专利名称：用于预测三阴性乳腺癌对疗法的应答的方法用于预测三阴性乳腺癌对疗法的应答的方法 与相关申请的交叉引用本申请要求2010年I月12日提交的美国临时申请Νο·61/294，433、2010年4月19日提交的美国临时申请No. 61/325，624、2010年4月27日提交的美国临时申请No. 61/328，602和2010年6月4日提交的美国临时申请No. 61/351，838的优先权，就所有目的而言，上述申请的公开内容均通过引用以其整体并入本文。细胞中信号转导的过程负责多种生物学功能，包括但不限于细胞分裂和死亡、代谢、免疫细胞活化、神经传导和感官知觉，等等。因此，细胞中正常信号转导中的错乱(derangements)可导致大量疾病状态，例如糖尿病、心脏病、自身免疫和癌症。一种被良好表征的信号转导通路是MAP激酶通路，其负责从表皮生长因子(EGF) 转导信号以促进细胞中的细胞增殖(见PCT公开No. W02009/108637的图1，就所有目的而言，该文本公开内容通过引用以其整体并入本文)。EGF与和酪氨酸激酶连接的跨膜受体(表皮生长因子受体，EGFR)结合，其通过EGF的结合而被活化。EGF与EGFR的结合活化了受体胞质结构域的酪氨酸激酶活性。该激酶活化的一种后果是EGFR在酪氨酸残基上的自身磷酸化。活化的EGFR上经磷酸化的酪氨酸残基提供了含有SH2结构域的适体蛋白(例如GRB2)结合的停泊位点。在其作为适体的功能方面，GRB2还通过GRB2上的SH3结构域与鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS结合。EGFR-GRB2-S0S的复合体的形成导致鸟嘌呤核苷酸交换因子的SOS活化，这促进了⑶P从Ras移除。⑶P移除之后，Ras结合GTP并且成为活化的。活化之后，Ras结合至并活化RAF激酶(丝氨酸/苏氨酸特异性的蛋白质激酶)的蛋白质激酶活性。之后是蛋白质激酶级联的活化，导致细胞增殖。概括之，RAF激酶之后对MEK (另一丝氨酸/苏氨酸激酶)磷酸化和活化。激活的MEK使得有丝分裂原活化的蛋白质激酶(MAPK)磷酸化和活化。通过MAPK进一步磷酸化的靶包括40S核糖体蛋白S6激酶(RSK)。MAPK对RSK的磷酸化导致RSK活化，其进而磷酸化核糖体蛋白S6。MAPK的另一已知靶是原癌基因c-Myc，这是对于细胞增殖来说重要的基因，其在多种癌症中突变。MAPK还磷酸化并活化另一蛋白质激酶MNK，其进而磷酸化转化因子CREB。间接地，MAPK还调控Fos基因的转录，Fos基因编码涉及细胞增殖的另一转录因子。通过改变此类转录因子的水平和活性，MAPK将来自EGF的起初的细胞外信号转导为对于细胞周期进程来说重要的基因的改变的转录。鉴于信号转导通路在细胞生长中扮演的重要角色，很多癌症是因信号转导组分的突变和其它改变(导致细胞增殖通路的异常活化)而产生的也就不出人意外了。例如，EGFR的过表达或过高活性已与大量癌症相关，包括多形性胶质母细胞瘤、结肠癌和肺癌。这已促使了针对EGFR的抗癌治疗剂的发展，包括用于肺癌的吉非替尼和埃罗替尼(erlotinib)和用于结肠癌的西妥昔单抗(cetuximab)。西妥昔单抗是单克隆抗体抑制剂的例子，其与EGFR的细胞外配体结合结构域结合，由此阻止了活化EGFR酪氨酸激酶的配体的结合。相反，吉非替尼和埃罗替尼是抑制细胞内定位的EGFR酪氨酸激酶的小分子。不存在激酶活性的情况下，EGFR不能在酪氨酸残基处经历自身磷酸化(这是结合下游适体蛋白(例如GRB2)的前提条件)。通过停止生长依赖于该通路的细胞中的信号级联，肿瘤增殖和迁移被减弱。此外，其它研究已显示，人黑色素瘤中的大约70%和其它肿瘤的较小比例具有Raf基因中的点突变(V599E)，这导致MAPK通路的持续活化(见例如Davies等，Nature,417 :949-954(2002))。此类结果表明，特定信号转导通路中的突变可能是特定类型的肿瘤特征性的，并且，此类特别的、改变的信号转导通路可以是化疗介入的有希望的靶标。鉴于不同癌症治疗(特别是癌症化疗)可通过分别封闭或活化涉及细胞增殖或死亡的细胞信号转导通路来直接或间接地发挥功能，给定信号转导通路在特定癌症形式中的活性可用作为多种癌症治疗效力的良好指示。因此，除了满足其它需求，本发明还提供了预测和评价针对个体患者的潜在抗癌疗法的有效性的方法。由此，本发明提供了辅助医师针对每名患者以正确剂量和正确时间选择合适的癌症疗法的方法
