专利名称：乳腺癌骨转移病变前期JAGGED1的mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用的制作方法根据国内外权威机构提供的资料，我国毎年癌症的新增人数260万，死亡人数近 210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400 多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是ー组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万(贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万)，700多万患者，毎年的花费是1. 4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家単位做了ー个年度报告，对 1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性(多态性);2.肿瘤細胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学)等。同吋，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖类激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技木)指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这ー界定科学性是不够严谨的，从細胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤細胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止 2亿个肿瘤細胞，从癌变前期到单克隆癌細胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和単独的病灶，可能癌細胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同吋，其它癌細胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以 2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶吋，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晩期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进歩。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平)上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)前，就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位杂交技木，选择多组临床标本(癌症病人、高危人群、正常对照)，对JAGGED1基因与乳腺癌骨转移的早期预警进行检测分析。晩期乳腺癌患者体内的癌細胞经常可以通过在整个身体内部迁移而产生恶性骨肿瘤。普林斯顿大学的科学家通过对ー种名为“Jaggedl”的信号传导蛋白的研究，发现了肿瘤細胞如何破坏骨骼的分子机制，从而开启了可以阻断这种破坏性过程的药物治疗的大门。“迄今为止，针对此类病人我们还没有太多的治疗方法。虽然医生能够控制这些骨癌的症状，但是除此之外毫无办法。根据临床资料统计分析大约有70% 80%的晩期乳腺癌患者其乳腺癌转移到骨头中，此外，它们还可能转移到大脑、肺部和肝脏等部位。在晩期列腺癌、和皮肤癌患者当中，这种转移性骨癌也是非常普遍的。研究表明，乳腺肿瘤細胞通过细胞信号过程能够给骨細胞错误的指令，从而对病人产生致命后果。人体内十亿细胞必须通过ー系列信号传导的联系才能得以正常发育并有效地维持正常的生理机能。在运作这一过程的复杂系统当中，細胞信号发挥着重要的作用，但是对于肿瘤病人而言，信号分子与接收信号的分子之间的联系出现了错误。在健康人中，溶骨细胞每天会溶解一小部分旧的骨骼，并由成骨細胞合成补充新的骨骼，从而保持骨骼的健康和功能。在骨转移中起破坏性作用的“Jaggedl”信号分子被癌細胞用来激活骨細胞中的Jaggedl信号通路，过度增强了溶骨細胞的破骨功能，同时让成骨细胞释放ー种叫IL-6的肿瘤生长因子，从而达到破坏骨骼并促进癌細胞生长的目的。骨骼被溶解过程中释放出的另ー种称为TGF-beta的生长因子能够进一歩促使癌細胞高度表达Jaggedl，最终形成一个恶性循环。这ー发现将为癌細胞研究人员提供一个明确的目标，即研究ー种可以抵消Jaggedl的破坏能力以阻止其干扰骨骼正常功能的方法。”这ー研究已受到乳腺癌研究和治疗的同行们的广泛关注。美国纽约斯隆 凯特林癌症研究中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)乳腺癌研究医师Jacqueline Bromberg认为这ー发现前景光明。她说“骨转移在晩期乳腺癌患者中极为常见，虽然有许多方法例如抑制雌性激素、辐射和化疗等方法可以放慢肿瘤的生长，但是目前还是没有有效的根除癌症骨转移的治疗方法。”美国印第安納大学医学院肿瘤学教授 Theresa Guise认为“这ー发现充分展示了肿瘤細胞和骨細胞之间的相互作用，其意义非常重大。”阻止这ー破坏性通路是治疗转移性骨癌的方法之一，停止这ー过程的关键是必须找到抵消Jaggedl信号分子或其受体Jaddedl的方法。本发明的实验研究证明，在乳腺癌原位(无骨转移现象)与乳腺癌伴有骨转移(晩期)及正常对照人群Jaggedl基因的mRNA表达量有明显不同。将JAGGED1的mRNA作为早期筛查乳腺癌骨转移变前期有非常重要的临床诊断意义。JAGGED1的mRNA在乳腺癌骨转移变前期及癌变过程中高表达。他作于前列癌变前期筛查、及乳腺癌骨转移术的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。发明人在长期的研究中，得出了ー种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特別是筛选临床标本(正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者)，突破了正常组织与肿瘤4组织比较的ー贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的mRNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。目前对JAGGED1基因的研究都采用高通量基因芯片和蛋白谱分析技木，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测mRNA比基因分析更科学(DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性体现)，比蛋白分析更可靠(mRNA与蛋白转录有时候不同歩)。 根据现有的文献资料Jaggedl基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。本发明人在针对创新性发明的要求，设计了乳腺癌骨转移患者、高危人群(未婚高龄女性)、正常女性对照不同数据例組，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上乳腺癌骨转移症病人JAGGED1基因高表达，高危人群有不同程度表达15-2596，正常女性都是低表达。 表明JAGGED1基因乳腺癌骨转移变前期筛查的重要标志物。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与細胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技木。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织細胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫細胞化学方法对标记探针进行探測，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、 cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有$、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。 但不论哪ー种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织細胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针(mRNA)和检测的靶mRNA是采用碱基互补(杂交互补)的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响(因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上)。鉴于目前临床上癌症的诊断(影像医学和生化指标物都是肿瘤形成后的诊断)是晚期诊断，治疗也是晩期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到癌前变mRNA水平量化改变技木，做了创新性的技术突破，提供癌前变mRNA水平筛查技木。使临床上有了一项新的癌前变mRNA水平真正早期筛查的技木，为临床癌症的诊治争取时间和空间。
本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。其次，本发明还要提供上述试剂盒用干与乳腺癌骨转移变前期筛查及术复发、转移早期预警相关的原位杂交检测方法。为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针如SEQ ID NO. 1所示序列，是JAGGED1基因序列中间一段碱基序列，2000到2800bp， JAGGED 1基因序列号NM_000214，如SEQ ID NO. 2所示序列，JAGGED 1基因的RNA序列的核苷酸序列长度是5988bp，CDS是517. . 417!3bp，位于染色体20pl2. 1-pll. 23〃上。(在探针标记过程中如果基因序列太长，超过IOOObp以上，我们会用CDS的序列来设计探针，如果CDS 的序列也超过IOOObp以上，会采用基因的中间一段碱基序列来合成探针，碱基序列不少于 500bp，探针合成后要做序列检测，并对功能进行临床意义的分析)。本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。本发明的癌变前期JAGGED1基因筛查试剂盒应用价值在干，能在mRNA水平，对乳腺癌骨转移变前期筛查，及癌变后或术后复发、转移、扩散发生预警，进ー步配合临床治疗。本发明还提供ー种JAGGED1基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤(1)在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测 RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16 — 24小吋。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自乳腺癌骨转移患者、乳腺癌骨转移高危人群、乳腺癌骨转移症好发家族、健康女性。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的癌症高危人群、癌症好发家族、乳腺癌骨转移患者。本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以JAGGED1基因的一级转录功能产物mRNA为检测对象，合成探针是JAGGED1基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白細胞或组织細胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供 JAGGED1基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常女性JAGGED1基因低表达，即小量显色，JAGGED 1基因在乳腺癌骨转移病人和正常女性有显着差异，该基因的表达量比正常女性表达量都高。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C);
7).仪器自动弃去液体，自动清洗；
8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10).取出封片镜检。本发明的一个优选实施例的方案是以JAGGED1基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白細胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的細胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技木，该方法通过检测底物細胞中的 JAGGED1基因表达量，用来确定乳腺癌骨转移病理演变前期的mRNA变化量，预警乳腺癌骨转移变是否发生及乳腺癌骨转移患者术后是否复发、转移的预测。因为JAGGED1基因在正常女性中低表达，如果JAGGED1基因表达量高，说明有癌变骨转移的风险，说明癌細胞骨转移已发生，或癌症病人术后已经复发、转移，从而获得癌症的诊断信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。本发明具有如下有益效果
本发明的临床意义是更早期跟踪检测乳腺癌骨转移变发生和病理演变过程中JAGGED1 基因mRNA表达量的变化，预警乳腺癌骨转移发生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测与癌症标志物，以及影像医学检查有显着不同。本发明可以在基因转录的ー级功能产物mRNA水平检测JAGGED1基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床乳腺癌病患ー个真正的早期骨转移预警以及治疗后转移复发及早预测。 这样才有可能实施癌症的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治乳腺癌骨转移恶疾。此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同吋，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。


