专利名称：利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法木质纤维素广泛存在于植物细胞中，是自然界中含量最多的有机可再生资源，在植物体内，木质素通过化学键与半纤维素连接然后包裹在纤维素之外，形成木质纤维素，木质素与纤维素一起构成植物骨架的主要成分。木质素由于具有各种生物学稳定的复杂键型而不易被微生物降解。要解决如何高效的利用木质纤维素这个问题，关键在于如何降解包裹在纤维素晶体外面的木质素以及半纤维素，从而增加纤维素表面积、使纤维素易于降解和利用。传统的理化方法大概可以去掉50%的木质素，并使纤维成为非结晶态，但是成本较高，需要昂贵的专业设备并消耗大量的能源，而且容易造成二次污染，而生物预处理具有能耗低、操作简单以及不污染环境等优点，越来越受到人们的重视。人们发现的能降解木质素的微生物主要是真菌，关于真菌能够降解木质素，大多认为其能产生一些降解木质素酶。现有技术中研究较多，降解能力较强的酶主要有木质素过氧化酶、锰依赖过氧化物酶和漆酶。除了上述3中重要的酶外，其他的如葡萄糖氧化酶、 过氧化氢酶及一些还原酶和蛋白酶等都参与或对木质素的降解有一定的影响。现有技术中降解木质纤维素的细菌种类很多，放线菌是公认的降解能力较强的一类丝状细菌，包括链霉菌、节杆菌、小单胞菌、诺卡氏菌等。综上所述，目前人们主要集中在单个菌株的筛选，要么研究木质素降解菌，要么研究纤维素降解菌，尚未发现效果较好的复合菌群。
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法。其技术方案为一种利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法，本发明筛选了复合菌群，另外也协同白腐菌，还筛选了青贮菌群，以实现棉秆青贮，解决南疆的粗饲料不足， 变废为宝，实现种养结合的模式。包括以下步骤(1)降解棉秆木质纤维素降解复合菌系的筛选1)将从新鲜牛粪为MGO、堆肥为MGl、棉花地耕作层土壤0 40cm为MG2和瘤胃液中取来的样品为MG3，各取5g/mL加入到100ml PCS培养基中，37°C培养，静止，CO2培养箱中培养。2)待纤维素崩解以后，再转接到新鲜的PCS培养液中，接种量为10% (ν/ν)，如此转接数代，淘汰失去分解能力和不稳定的培养物，留下分解能力强的培养物，定期改变传代方法每5代，取10mL，离心3500r .mirT1,弃上清液，加IOmL无菌生理盐水，悬浮，接种到新鲜的PCS培养基上。待纤维素崩解时间稳定以后，即初步筛选到纤维素分解混合菌群。最后得到降解棉秆木质纤维素效果强、稳定的复合菌系MGO，MGl, MG2 禾口 MG3。蛋白胨纤维素培养液(PCQ改良培养基成分蛋白胨、纤维素(棉花秸秆)、酵母膏、NaCL 各 5g · Γ1，CaC032g · Λ K2HPO4、MgSO4 各 0. 5g · L—1，微量元素溶液 0. 5mL · Λ 土壤浸提液(土壤与去离子水以质量比1 1搅拌混合，过滤，灭菌后备用)100mL ·Ι^。微量元素溶液成分(g · L—1)硫酸锌0. 29,氯化钙0. M，硫酸铜0. 25，硫酸镁0. 17(2)青贮复合菌系的筛选利用MRS培养基对南疆青贮饲料、棉花秸秆与玉米秸秆混个青贮(质量比例 1 1)和棉花秸秆进行青贮，常温，青贮40d。然后称取5g青贮饲料，加入到95mL MRS培养基中进行培养，37°C，静止，(X)2培养箱中培养Mh，筛选pH快速降到4. O以下的青贮复合系。然后将PH快速下降到4以下的复合系，进行继续转代培养。直到筛选出pH快速下降到4以下的稳定的青贮复合系。MRS液体培养基(g/1):葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 25g，吐温_801mL，蒸馏水 IOOOmL, 121 °C灭菌 20min, pH 6. 