专利名称：通过柠檬酸钠的添加、加热处理及乳酸发酵来使鸡蛋蛋白质的抗原性降低的乳酸发酵鸡 ...的制作方法食物过敏(food allergy)是指免疫系统对以膳食形态进入到人体内的食物的特定物质产生过敏反应而导致各种症状，表现出哮喘、伴随瘙痒的疱疹、发热等全身症状和以过敏性肝脏弛缓综合症为代表的神经症、腹泻、腹痛、呕吐等消化系统障碍等许多病例。具有食物过敏症状的人是少数，但是甚者可能会因致过敏食品危及生命，全世界 有I亿5千万名(美国人中6 7百万名，发展中国家人口的2. 5%，韩国5% 38%)正遭这些疾病之苦。致食物过敏物质主要是食品中的蛋白质，公知的是，在美国，牛奶、鸡蛋、大豆、鱼等日常摄取的8种食品占总过敏反应的90%以上。孙大烈等人[.34(5) : 885-888(2002)][韩国食品科学会刊.34 (5):885-888 (2002)]在对韩国国内主要致过敏食品进行调查的过程中为了掌握致过敏食品，在3年的时间里以1707名为对象进行了 9054起过敏检查，结果，有11. 3%呈现出了阳性，且蛋白为336起、牛奶为266起、蛋黄为95起、大豆为76起、a -乳清蛋白为69起、酪蛋白为61起、P -乳球蛋白为58起、荞麦为39起、小麦为12起、牛肉为3起、蟹为2起、大米、虾、猪肉、鸡肉、鲭鱼各I起。其中，鸡蛋过敏为幼儿发病率最高的典型食物过敏之一，与牛奶过敏不同，鸡蛋过敏具有在成人中也有发现的特征。作为引发这种鸡蛋过敏的鸡蛋过敏原相关研究，生物化学性的解释具有进步性，公知的是，主要过敏原存在于占鸡蛋总重量的60%以上的蛋白，而蛋黄蛋白质与过敏的关联性非常低。公知的是，蛋白有20种以上的蛋白质。其中典型的是卵清蛋白(ovalbumin)、卵类粘蛋白(ovomucoid)、溶菌酶(lysozyme)。卵清蛋白(OA)(过敏原名Gal d 2)占总卵白蛋白的54%，被认为是主要过敏原。但是鸡蛋过敏患者的血中具有对卵白蛋白有特异性的IgE (免疫球蛋白)抗体而不具有对卵类粘蛋白(OM)(过敏原名Gal d I)有特异性的IgE抗体的情况下，根据即使摄取蛋白也不会引起过敏的情况等，可认为卵类粘蛋白是最主要的过敏原。卵类粘蛋白占总卵白蛋白的11%左右。由在分子内分别具有三个S-S结合的3个亚单位(subunit)构成，且高次结构不容易因热或者化学处理而遭到破坏。并且，由于具有蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的活性因而对消化酶的耐性非常强，因此认为卵类粘蛋白表现出比卵清蛋白高的过敏引发性。考虑到肠道免疫系统不够成熟而消化酶的分泌功能弱的婴幼儿大多具有鸡蛋过敏症状，而随着年龄增长，消化道的成熟，这种症状逐渐好转的现象，抗消化性高的卵类粘蛋白实际上是主要过敏原的主张具有说服力。南承延和李尚日[.33(4): 16-21(2000)][食品科学和产业.33 (4) 16-21 (2000)]在关于食物过敏的治疗和预防的报告中确认到，作为食物过敏的第一次预防法，当限制喂养母乳的女性摄取过敏性食品时，婴幼儿期间的过敏皮肤病变有所减少，并且使女性在喂养母乳的同时，限制摄取花生、坚果类、鱼贝类，根据情况还克制牛奶、鸡蛋。如此，尽管鸡蛋是称作超级食品的高营养食品，但由于致过敏的问题，成为不仅幼J L还是母乳喂养妇女都要限制食用的食物群。作为用于解决上述的问题的研究结果，韩国专利公开第2009-0079128号中公开了如下方法在鸡蛋(全卵液)添加水、葡萄糖、果糖、低聚果糖并均匀化后以85°C至100°C进行热杀菌，并进行乳酸菌发酵来制造卵类粘蛋白和卵清蛋白的抗原性降低的鸡蛋的方法；在蛋黄液添加水、葡萄糖、果糖、低聚果糖并均匀化后以75°C至100°C进行加热杀菌，并进行乳酸发酵来制造卵黄高磷蛋白和卵黄蛋白的抗原性降低的鸡蛋的方法。