本发明提供了用于检测肿瘤细胞(例如三阴性乳腺肿瘤细胞)中信号转导通路的组分的状况(例如表达和/或活化水平)的组合物和方法。源于本发明的实践的关于信号转导通路的组分的表达和/或活化状态的信息可用于癌症诊断、预后和用于对癌症治疗的设计。在一些特定的方面，本发明提供了能使得可测定或预测特定癌症是否能应答于或者是否可能有利地应答于一种或更多种抗癌药物的分子标志物(生物标志物)，所述抗癌药物例如贝伐单抗(bevacizumab) (Avastin )、卡钼和紫杉醇(例如Abraxane .或nabP)的组合(“三联疗法”)。如本文所述，已经令人吃惊地发现,生物标志物(例如VEGFR2、c-KIT、HERl和IGF-1R)特别有用于测定或预测肿瘤细胞(例如三阴性乳腺肿瘤细胞)对抗癌疗法(例如二联疗法)的灵敏性、效力或应答。在一个方面，本发明提供了用于测定三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性的方法，所述方法包括 (a)裂解肿瘤细胞，产生细胞提取物； (b)测定细胞提取物中VEGFR2、c-KIT.HERl和/或IGF-IR的表达水平；以及 (c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的参照表达水平相比较，
其中较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HERl表达的高水平和/或IGF-IR表达的低水平的存在指示肿瘤细胞对抗癌药物敏感。在一些实施方式中，本发明的方法可用于协助或辅助测定或预测三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性。在其它一些实施方式中，本发明的方法可用于改进对三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性的测定或预测。在另一方面，本发明提供了预测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的方法，所述方法包括
(a)裂解从三阴性乳腺肿瘤获得的肿瘤细胞，以产生细胞提取物；
(b)测定细胞提取物中VEGFR2、c-KIT.HERl和/或IGF-IR的表达水平；以及(C)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、C-KIT、HERl和/或IGF-IR的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的参照表达水平相比较，
其中较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HERl表达的高水平和/或IGF-IR表达的低水平的存在预示对使用抗癌药物的疗法的应答。在一些实施方式中，本发明的方法可用于协助或辅助测定或预测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答。在其它一些实施方式中，本发明的方法可用于改进对三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的测定或预测。在另一方面，本发明提供了用于监测具有三阴性乳腺肿瘤并接受抗癌药物的受试 者中对使用抗癌药物的疗法的应答的方法，所述方法包括
(a)裂解从三阴性乳腺肿瘤获得的肿瘤细胞，产生细胞提取物；
(b)测定细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的表达水平；以及
(c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的参照表达水平或与VEGFR2、c-KIT, HERl和/或IGF-IR在疗法期间较早时间的表达水平相比较；以及
(d)基于步骤(C)中的比较确定是否应当继续或调节使用抗癌药物的疗法。在一些实施方式中，本发明的方法可用于协助或辅助监测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答。在其它一些实施方式中，本发明的方法可用于改进对三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的监测。在某些实施方式中，步骤(d)中对疗法的调节包括改变抗癌药物的之后剂量或选择备选抗癌药物。本发明的其它目的、特征和优点对于本领域技术人员而言根据以下详细描述和图将是显而易见的。
