专利名称：一种多倍体杨树的筛选方法及其专用引物的制作方法多倍体育种是植物新品种培育的重要手段，多倍体育种起源于20世纪初，现在已广泛应用于植物新品种的培育中。多倍体由于基因组倍性的增加，往往表现出形态上的巨大性和抗性增强等特点。其中三倍体还具有不育特点，可以作为转基因育种的良好材料。多倍体的上述特点在林木育种中也具有十分重要的利用价值。如南京林业大学培育的三倍体欧洲山杨，其叶和其它器官都比二倍体大，树高和胸径生长也更为迅速。据调查，在相同立地条件下，这种三倍体欧洲山杨与同龄的二倍体相比，树高超出11%，胸径超出10%，材积超出36%。再如北京林业大学朱之悌等利用天然2η花粉杂交成功选育出一批速生、质优的三倍体毛白杨新品种，表现出优异的材积生长和木材纤维性状(李云、冯大领，200幻。国外，Einspahr采用四倍体欧洲山杨与二倍体美洲山杨杂交获得了遗传增益显著的人工异源三倍体山杨，为美国杨树纸浆材新品种培育做出了重要贡献。Weisgerber等用四倍体欧洲山杨与二倍体美洲山杨杂交，选育出杂种三倍体“Astria”，这一人工三倍体树冠狭窄，适应性强，对光不敏感，比直接从山杨天然群体中选择出来的优树生长快，且抗锈病，在生产中得到广泛应用。研究表明多倍体杨树的巨大性一般会伴随木材纤维细胞增大，导致单位材积的纤维细胞数减少以及细胞表面积减小，从而使分布于细胞壁的木质素等含量降低，而纤维素含量相应增加。在造纸过程中，纤维柔软易于打浆且交织力强，纸张的抗张力、撕裂度均显示了较高的水平。同时在制浆中易于蒸煮、软化及打浆，能耗亦相对较低。在相同制浆条件下，北京林业大学报道的三倍体毛白杨磨浆能耗比普通毛白杨约低13% (康向阳，2010)。 杨柳科植物多为二倍体，但在严酷的生境条件下，多倍体杨树发生频率会增加。有研究表明，多倍体能使植物更易适应严酷的生长条件，在生活力、环境适应性、抗逆性等方面往往具有明显优势。如三倍体欧洲山杨更耐干旱瘠薄，更适宜于条件较差的山地栽植，而且还表现出较强的抗病能力(康向阳，2010)。随着一系列多倍体杨树的培育成功和在生产中的应用，多倍体杨树育种的价值逐渐显现。诸多多倍体杨树实例表明，可以通过一轮次的育种过程实现杨树多目标性状综合改良，培育出生长快、纤维长、木质素低、纤维含量高以及抗逆性强的短周期纤维工业用材品种，提高工业利用价值(康向阳，2010)。因此多倍体育种是杨树良种培育的一个有效途径。在多倍体培育方法上，一是对天然多倍体进行选择。虽然杨柳科植物多为二倍体， 但天然群体中多倍体杨树也时有发生，特别的白杨派树种多倍体发生频率相对较高，天然多倍体是多倍体育种材料的重要来源。多倍体还可以利用不同倍性的材料通过人工杂交的方法获得。另外物理或化学诱导也是获得多倍体的重要方法。但不管采用何种方法，如何从大量的材料中对多倍体进行筛选是多倍体育种中的关键技术。目前鉴别多倍体的方法有直接鉴别法和间接鉴别法两种(陈大成，2001)。直接鉴别法包括检查花粉母细胞、根尖细胞或幼叶细胞的染色体数目，直接加以判断。直接鉴别方法虽然可靠，但需对待检测材料一一进行显微镜观察，采用这一方法从大量的材料中筛选多倍体，工作量很大，效率较低。而间接鉴别主要是根据植株和花粉粒的形态特征、气孔大小、保卫细胞叶绿体数目以及生理特征等，这种方法主要依赖于经验，鉴别准确率较低。因此发展简便、高效的多倍体杨树筛选技术对加速多倍体杨树育种进程具有十分重要的意义。发明内容发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种简便、快速的多倍体杨树的筛选方法，为加速多倍体杨树育种进程，提供关键技术支撑。本发明的另一目的是提供一种上述多倍体杨树的筛选方法的专用引物。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种多倍体杨树的筛选方法，其特征在于以待筛选样品的DNA为模板，在特异性微卫星引物的引导下进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，进行基因型分析，若扩增出的等位基因数目大于或等于3个，则对应样品为多倍体杨树，否则不为多倍体杨树；其中， 特异性微卫星引物为以下12对引物中的全部引物引物对 1 :GACACCGTTTCTTTTCTGAG，ACCAGATCTTCATCTTCCAA ；引物对 2 TCGAATAGCTGGGATACTTC, TATCACCCGAACAAAAACTC ；引物对 3 TTACGATCGCCATTATGAA, TCTTTAACCTCCCCTAAACC ；
弓丨物对 4 :AACCTCCAATACCAAGATCA, TGAGAATAAATATTTCGGCAA ；