并且，2004年柳周贤等人曾在36 I 147-151 (韩国食品科学会刊36卷I号147-151页)中指出，酶处理虽能够降低卵清蛋白的抗原性，但是在121°C条件下进行热处理时，虽然卵类粘蛋白的抗原性降低，卵清蛋白的抗原性反而增加。虽然研究目的并非鸡蛋过敏的降低，但是有关利用鸡蛋来诱导乳酸发酵而生产乳酸发酵鸡蛋的制造工序，在韩 国专利授权第0115910号公开了如下方法，即，在鸡蛋添加1%至10%的乳糖、2%至20%的糖、100%至1000%的水后，在65°C至95°C条件下进行10分钟至120分钟的加热杀菌，接种0. 001%至2%的混合乳酸菌(I 2 :1=乳酸菌、长双歧杆菌、链球菌)后，在30°C至50°C条件下培养5小时至24小时，并使其发酵来制造鸡蛋乳酸菌发酵饮料，但是可以知道该方法在其目的、工序、效果上区别于本发明，具有明显的差别。另一方面，公知的是，发酵乳制品弱化或去除了引起过敏的蛋白质的抗原性，姜根玉[ 19(3): 296-300(2006)][韩国食品营养学会刊.19(3):296-300(2006)]在利用免疫分析法评价发酵乳制品的过敏原性的研究中指出，为了测定饮用乳、奶粉、发酵乳中的牛奶过敏原的P -乳球蛋白(BLG),使用免疫印迹(blotting)及间接竞争酶联免疫吸附试验(ciELISA)并进行免疫印迹(Immunoblotting)的结果,发酵乳中未出现与牛奶过敏患者的IgE的反应，而奶粉和饮用乳中却出现了反应，用多克隆抗体及牛奶过敏患者的IgE测定BLG含量的结果，饮用乳最高，而发酵乳最低。作为用于去除发酵乳中也残存的抗原性的努力的一环，韩国公开专利第2007-0071535号公开了在牛奶蛋白质添加规定量的蛋白分解酶并使之发酵的、抗原性降低而没有苦味的发酵乳的制造方法。但是，上述的以往的技术不能同时降低对于公知为鸡蛋的主要过敏原的卵类粘蛋白和卵清蛋白的抗原性，由于热处理温度过高，而以蛋白质的热变性为起因的溶解度的降低且难以保障优秀的感官特性，热处理温度低时，具有乳酸菌的增殖不顺畅且感官特性也差的问题。并且，与牛奶不同，市面上还没有普及降低或去除了过敏成分的鸡蛋。
技术问题 本发明的发明者为了解决上述的问题而研究努力的结果了解到，在鸡蛋添加规定量的糖、水还有盐类并在特定的温度条件下进行热处理后接种复合乳酸菌发酵剂(starter)并在适当的条件下进行乳酸发酵时，可以生产出鸡蛋蛋白质的抗原性降低的同时感官质量和溶解性优秀的乳酸发酵鸡蛋，从而完成了本发明。因此，本发明的目的在于提供一种作为鸡蛋蛋白质的主要过敏原的卵白蛋白特别是卵类粘蛋白和卵清蛋白的抗原性同时减少且感官质量提高的乳酸发酵鸡蛋及其制造方法。技术方案 作为达成上述的目的的一例，本发明的蛋白质的抗原性降低的乳酸发酵鸡蛋的制造方法，其特征在于，包括以下步骤相对于100重量份的均匀过滤的全卵液，添加100重量份至200重量份的纯净水、25重量份至35重量份的糖类、0. 4重量份至0. 5重量份的柠檬酸钠，并进行混合来形成混合物的步骤；在72°C至83°C的范围内对上述混合物进行10分钟至20分钟的加热处理的步骤；相对于上述混合物接种0. 0001重量％至0. 01重量％的乳酸菌，在38°C至42 °C条件下使其发酵5小时至7小时的步骤。作为达成上述目的的另一例，本发明包括如下的乳酸发酵鸡蛋，该乳酸发酵鸡蛋通过上述方法制造而成，且蛋白质的抗原性降低，溶解性优秀，风味有所改善。 下面，以乳酸发酵鸡蛋的制造方法为主，按各步骤，对本发明进行具体说明。首先是在全卵液添加纯净水、糖类、柠檬酸钠并进行混合来形成混合物的步骤，在将全卵均匀化并过滤来去除卵带后的全卵液添加纯净水和糖类，而添加纯净水、糖类及柠檬酸钠并进行混合。上述纯净水是为了抑制鸡蛋的加热处理引起的蛋白质的热凝固现象而添加的，相对于100重量份的全卵液,可以使用100重量份至200重量份范围内的纯净水。通过添加上述糖类能够提高随着加热处理产生的蛋白质热凝固的温度，因而能够抑制热凝固现象引起溶解度降低等现象，上述糖类优选为使用葡萄糖、果糖及低聚果糖的混合物。