为基础的三角瓶液体培养基中，26°C下，160rpm,培养3天即可制得蝉拟青霉摇瓶种子液；将细脚拟青霉摇瓶种子液按体积百分比为8%接入灭菌后的PSB液体为种子培养基的发酵罐中，26°C下，搅拌速率160rpm，培养I天即可制得细脚拟青霉发酵罐种子液；将制得的发酵液按重量百分比为10%接入灭菌后的所述固相培养基中，在温度为26°C，湿度为80%的条件下，固体发酵时，固体发酵时，增加人工散射光源(连续增加光照强度130Lux)，并定时通风排气(间隔6小时进行通风排气，每次送风、排气40分钟)静置封闭式培养30天后采收。本实施方式所述的固体培养基配比为大麦30重量份，水为70重量份；其制备方法为将大麦和水按比例混合，高压蒸汽灭菌后，即得。实施例4细脚拟青霉人工培养产物的有效成分检测I、腺苷含量测定I. I仪器与试药Waters 高效液相色谱仪(1525BINARY HPLC PUMP, 2998 Photodiode ArrayDetector，美国Waters公司);SB25_12DT超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);Millipore Simplicity超纯水仪(美国Millipore公司)；乙腈(HPLC级，Fisher);磷酸二氢钾(AR级，国药集团化学试剂有限公司)；石油醚(AR级，60-90°C，国药集团化学试剂有限公司)；腺苷(A9251-1G，Sigma公司)。I. 2 方法I. 2. I色谱条件色谱柱XBridgeC18 色谱柱(Waters, 4. 6mmX 250mm, 5 u m) ;XBridgeC18Guard4. 6mmX 20mm, 5 u m ;流动相乙臆-0. 04mol/L 憐酸二氢钾(5:95);流速:1. OmT,/min ;检测波长260nm ;柱温35°C ;进样量20 u L。I. 2. 2对照品溶液的制备精密称取50mg腺苷对照品，置50mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度制成lmg/mL溶液。精密移取适量lmg/mL腺苷对照品溶液,分别配制成IOOii g/mL>50 u g/mL、30 u g/mL、10 u g/mL>5 u g/mL 和 I ii g/mL 腺苷对照品溶液,备用。I. 2. 3供试品溶液的制备精密称取I. 0118g细脚拟青霉样品粉末(实施例I采收子实体)，于IOOmL具塞锥形瓶中，加IOmL石油醚(60-90°C )，超声30min。过滤，挥干石油醚，连同滤纸一并放入瓶中。在瓶中加入20mL超纯水,称总重(包括锥形瓶重量),超声30min。快速冷却后称重，以超纯水补至总重，混匀后离心，取上清液，过针筒式滤器得样品提取液。I. 2. 4标准曲线绘制将对照品I ii g/mL、5 u g/mL、10 u g/mL、30 u g/mL、50 u g/mL、100 U g/mL 溶液进样，按I. 2. I项下色谱条件测定，以样品浓度(U g/mL)为横坐标，峰面积(微伏 秒)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。 I. 2. 5供试样品腺苷含量测定取I. 2. 3项下制备的供试样品溶液与超纯水以I :1的比例混匀，制成待测液。取待测液按I. 2. I项下色谱条件进样，由回归方程得待测液腺苷浓度X，根据下列公式得到供试品腺苷含量(mg/g)。计算公式


本发明涉及细脚拟青霉人工培养方法及其制药用途。本发明公开了一种细脚拟青霉人工培养方法，包括下列步骤1)斜面菌种制备；2)摇瓶种子液的制备；3)发酵罐种子液制备；4)接种固相培养基中，静置封闭式培养30～35天；5)采收。本发明还进一步公开了采用上述培养方法获得培养产物及其制药用途。本发明提供的细脚拟青霉培养产物，对于化学性肝损伤、病毒性肝炎、肝纤维化等肝脏疾病的发生及发展具有明显的治疗和预防作用。