引物对 5 CCTTAGCCTTCTCACACAAC, GGTCTCCATTTTAGCTGTCA ；
弓丨物对 6 GCCCAAACTCTTATTTGATG, TGGTGGAGGCTAGGATAGTA ；
弓丨物对 7 ATTGCTCTTGCAGAAATCAT，GGATACCAAGTCATCGGTAG ；
引物对 8 :ATCAATTAGACCGGGTTTTT, TGTTCCAGTTCATGCTGATA ；
弓丨物对 9 :ATTGGTCTCGTACCCAAAA, ATTTCCAATGCATATGTTCC ；
弓丨物对 10 :AGAACTTGTGAGGCAGGTAA，AAGCTCTCCCCTAACAAAG ；
引物对 11 :TTATTTGGATCCTGAAATGG，GATGGTTCGGTATGTGAGTT ；
引物对 12 :ACAAAATTTTCGCAAGAAAG, TCTGTTCATGAGAGTGGAA。
其中，PCR反应体系为模板DNA 25ng,未标记的上游引物和FAM标记下游引物各 20ng，200uM dNTP，0. 5U Taq 聚合酶，1. 5uL 含 IOOuM pH 8.3 的 Tris-HCl、500mM KCl、20mM MgCl2和10. Og/L BSA的10 Xbuffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL。
其中，PCR反应条件为94°C预变性anin ；94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸 lmin，进行30个循环；72°C延伸5min。
其中，基因型分析在ABI3130测序仪上按如下步骤进行反应产物用灭菌去离子水1 :20稀释；取IuL稀释后的反应产物，加9uL上样缓冲液(含91%去离子甲酰胺，9% 450R0X内标)；配制好的上样产物95°C变性5min后，置于冰上迅速冷却，然后上机运行；其中，上样缓冲液含91%体积去离子甲酰胺，含9%体积450R0X内标。
当检测为多倍体杨树时，即为三倍体杨树，三倍体中若在某一位点检测到3个等位基因，说明该位点等位基因均为杂合；若检测2个等位基因，说明该位点有两个等位基因5纯合，另一个为杂合；若只检测1个等位基因，说明该位点3个等位基因均纯合。
当检测不为多倍体杨树时，即为二倍体杨树，二倍体中若在某一位点检测到2个等位基因，说明该位点等位基因杂合；若只检测到1个等位基因，说明该位点2个等位基因纯合。
一种多倍体杨树的筛选方法的专用引物，所述的专用引物是微卫星引物，为以下 12对引物中的全部引物
引物对 1 :GACACCGTTTCTTTTCTGAG，ACCAGATCTTCATCTTCCAA ；
引物对 2 TCGAATAGCTGGGATACTTC, TATCACCCGAACAAAAACTC ；
引物对 3 TTACGATCGCCATTATGAA, TCTTTAACCTCCCCTAAACC ；
引物对 4 :AACCTCCAATACCAAGATCA, TGAGAATAAATATTTCGGCAA ；
引物对 5 CCTTAGCCTTCTCACACAAC, GGTCTCCATTTTAGCTGTCA ；
引物对 6 GCCCAAACTCTTATTTGATG, TGGTGGAGGCTAGGATAGTA ；
弓丨物对 7 ATTGCTCTTGCAGAAATCAT，GGATACCAAGTCATCGGTAG ；
引物对 8 :ATCAATTAGACCGGGTTTTT, TGTTCCAGTTCATGCTGATA ；
弓丨物对 9 :ATTGGTCTCGTACCCAAAA, ATTTCCAATGCATATGTTCC ；
引物对 10 :AGAACTTGTGAGGCAGGTAA，AAGCTCTCCCCTAACAAAG ；
引物对 11 :TTATTTGGATCCTGAAATGG，GATGGTTCGGTATGTGAGTT ；
引物对 12 :ACAAAATTTTCGCAAGAAAG, TCTGTTCATGAGAGTGGAA。