相对于100重量份的全卵液,可以使用25重量份至35重量份的范围内的上述糖类，具体地优选为使用包括5重量份至8重量份的葡萄糖、15重量份至20重量份的果糖及5重量份至7重量份的低聚果糖的糖类混合物。在本发明中除了上述的纯净水和糖类以外，添加柠檬酸钠作为盐类，这是一个技术结构上的特征。这样的盐类的使用在以往用于抑制鸡蛋的过敏抑制的研究中未曾有过，也完全没有为了制造乳酸发酵鸡蛋而添加盐类的事例。并且，本发明中使用上述的柠檬酸钠，因此即使加热处理温度低，当乳酸发酵时对乳酸菌的发育的贡献也高，因而能够制造出乳酸菌含量高的产品，并能够降低抗原性，显著改善产品的风味。就这样的朽1檬酸钠而言，相对于100重量份的全卵液,优选为使用0. 4重量份至0. 5重量份范围内的柠檬酸钠，以达成所追求的目的。第二是对上述混合物进行加热处理的步骤。鸡蛋混合物的加热处理是用于进行下一步骤即乳酸发酵的前处理，通过上述加热处理，来杀灭可能包含在鸡蛋的沙门氏菌等阻碍乳酸发酵或者影响风味及健康的菌。在本发明中，上述加热处理在72°C至83°C范围内进行，如果加热处理温度小于上述范围，则具有杀菌效果不充分的倾向，如果大于上述范围，则由于鸡蛋蛋白质的热变性引起的凝固导致溶解度降低，因而具有对利用上述鸡蛋混合物的二次产品的活用度降低的倾向，并且影响风味。第三是使上述加热处理后的鸡蛋混合物进行乳酸发酵的步骤。在通过上述加热处理杀菌后的鸡蛋混合物接种乳酸菌并使其发酵，此时乳酸菌接种量优选为相对于鸡蛋混合物重量的0. 0001重量％至0. 01重量％。作为乳酸菌，优选使用包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)及嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus )的混合乳酸菌发酵剂，它们的混合比率优选为如下嗜酸乳杆菌20重量％至30重量％、保加利亚乳杆菌20重量％至30重量％、长双歧杆菌20重量％至30重量％、嗜热链球菌20重量％至30重量％。接种上述乳酸菌后在38°C至42°C条件下发酵5小时至7小时。通过上述方法制造的乳酸发酵鸡蛋表现出被认为是鸡蛋过敏的主要过敏原的卵类粘蛋白和卵清蛋白的抗原性同时显著降低、风味得以改善、乳酸菌含量丰富的特征。依据如上所述的本发明，对在鸡蛋添加规定量的纯净水、糖类，并在此添加规定量的柠檬酸钠而成的混合物进行加热处理、乳酸发酵，从而能够得到鸡蛋的蛋白的典型过敏引发蛋白质即卵类粘蛋白和卵清蛋白的抗原性显著降低或得以去除的乳酸发酵鸡蛋，往后期待在给认为鸡蛋是过敏引发食品而忌讳摄取的许多幼儿及一般消费者提供不必顾虑过 敏而可以摄取鸡蛋的机会的方面，其价值受到认可。有利的效果 依据上述的本发明，能够用简单的方法制造出就以往公知的蛋白的抗原性通过加热处理、糖类及盐类的添加、乳酸菌发酵等使卵类粘蛋白和卵清蛋白的抗原性同时显著降低的乳酸发酵鸡蛋。并且，依据上述的本发明，可以提供不仅能够排除鸡蛋的过敏，通过乳酸菌发酵还能够同时提供摄取大量乳酸菌的机会的乳酸发酵鸡蛋。 并且，依据上述的本发明，去除过敏引发性的同时能够供应乳酸菌,从而能够提高鸡蛋的附加价值，因而能够期待贡献于相关产业的效果。并且，依据上述的本发明，具有不仅给成人，而且还给怕过敏的幼儿及儿童提供鸡蛋产品的优点。
本发明中使用的鸡蛋是韩国圃木园(Pulmuone)公司的“吃牧草长大的健康的鸡所生的鸡蛋 ”，葡萄糖、果糖及低聚果糖从韩国三养健能仕(Samyang Genex)株式会社购买使用，乳酸菌发酵剂是通过韩国S厂家进口使用。标准品卵类粘蛋白(ovomucoid, 0M)、卵清蛋白(ovalbumin,0A)使用西格玛(sigma)公司产品(美国圣路易斯(St. Luis,USA)),其他试剂以柳周贤等人[ 32: 720-725(2000)][韩国食品科学会刊 32
720-725 (2000)]的情况为准使用。实施例I.