附图简述图I显示了用于分析总的和经磷酸化的HERl和HER2水平的示例性玻片形式(slide formats)的阵列设计。图2显示了用于检测磷酸化的HERl的示例性接近检验(proximity assay)的示意图。G0，葡糖氧化酶；HRP，辣根过氧化物酶。图3显不了协同酶增强反应性免疫检(Collaborative Enzyme EnhancedReactive ImmunoAssay, CEER)的示意图，其也被称为协同接近免疫检验(CollaborativeProximity ImmunoAssay, COPIA)。当与细胞裂解物孵育之后,祀蛋白与硝酸纤维素表面印制的特异性捕获抗体结合时，未结合的非靶蛋白从玻片上被移除。针对被捕获的靶蛋白上备选表位的检测抗体之一与GO缀合。另外的与HRP缀合的检测抗体的结合完成了免疫复合体的形成，所述检测抗体特异于靶蛋白上磷酸化位点(P)或另外的非重叠表位(P)，所述免疫复合体是信号产生和随后存在葡萄糖时酪胺介导的经由GO-HRP酶通道的信号扩增所必需的。选择捕获和检测抗体以最小化它们之间的竞争(即，所有抗体可同时结合信号转导蛋白上它们的相应表位)。图4显示了针对ERBB2-T和ERBB2-P从CEER产生的滴定曲线。这些值被用作为标准以产生针对临床样品的定量值。图5显示了对ΒΤ474细胞中t_ERBB2的测定。使用从BT474细胞制备的细胞裂解物进行ERBB2-CEER检验。从含有 25个BT474细胞的裂解物测定全长pl85_ERBB2检验，通过分析免疫磁性移除P185-ERBB2后从 250个BT474细胞制备的细胞裂解物，测定t-ERBB2的水平。图6显示了 t-ERBB2在患者肿瘤中的表达和磷酸化。ERBB2、t_ERBB2、磷酸化的t-ERBB2。阵列构型被示出。CEER不仅允许对临床样品中全长和截短的ERBB2表达的区分，还以定量方式提供了对磷酸化水平的有价值信息。图7显示了针对临床样品的针对ERBB2的示例性IP-Western。抗-ICD-ERBB2抗体被用于免疫沉淀ERBB2受体，以及使用第二抗-I⑶-ERBB2抗体进行随后的Western杂交印迹分析，以将全长t-ERBB2与全长pl85-ERBB2区分开。图8显不观察到174BCA样品中宽范围的通路蛋白表达和活化。图9显示了较之对照T47D乳腺癌细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)而言在三阴 性乳腺癌核心活检样品上通过CEER描绘的功能性通路谱的例子。图10显示了针对每种标志物针对低和高的样品组在无进展生存期(ProgressionFree Survival, PFS)之间的比较的结果。图11显示了针对每种标志物针对低和高样品组在PFS之间的另一比较的结果。图12显示测量c-KIT和VEGFR2两者的表达水平增加了在TNMBC中测定对三联疗法的应答的预示价值。图13显示测量VEGFR2和HERl两者的表达水平增加了在TNMBC中测定对三联疗法的应答的预示价值。图14显示了 (A)总VEGFR2、(B)总c-KIT和(C)总HERl的增加的水平和对三联疗法的应答之间的关联。就所有目的而言，来自PCT公开No. WO 2010/132723的图和表通过引用以其整体并入本文。
发明详述
I.导论如上文所述，涉及细胞增殖的信号转导通路的活化和涉及细胞死亡的途径的去活化是表征很多不同类型癌症的分子特征的非限制性例子。在很多情况下，特定信号转导通路及其组分的活性可用作为给定类型的癌症的分子标识。此类活化的组分可进一步提供用于治疗性介入的有用靶标。因此，在治疗之前、期间和之后了解癌细胞内特定信号转导系统的活性水平为医师提供了可用于选择采用的适当疗程的高度相关的信息。此外，随治疗进程对在癌细胞中有活性的信号转导通路的持续监测可为医师提供关于治疗效力的额外信息，促使医师继续特定疗程或转向另外的治疗方向，例如当癌细胞通过活化相同或另外的信号转导通路的其它异常而对治疗已呈耐药性时。因此，本发明提供了用于在特异性的、多重、高通量检验中检测一种或多种去调控的(deregulated)信号转导分子在肿瘤组织或肿瘤外细胞(例如实体瘤的稀少的循环细胞)中的表达和/或活化状态的方法和组合物。