图1是本发明JAGGED 1基因原位杂交技术流程图。图2是本发明实施例中乳腺癌骨转移病人JAGGED1表达降低图片。图3是高危人群图片。图4是本发明实施例中正常人JAGGED 1表达图片。

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以JAGGED1基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中 本实施例的探针标记物选用地高辛。试剂盒杂交液組成
配制试剂使用浓度
1).将IOX缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成IX缓冲液I；
2).将20X缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2 X缓冲液II ；
按1:100稀释成0.2X缓冲液II ；按1:200稀释成0. IX缓冲液II ；
3).将10X缓冲液III用三蒸水按1 10稀释成1X缓冲液III ；
4).IOX缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10!11レ加水至IOOmL即可)。 实施例2
应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本JAGGED1基因表达量的实施过程
1).取待测标本两张；
2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μ L加IX缓冲液I 99. 9ml，即为使用浓度)50 ml，37°C水浴预热lOmin，放进16张玻片，37°C处理12 min,再用IX缓冲液I洗5min ；
3).用O. 2 %的保护液(保护液1 m 1加1 X缓冲液
I ’ 99ml即为使用浓度)洗lOmin，三蒸水洗5min(以上过程都在玻璃缸进行)，取出玻片， 让其自然干燥；
4).将玻片放入保湿盒内，加预杂交液25μ L/片(加在有細胞的地方)，盖上盖玻片， 盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中汕以上；
5).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%、90%、95%的乙醇各洗aiiin， 取出，自然干燥；
6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μ L/片，另一张加反义杂交液25 μ L/ 片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；
7).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，毎次15min ； 在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，毎次15min ； 在42°C恒温水浴箱中用0. IX缓冲液II洗两次，毎次15min ；
8).用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9)·将玻片放入保湿盒内，加0. 5%封闭液(Iml封闭液加5ml 1 X缓冲液III) 100 μ L/ 片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。(此步骤不需加盖玻片)；
10).取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；
11).将玻片放入保湿盒内，加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml 1 χ缓冲液III) 100 μ L/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性(此步骤不需加盖玻片)；
12).取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，毎次15min;
13).用IX缓冲液IV洗anin，加显色剂(显色剂A73.3yL，显色剂B157. 5yL加到 30mL IX缓冲液IV中，混勻)，室温避光16h到18h以上；
14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混勻)封片镜检。本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针， 将探针与人体白細胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的細胞数，判断目的基因的表达量。乳腺癌骨转移病人20名，高危(未婚高龄女性)20名，正常对照组20名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白細胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者JAGGED1基因表达量高，細胞深染；高危人群表达稍降低，小数染色；正常对照组JAGGED1基因表达量低， 細胞多数不染色，具体结果见图2、图3、图4。


本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与乳腺癌骨转移早期病理演变有密切相关的信号传导蛋白(Jagged1)基因与的mRNA方法，包括以下步骤(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测JAGGED1基因的表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期mRNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。