打20个鸡蛋(规格特卵)并以不引起严重起泡的方式实现均匀化，在70目(mesh)网筛过滤得到去除卵带后的全卵液1000g。在此添加1700g纯净水、60g葡萄糖、180g果糖、55. 2g低聚果糖、4. 5g朽1檬酸钠制成鸡蛋混合物,在75°C条件下进行15分钟的热处理后立即冷却到40°C，按相对于上述鸡蛋混合物重量为0. 01重量％即0. 3g的量接种由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)25。/。、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)25%>长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) 25%、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)25%比率形成的混合乳酸菌发酵剂，在40°C的恒温器培养6小时并进行乳酸发酵后立即冷却到4°C以下来制造出鸡蛋蛋白质的抗原性显著降低的乳酸发酵鸡蛋3000g。作为参考，如此生产的乳酸发酵鸡蛋经ciELISA试验的结果，与生鸡蛋相比，卵类粘蛋白(OM)的抗原性降低到1/52500以下，卵清蛋白(OA)抗原性降低到1/7400以下。实施例2.
打20个鸡蛋(规格特卵)并以不引起严重起泡的方式实现均匀化，并在70目(mesh)网筛过滤得到去除卵带后的全卵液IOOOg。在此添加纯净水1700g、葡萄糖60g、果糖180g、低聚果糖55. 2g、朽1檬酸钠4. 5g制成鸡蛋混合物,在80°C条件下进行15分钟的热处理后立即冷却到40°C，按相对于上述鸡蛋混合物重量为0. 01重量％即0. 3g的量接种由嗜酸乳杆 菌(Lactobacillus acidophilus)25。/。、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)25%>长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) 25%、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)25%比率形成的混合乳酸菌发酵剂，在40°C的恒温器培养6小时并进行乳酸发酵后立即冷却到4°C以下来制造出鸡蛋蛋白质的抗原性显著降低的乳酸发酵鸡蛋3000g。作为参考，如此生产的乳酸发酵鸡蛋经ciELISA试验的结果，与生鸡蛋相比，卵类粘蛋白(OM)的抗原性降低到1/150000以下，卵清蛋白(OA)抗原性降低到1/10000以下。比较例I.
打鸡蛋并均匀化，在IOOOg去除卵带后的全卵液添加1700g纯净水、60g葡萄糖、180g果糖、59. 7g低聚果糖后，在各温度条件下进行15分钟的热处理后冷却到40°C，并按相对于总重量为0. 01重量%即0. 3g的量接种由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)25%、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus) 25%、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum) 25%、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 25%比率形成的混合乳酸菌发酵齐U，在40°C下培养6小时来结束乳酸发酵并立即在4°C以下的条件下进行冷却并保管的同时利用ciELISA调查OM及OA的抗原性变化。比较例2.
制造出在与上述实施例I中使用的鸡蛋相同的鸡蛋包含相对于鸡蛋重量为相同重量份的0. 45重量份的柠檬酸钠0. 45g，制造出未进行加热处理及乳酸菌发酵的鸡蛋混合物并使用于各比较实验。比较例3.