在多倍体中，基因组倍性增加会导致不同基因位点等位基因数目增加。如二位体中，每一位点可检测到的等位基因数目最多为二个，而三倍体中，每一位点可检测到的等位基因数目最多则为三个。通过对不同基因位点的等位基因数目进行检测，就可以根据检测到的等位基因数，对待检样品进行多倍体筛选。通过PCR的方法对不同基因位点的等位基因进行扩增和检测，可以快速完成大量样本的检测。该方法的要素主要有二个，一是所用引物在相应扩增位点上要有高度的保守性，可以扩增出不同染色体上的同一位点的各个等位基因，即所采用的标记应呈共显性遗传。二是检测的基因位点要有高度的变异性，同一位点的不同等位基因存在可检测的变异。考虑上述要求，微卫星标记是目前不同标记类型中，用于植物多倍体筛选的最高效的分子标记。微卫星DNA也称简单重复序列，是由长度为l_6bp 串联重复序列组成，微卫星是基因组中变异最为迅速的序列，存在丰富的等位基因变异。同时微卫星标记的引物序列保守性高，一般在种的分类水平上可以通用，有些微卫星引物甚至属的分类水平上也可以通用，因此微卫星标记多呈共显性遗传。微卫星标记是基于PCR 扩增为基础的标记，微卫星标记检测还具有简便、快速的特点。
通过上面的论述，本发明开发的用于多倍体杨树筛选的微卫星引物，要求同时满足以下条件1.采用的微卫星标记应为单拷贝；2.采用的微卫星位点应为变异迅速的序列；3.采用的微卫星引物序列要有高度的保守性。4.微卫星标记的扩增产物要求谱带清晰，每一谱带与一个等位基因对应，不能有明显的“影子”谱带。如果筛选出具有上述特点的微卫星位点，就可以根据扩增产物电泳检测到的等位基因数，对多倍体进行识别。
多倍体培育方法中，通过物理或化学的方法人工诱导产生的多倍体，由于不会产生等位基因数目的增加，因此这种方法获得的人工多倍体不能通过分子标记的方法进行筛选。而天然多倍体或杂交育种产生的多倍体，都会有等位基因数目的增加，因此本发明适用于从杨树天然群体或杂交育种过程中产生的大量材料中进行多倍体筛选。
有益效果与现有的多倍体杨树筛选方法相比，本发明的突出优点包括利用12 对杨树专用微卫星引物，进行多倍体杨树筛选，检测方法操作简单、快捷，可在短时间内完成大量样品的检测，为多倍体杨树筛选提供了高效可靠技术手段。本发明为多倍体杨树育种提供了重要的技术支撑，应用前景广阔，具有很好的实际应用价值，能够产生较好的经济效益和社会效益。


图1是杨树微卫星引物对NJFUP-polyOl在9种不同杨树中的扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测图2是杨树微卫星引物对NJFUP-poly04在杨树全同胞家系子代中的扩增产物用 ABI-3730电泳产生的指纹图3是杨树微卫星弓I物对NJFUP-poly06对毛白杨进行多倍体检测产生的指纹图。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用微卫星引物合成工作由上海捷瑞生物技术有限公司完成。
实施例1
微卫星引物是杨树基因DNA序列开发而来，杨树基因DNA序列由网页:http:// shake. iRi-psf. orR/cRi-in/searchGM ？ db = Poptrl 1 下载。杨树基因的 DNA 序列由 3’-UTR区，外显子区，内含子区和5’-UTR区构成。基因内含子区序列比外显子区序列具有更高的变异频率，而外显子序列一般具有很高的保守性。基于多倍体检测分子标记应具有的特性，在标记开发过程中，首先对利用SPUTNIK微卫星序列查找程序，采用默认参数，查找出了所有基因内含子序列中含有的重复单元长度为2 5碱基的微卫星重复序列，由于这些微卫星序列位于内含子区，可确保微卫星具有较高的变异性。引物采用PRIMER5. O设计，引物设计要求引物结合序列位于外显子区，外显子序列保性很高，这样可确保引物的保守性，使开发的引物能够在杨树不同树种中成功扩增。因此采用这一策略，可同时兼顾开发出的微卫星标记即具有较高的变异性，又具有较高的通用性。通过分析，共开发了 1219个外显子-内含子复合微卫星标记。
杨树分为黑杨派(Aigeiros)、白杨派(Leuce)、青杨派(Turanga)、大叶杨派 (Leucoides)和胡杨派(Tacamahaca)。为验证引物的通用性，采集了分属其中4个派的9 种不同杨树，包括美洲黑杨(Populus deltoides,黑杨派)、欧洲黑杨(P. nigra,黑杨派)、 青杨(P. cathayana，青杨派)、小叶杨(P. simonii，青杨派)、大叶杨(P. lasiocarpa，大叶杨派)、毛白杨(P. tomentosa,白杨派)、银白杨(P. alba,白杨派)、山杨(P. davidiana,白杨派)、响叶杨(P. adenopoda,白杨派)。对采集的不同种杨树的插条在温室内扦插发叶，采集幼嫩的叶片，用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit提取DNA。提取的DNA通过微量核酸蛋白检测仪检测浓度，按50ng/ul稀释，_80°C保存备用。从开发的1219个外显子-内含子复合微卫星标记中随机选300对引物，由上海捷瑞生物技术有限公司进行了合成。利用合成的引物对上述杨树不同种的DNA进行PCR扩增，扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，确定不同引物在上述不同杨树中是否能够扩增成功。图1为杨树微卫星引物对NJFUP-polyOl 在9种不同杨树中的扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测图，图中的泳道从左至右依次为青杨、小叶杨、大叶杨、毛白杨、美洲黑杨、欧洲黑杨、山杨、响叶杨、银白杨和分子量标记。实验结果显示，合成的引物在所测的9种不同杨树树种中的扩增成功率均大于90%。
