专利名称::一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法技术领域:。:番茄黄化曲叶病毒(TomatoYellowLeafCurlVirus,TYLCV)隶属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)0大多数Begomovirus包含2个闭合环状单链、大小为2.5-3.OKb基因组,即DNA-A和DNA-B组份;少数仅含有一个DNA-A组份,其基因组结构相当于双组份病毒的DNA-A。DNA-A编码6个0RF,分別是位于病毒链上的Vl基因(编码外壳蛋白capsidprotein,CP)、V2基因(编码移动蛋白movementprotein,MP)以及位于互补链上的Cl基因(编码复制起始蛋白implicationinitiatorprotein,Rep)>C2(^^transcriptionalactivatorprotein,TrAP)>C3基因(编码复制增强蛋白implicationenhancerprotein,REn)和C4基因(编码的蛋白參与病毒的系统运动或症状形成);在基因V2与Cl之间有非编码区(intergenicregion,IR),该区含有病毒复制和转录所需的调控元件,包括茎环结构域和保守的9碱基TAATATTAC序列等。DNA-B编码的蛋白涉及到病毒的移动,其中病毒链编码的BVl是ー个核穿梭蛋白(Nuclearshuttleprotein,NSP),具有结合DNA的活性,能够促进病毒DNA在细胞核与细胞质之间进行穿梭运动;互补链上的BCl编码MP,參与病毒的胞间移动(CzosnekHandGronenbornB.ihetomatoyellowleafcurlvirusgenomeandfunction01itsproteins.TomatoYellowLeafCurlVirusDisease,2007:67-84).感染TYLCV番茄早期主要表现为植株生长迟缓或停滞,节间变短,明显矮化,叶片变小,变厚,叶质脆硬,有褶自皮,向上卷曲,变形,叶片边缘至叶脉区域黄化,以植株上部叶片症状典型,下部老叶症状不明显;植株感病后期坐果很少,果实变小,膨大速度极慢,成熟期的果实不能正常转色,致使番茄品质下降,基本失去商品价值,产量減少,甚至绝收,给当地番茄生产造成巨大的损失(赵统敏,余文贵,杨玛丽,赵丽萍,季英华,周益军.番茄黄化曲叶病毒病在江苏的暴发与综合防治.江苏农业科学,2008:114-115)。ITLCV通过烟粉虱以长久方式传播。烟粉虱繁殖力强且极易产生抗药性,如片面施用化学农药往往在1-3年后难以防治,而且该虫寄主广泛,几乎涵盖所有常见蔬菜、多种花卉等作物,要将TYLCV限制在ー个地点和阻止其传播与扩散有很大难度。同时ITLCV危害重,又几乎无药可治,因此培育抗ITLCV优良品种,是消除ITLCV威胁的主要策略。目前,抗TYLCV的基因仅在醋栗番茄(LvcopersiconDiiminellifoliim)、播M芳口(Lycopersiconperuvianum)、多毛畨カロ(Lycopersiconnabrochaites)、智利备芳ロ(LycopersiconcAi^ewseノ禾ロ契5^尼播安口{Lycopersiconcheesmanii)ぜ近缘野生禾中中发现,在番茄栽培种中还未发现。番茄栽培种与野生种杂交才可获得抗TYLCV的番茄栽培种质,但这需要大量且长期的选育和鉴定工作(JiY,ScottJ,HansonP,GrahamΕ,MaxwellD.Sourcesofresistance,inheritance,andlocationofgeneticlociconferringresistancetomembersofthetomato—infectingbegomoviruses.iomatoYellowLeafCurlVirusDisease,2007:343-362)。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解,产生干扰小RNA(siRNA),这些siRNA与同源的靶RNA互补结合,特异性酶降解靶RNA,从而抑制、下调基因表达。RNAi是普遍存在于动物和植物界的一种防御反应,已经发展成为基因治疗、基因功能研究和植物新种质创制的有效的方法。因此,利用RNAi技术特异地对抗番茄黄化曲叶病毒,可以培育抗TYLCV番茄。
技术领域:。该方法将TYLCV的V2和C1基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体,通过农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体,转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携带TYLCV的烟粉虱接种病毒后都表现对TYLCV抗性,未观察到明显的发病症状。本发明利用RNAi技术可以培育抗TYLCV番茄转基因株系,为防治TYLCV提供了技术支持。文档编号A01H5/00GK102533853SQ20121005173公开日2012年7月4日申请日期2012年3月2日优先权日2012年3月2日发明者余文贵,张保龙,朱成松,杨郁文,赵统敏,陈天子申请人:江苏省农业科学院
一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法
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