将与上述实施例I中使用的鸡蛋相同的鸡蛋(生鸡蛋)使用于各比较实验。实验例
I.鸡蛋的热处理及乳酸发酵
从鸡蛋中得到全卵液后均匀化，用70目(mesh)网筛过滤并去除卵带后，与上述实施例I相同地在此添加纯净水、葡萄糖、果糖及低聚果糖，针对添加与实施例I等同量的柠檬酸钠(实施例I)或不添加(比较例I)制造而成的鸡蛋混合物，按不同温度(65°C至100°C)分别进行15分钟的热处理，并冷却到40°C，按相对于鸡蛋混合物总重量为0. 01重量％的量接种由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) 25%、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)25%、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)25%、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus) 25%比率形成的混合乳酸菌发酵剂,并在40°C培养6小时来结束乳酸发酵，之后立即在4°C以下的条件下进行冷却并保管的同时公开于试验。另一方面，在与上述实施例I中使用的鸡蛋相同的鸡蛋，添加相对于鸡蛋重量为相同重量份的0. 45重量份的柠檬酸钠0. 45g，制造出未进行加热处理及乳酸菌发酵的鸡蛋混合物(比较例2)并使用于各比较实验。并且，准备与上述实施例I中使用的鸡蛋相同的鸡蛋(生鸡蛋)(比较例3)使用于各比较实验。.对卵清蛋白(0A)、卵类粘蛋白(OM)具有特异性的特异抗体的生产在憐酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline, PBS :0. OlM憐酸盐缓冲剂+0. 138M的NaCl、0. 0027M的KCL)准备lmg/ml的OA或者OM作为抗原后，与弗氏完全佐剂(Freund’scomplete adjuvant)以I :1混合来制造出乳液,将该乳液按每次Iml的量给兔子进行皮下注射。以两周为间隔共实施5次免疫。但从第二次开始使用弗氏不完全佐剂(Freund’sincomplete adjuvant)作为佐剂(adjuvant)。免疫I周后进行采血并聚集抗体效价高的抗血清在接下来的实验中用作特异抗体。.间接竞争ELISA (ciELISA)
利用ciELISA来调查抗原反应。被包被(coating)在微板(Microplate)的抗原使用标准蛋白质OM或者0A，浓度则利用包被缓冲液(coating buffer)(三羟甲基氨基甲烷0. 05M，pH 9. 0)稀释到2 u g/ml，并对每个微板孔板(well)分别分配100ML，在4°C条件下放置一晚。将此利用洗漆缓冲液(washing buffer)(吐温_20磷酸盐缓冲盐水0. OlM磷酸盐缓冲剂+ 0. 138M的NaCUO. 0027M的KC1、0. 05%的吐温-20)清洗3次之后，往孔板放入将生鸡蛋或者在上面制造出的乳酸发酵鸡蛋与特异抗体以I: I混合而成的溶液100ML来诱导竞争反应。此时使用的特异抗体是将在前面制造出的抗0M、抗OA抗血清稀释5000倍左右并分别使用的。在室温中反应I小时后利用洗涤缓冲液清洗3次后在此添加100ML羊抗兔IgG-HRP偶联物(goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate),在常温下反应I小时。反应后利用前面的方法清洗3次之后在此添加100ML基质溶液(0. 01%四甲基联苯胺溶于pH为5. 0的磷酸盐缓冲液、0. 001% H2O2)并反应30分钟后添加50ML的2M H2S04使反应停止，并使用酶标仪(microplate reader) (Emax,美国分子仪器公司)在450nm条件下测定吸光度。将对利用上述间接竞争ELISA试验的IC50值评价的生鸡蛋及乳酸发酵鸡蛋在不同加热处理条件下针对标准蛋白质OM及OA的抗原性变化结果见表I和表2。.抗原性照射
为了检查上面制造出的乳酸发酵鸡蛋的抗原性变化，分别求出从上述ciELISA的结果处理的鸡蛋的 IC50 (半抑制浓度The half maximal inhibitory concentration)值和处理后鸡蛋的IC50值之后，利用将前者除以后者而得的相对数值调查了抗原性的变化。表I


本发明涉及一种通过柠檬酸钠的添加、加热处理及乳酸发酵来使鸡蛋蛋白质的抗原性降低的乳酸发酵鸡蛋及其制造方法，更详细地涉及一种，由在全卵液添加规定量的纯净水、糖类及柠檬酸钠并进行加热处理及乳酸发酵的一系列步骤构成的鸡蛋蛋白质的抗原性降低的乳酸发酵鸡蛋及其制造方法。依据本发明，可以提供作为鸡蛋内存在的过敏引发因子的卵类粘蛋白和卵清蛋白的抗原性降低、溶解性优秀、感官质量良好的乳酸发酵鸡蛋及其制造方法。