2-6. 4。(3)白腐菌的培养白腐菌为黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)由新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室捐赠。培养条件37°C，PDA平板电热恒温培养箱中培养，6d，利用前制作成孢子悬浮液。PDA培养基组成·马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15 20g,自来水IOOOmL, pH自然。本发明步骤1)中所述的堆肥为牛粪、猪粪、鸡粪的混合，比例2 1 1，37°C，发酵 15d。与现有技术相比，本发明的有益效果为1、本发明具有能耗低、操作简单以及不污染环境的优点。2、本发明的技术方案是多种微生物的协同作用。3、使用本发明方法降解效果好，棉秆微生物降解启动较快，在第5d就能达到酶活最高值，说明经稀酸预处理处理的棉秆有利于微生物的降解。图1是本发明方法的流程图；图2是降解棉秆的纤维素复合菌系筛选流程图；图3是青贮复合菌系的筛选流程图；图4是白腐菌，木质纤维降解复合菌系与青贮复合菌系的复合及青贮效果评价图；图5是复合系纤维素酶活力测定结果图；图6是分解酸预处理棉秆木质纤维素复合系MGl三种酶活性动态图7是OD和pH动态变化图；图8是不同氮源对纤维素酶活性的影响图；图9是不同氮源对纤维素酶降解效果图；图10是不同温度对纤维素酶活性的影响图；图11是不同温度对纤维素酶降解效果图；图12是PH对纤维素酶活性的影响图；图13是PH对纤维素酶降解效果图；图14是接种量对纤维素酶活性的影响图；图15是接种量对纤维素酶降解效果图；图16是不同培养代数的木质纤维素降解复合菌系的DGGE ；图17是不同培养代的青贮复合菌系的DGGE。

对本发明作进一步详细地说明。参见图1-图3，一种利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法， 包括以下步骤(1)降解棉秆木质纤维素降解复合菌系的筛选1)将从新鲜牛粪为MG0、堆肥(牛粪、猪粪、鸡粪的混合，比例2 1 1，37°C，发酵15d)为MGl、棉花地耕作层土壤0 40cm为MG2和瘤胃液中取来的样品为MG3，各取5g/ mL加入到100ml PCS培养基中，37°C培养，静止，CO2培养箱中培养。2)待纤维素崩解以后，再转接到新鲜的PCS培养液中，接种量为10% (ν/ν)，如此转接数代，淘汰失去分解能力和不稳定的培养物，留下分解能力强的培养物，定期改变传代方法每5代，取10mL，离心3500r .mirT1,弃上清液，加IOmL无菌生理盐水，悬浮，接种到新鲜的PCS培养基上。待纤维素崩解时间稳定以后，即初步筛选到纤维素分解混合菌群。最后得到降解棉秆木质纤维素效果强、稳定的复合菌系MGO，MGl, MG2 禾口 MG3。PCS培养基成分蛋白胨纤维素培养液(PCQ改良培养基成分蛋白胨、纤维素 (棉花秸秆)、酵母膏、NaCL 各 5g · ΙΛ CaC032g · Λ K2HPO4、MgSO4 各 0. 5g · 微量元素溶液Ο.δπιΙ^Γ1，土壤浸提液(土壤与去离子水以质量比1 1搅拌混合，过滤，灭菌后备用)IOOmL · L—1。微量元素溶液成分(g · Γ1)硫酸锌0. 29,氯化钙0.对，硫酸铜0. 25，硫酸镁 0. 17(2)青贮复合菌系的筛选利用MRS培养基对南疆青贮饲料、棉花秸秆与玉米秸秆混个青贮(质量比例 1 1)和棉花秸秆进行青贮，常温，青贮40d。然后称取5g青贮饲料，加入到95mL MRS培养基中进行培养，37°C，静止，(X)2培养箱中培养Mh，筛选pH快速降到4. O以下的青贮复合系。然后将PH快速下降到4以下的复合系，进行继续转代培养。直到筛选出pH快速下降到4以下的稳定的青贮复合系。