要筛选出可用于多倍体杨树检测的微卫星引物，还必须通过实验确定微卫星在杨树基因组中的拷贝数。同时由于许多微卫星引物的PCR产物往往存在一些“影子”谱带， 有时一个等位基因会对应多条电泳谱带，这样在进行自然群体材料分析时，很难根据扩增出的谱带数对等位基因数目进行准确判定。要解决这两个关键问题，需要利用全同胞家系材料来进行引物对的测试。由于杨树全同胞家系组合中，一个共显性的位点，在任一子代中亲本的两个等位基因只能出现其一，且在不同子代中两个等位基因只能交替出现。这样利用全同胞家系就能对上述信息做出准确判断，筛选出扩增谱带数与等位基因数相对应， 且为单拷贝的微卫星标记。利用这种微卫星对自然群体材料进行检测，就可以根据扩增的谱带数对检测样本的倍性做出推断。然而不同位点的杂合情况是不同的，如果所用微卫星标记在检测样本中扩增位点有两个等位基因是纯合的，则两个等位基因只能显示一条谱带，这样即使是多倍体，仅根据一对引物的扩增结果是难以检测到样本真实的倍性信息的。所以在进行样本倍性检测时要同时进行多个不同位点的检测，才能做出较为准确的判断。基于以上所述，接下来本发明采用了一个美洲黑杨和青杨的全同胞杂交组合，根据对合成引物对扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测的结果，从中选取了 180对琼脂糖凝胶电泳产物带型清晰，且在所有测试杨树不同树种中均能成功扩增的引物对，对该家系的两个亲本和 6个子代进行了 PCR扩增。PCR反应体系为模板DNA25ng，上、下游引物各20ng，0.01uL Fluorescein-12-dUTP (ImM, Roche Diagnostics)，200uM dNTP，0.5U Taq 聚合酶，1. 5uL 含 IOOuM pH8. 3 的 Tris-HCl、500mM KCl、20mM MgCl2 禾口 10. Og/L BSA 的 10 Xbuffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL ；PCR反应条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，50°C退火 30s，72°C延伸lmin，进行30个循环；72°C延伸5min。基因型分析在ABI3130或ABI3730测序仪上按如下步骤进行反应产物用灭菌去离子水1 20稀释；取IuL稀释后的反应产物， 加9uL上样缓冲液(含91%去离子甲酰胺，9% 450R0X内标)；配制好的上样产物95°C变性 5min后，置于冰上迅速冷却，然后上机运行。图2所示为杨树微卫星引物对NJFUP-poly04在杨树全同胞家系子代中的扩增产物用ABI-3730电泳产生的指纹图，图中样品1和2分别为杂交组合的母本和父本，样品3-8为杂交子代；图中不同位置的峰对应不同的等位基因，上图横坐标指示等位基因按分子量大小的电泳位置，纵坐标指示扩增位点的萤光信号强度。 根据ABI3130电泳检测到的不同引物对扩增位点等位基因的分离情况，共选取了 12对扩增产物电泳指纹清晰、呈共显性遗传且在杨树基因组中为单拷贝的微卫星引物对，对应引物对的编号和具体序列信息见序列表或表1所示。
表1微卫星引物序列详情表


本发明公开了一种多倍体杨树的筛选方法及其专用引物，该方法以待筛选样品的DNA为模板，在特异性微卫星引物的引导下进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，并进行基因型分析，若扩增出的等位基因数目大于或等于3个，则对应样品为多倍体杨树，否则不为多倍体杨树；其中，特异性微卫星引物为专用12对引物中全部引物。与现有的多倍体杨树检测方法相比，本发明利用专用微卫星引物，进行多倍体杨树筛选，检测方法操作简单、快捷，可在短时间内完成大量样品的检测，为多倍体杨树筛选提供了高效可靠技术手段，为多倍体杨树育种提供了重要的技术支撑，应用前景广阔，具有很好的实际应用价值，能够产生较好的经济效益和社会效益。