MRS液体培养基(g/1):葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 25g，吐温_801mL，蒸馏水IOOOmL, 121°C灭菌 20min, pH 6. 2-6. 4。(3)白腐菌的培养白腐菌为黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)由新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室捐赠。培养条件37°C，PDA平板电热恒温培养箱中培养，6d，利用前制作成孢子悬浮液。PDA培养基组成·马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15 20g,自来水IOOOmL, pH自然。图4为白腐菌，木质纤维降解复合菌系与青贮复合菌系的复合及青贮效果评价图。通过已经获得的木质纤维素降解复合菌系和青贮乳酸菌系与白腐菌进行复合以及青贮效果评价，首先进行拮抗测定，确定其无拮抗作用，然后进行混合发酵，然后进行测定相关的指标(酶活性、降解率、体外发酵、瘤胃降解率等)，确定最好的组合。复合系纤维素酶活力测定结果见图5，土壤的CMC酶活为18. 23U/mL, FPA酶活为 6. 74U/mL, β -葡萄糖苷酶 12. 67U/mL ；堆肥的 CMC 酶活 13. 91U/mL、FPA 酶活 6. 47U/mL、 β -葡萄糖苷酶11. 34U/mL ；牛粪的CMC酶活11. 95U/mL、FPA酶活8. 29U/mL、β -葡萄糖苷酶11. 03U/mL ；瘤胃液的CMC酶活12. 26U/mL, FPA酶活5. 95U/mL、β -葡萄糖苷酶酶活 11. 39U/mL。其中源自牛粪的纤维素复合系FPA酶活高于其他复合菌系，产纤维素酶能力最强。分解酸预处理棉秆木质纤维素复合系MGl三种酶活性、OD和pH动态变化，具体见图6、图7。从发酵第2d起，每天测定CMC、FPA和β -G酶活性，测定8d内微生物降解酸预处理棉秆的酶活动态变化，如图1所示。木质纤维素降解复合系MGl对酸预处理的棉秆的分解启动较快，而且酶活性变化幅度不大，而且保持较高的酶活性，可能是复合菌系MGl由多种微生物复合作用的结果，CMC和FPA酶活均于第5d出现峰值，之后酶活稍有下降，均维持在较平稳的状态，β -G酶活性在第5d酶活性较高，可能是微生物生长消耗更多的糖，减少了糖对β -G酶的抑制作用，从酶活变化角度来看，可将酸预处理棉秆的微生物降解周期控制在5d左右。这样快速启动产生糖，为乳酸菌进行半干青贮提供充足的碳源。另外，也测定了在棉秆发酵过程中的OD和pH值的变化，见图7，在第5d，OD值达到最大，PH快速下降，有助于纤维素酶的活性发挥，也有利棉秆半干青贮。单因素试验结果四种氮源对稀酸预处理棉秆木质纤维素MGl降解效果的影响采用四种不同氮源的硫酸铵、硝酸铵、尿素、和蛋白胨对酸预处理棉秆复合系MGl 降解效果的影响，结果如图8、9所示。以尿素作为氮源，能保持最高的01^ 々和0-6酶活性，且糖化率和纤维素降解率均高于其他的氮源，说明尿素能有效地促进复合系MGl产酶、 提高了棉秆的糖化率和棉秆失重率。但是，从图3也可以初步得出，FPA酶活性无机氮的效果均强于有机氮，可能无机氮有助于木质素的溶解，为纤维素酶的作用提供更多的空间。从图9，可以得出尿素为氮源的处理，糖化率和失重率明显高于其它氮源，但是硝酸铵的处理效果最差，可能硝态氮不利于复合系MGl的利用。不同温度对稀酸预处理棉秆复合系MGl降解效果的影响
从图10、11可以看出，随着温度升高，FPA酶、β-G酶活基本保持不变，维持在较高的酶活性，耐高温能力强，CMC酶的活性在32°C、37°C、42°C保持较高的活性，也就是温度对CMC酶活性影响比较大，对FPA酶、β -G酶影响不大。糖化率和纤维素降解率32°C达最高值，42°C CMC酶活、糖化率和纤维素降解率都有不同程度的提高。综合看来，32 37°C为较优的发酵温度。虽然酶活性变化不大，但是糖化率和失重率变化比较大，这可能由于温度对复合系MGl的组成有较大的影响。起始pH值对稀酸预处理棉秆复合系MGl降解效果的影响见图12、图13。从图12可看出来，pH在4. 8 6. 8之间，复合系MGl能维持较高的CMC、FPA、β -G 酶活性，pH在4. 8左右，糖化率最高，pH在5. 8左右失重率最大，且使棉秆有较高的糖化率和失重率，起始PH值调节为4. 8-5. 8之间。综合来看，故选择起始pH值5. 8为宜。三种纤维素酶的对PH的适应性较大，但是糖化率和失重率的变化较大，可能是由于复合系MGl对 PH变化比较敏感引起的。pH为5. 8时，有利于微生物的生长和产酶。接种量对稀酸预处理棉秆复合系MGl降解效果的影响从图14、15曲线变化来看， FPA酶的活性变化不大，CMC和β -G酶在和10%的接种量时活性最高。糖化率随接种量的增加一直在增加，10%的接种量，糖化率最高，5%的接种量棉秆失重率达到最大值。这可能是10%的接种量带入了更多的养分，诱导复合系MGl产生纤维素酶的能力减弱。以5.0% 接种量能获得最高的棉秆失重率和较高的糖化率，以接种量5. 0%为较优选择。稀酸预处理棉秆复合系MGl降解的正交试验结果表1复合系MGl正交试验结果
处理氮源温度PH接种量CMCaseZ(IU)FPase(IU)fi-G.(IU)糖化率％失重率°/c1111123.7812.887 6819.5916.282122221.919.5710.5123.6120.913133321.6110.3311.0223.0118.214212322.668.6010.5630.6512.665223121.026.5811.4329.7016 776231220.059.3310.4214.6210.877313220.5114 0911.6221.3114.588321323.1414 938.2625.0213 049332129.0117.748.0535.7925 34表2各处理因素对稀酸预处理棉秆复合系MGl降解效果影响的F值表
因素CMCaseZ(IU)FPasef(IU)P-G糖化失重A6. 9179**99. 0605**8. 8071=(=*30. 9462**136. 2974**B2. 03998. 2831**0. 21425.9831*63. 7649**C9. 5485**8. 2418**25. 148**115.9879**181.4213**D11. 0606**3.8666*12.0484**86. 2728**124. 4994**
注**表示影响达极显著水平(P < 0. 01)，*表示影响达显著水平(P < 0. 05)。
F值结果见表2，pH、氮源种类和接种量对CMC、FPA、β-G酶活和I套化率和失重率的
影响达到显著水平(P <0.01)，温度对FPA酶和失重率的影响达到显著水平(P <0.01)，
7对糖化率的影响达到显著水平(P < 0. 05)，对CMC、β -G酶活的影响未达到显著水平。各因素对 CMC、FPA, β -G酶活的影响
表3复合系MGlCMC酶活、FPA酶活和β-G酶活性比较


本发明公开了一种利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法，将从新鲜牛粪、堆肥、棉花地耕作层土壤0～40cm和瘤胃液中取来的样品，各取5g加入到100mLPCS培养基中，37℃密闭培养。待纤维素崩解以后，再转接到新鲜的PCS培养液中，接种量为10％(v/v)，如此转接23代，淘汰失去分解能力和不稳定的培养物，留下分解能力强的培养物，待纤维素崩解时间稳定以后，即初步筛选到纤维素分解混合菌群。本发明具有能耗低、操作简单以及不污染环境的优点。