本发明还提供了用于选择用以下调或关闭去调控的信号通路的适当疗法(单一药物或药物组合)的方法和组合物。因此，本发明可用于帮助设计用于癌症患者的个性化疗法。在某些实施方式中，通过在单一细胞的水平上测定信号转导通路的活性来检测和鉴定循环中肿瘤细胞的能力是本发明的重要优点。在多种癌症早期阶段的患者血液中经常发现为“微转移灶(miCTometastases) ”(弥散肿瘤细胞)的肿瘤细胞，肿瘤细胞也被发现于转移性癌中。血液中肿瘤细胞的数目将取决于肿瘤的阶段和类型。典型地在原发肿瘤上获得活检，而大多数转移性肿瘤没有被活检，使得对此类肿瘤样品的分子学分析非常困难。在肿瘤转移期间，最具侵略性的肿瘤细胞离开原发肿瘤，移动经过血液和淋巴系统，到达远处。因此，来自血液的循环中的肿瘤细胞代表了肿瘤细胞的最具侵略性和纯系的群体。但是，血液中转移性肿瘤细胞的数目经常非常低，在每毫升血中以一至数千个细胞间变动。在此类稀少的细胞中分离和检验信号转导通路的能力以及将该信息应用至更有效的癌症治疗的能力是本发明的一个目的。在一些特定的实施方式中，本发明的多重、高通量免疫检验(例如协同酶增强反应性免疫检验(CEER)，也被称为协同接近免疫检验(COPIA))可以在单个细胞水平上检测从肿瘤组织(例如FNA样品)获得的细胞中或实体瘤的在循环中细胞中一种或更多种信号转导分子的表达和/或活化水平。事实上，可以以大约1(Γ19摩尔(lOOzeptomoles)的灵敏性以及大约1(Γ19摩尔(lOOzeptomoles)至大约1(Γ13摩尔(IOOfemtomoles)的线性动态范围，检测信号转导分子(例如EGFR)。由此，对肿瘤细胞中一种或多种信号转导子表达和/或活化水平的单个细胞检测有利于癌症预后和诊断，以及对个性化靶标疗法的设计。 关于乳腺癌，目前的测试选项不令人满意，因为在乳腺癌患者中对原发和转移性肿瘤的治疗基于从疾病早期阶段采集的活检样品所进行的一次性诊断。特别地，针对乳腺癌早期和转移阶段的治疗性介入单纯基于疾病早期阶段采集的活检样品的最初诊断，因为从转移性的癌症患者获得活检样品是不切实际的。但是，乳腺肿瘤作为时间和治疗的函数改变，使得对乳腺肿瘤的时间性监测对于乳腺癌患者的最优管理来说非常关键。例如，受体酪氨酸激酶的ErbB(HER)家族中的一种或更多种的活化状态的变化可影响复发时的疗法选择。事实上，原发和转移性癌之间HER-2状况的不一致性是常见的，因为全部乳腺癌患者中可以有多达37%从HER-2阴性原发肿瘤变为HER-2阳性转移癌。此外，患者可由于HER-I和/或HER-2活化而具有对激素疗法的原发性(de novo)耐药性或发展出对激素疗法的获得性耐药性。在一些情况下，患者可由于存在表达P95HER-2的肿瘤细胞而具有对靶向ErbB的疗法的原发性耐药性或发展出对靶向ErbB的疗法的获得性耐药性。结果，对于用于辅助临床医师在适当的时间开适当癌症疗法的处方的检验存在尚未满足的临床需求，因为目前的技术缺乏灵敏性和特异性，不能用于监测接受疗法的患者，并且没有利用通路谱，以指导个体化的治疗决定。与目前可获得的乳腺癌测试选项相反，本发明的方法使得能在疾病的所有阶段监测乳腺癌患者，这通过使用来自肿瘤和/或来自血液的循环中的肿瘤细胞(CTC)的样品例如细针抽吸物(FNA)提供实体乳腺肿瘤的“实时活检”来实现。作为非限制性的例子，本文描述的乳腺癌检验可在疾病早期阶段在患者中进行乳腺癌的最初诊断。通过使用本文描述的单项检测和接近双重检测检验(例如CEER)，描绘使用或不使用抗癌药物时一种或更多种特别的信号通路的表达和/或活化水平，来指导对合适的癌症疗法的选择。有利地，本发明的方法还可用于监测疾病的进程和/或衰退，因为治疗性介入可基于在疾病的任何阶段采集的样品，并可使用本文描述的单项检测和接近双重检测检验(例如CEER)对其加以分析。由此，对用于乳腺癌的早期和转移阶段的合适癌症疗法的预测、鉴定和/或选择由特别的信号通路分子的表达和/或活化状况的分析和实时诊断来指导。本发明的方法可有益地被定制，以解决癌症管理中的关键问题，并且为乳腺癌患者(例如三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)患者)提供更高标准的护理，因为它们(I)提供了增加的灵敏性(例如可实现单个细胞检测，以检测总的和/或磷酸化的信号转导分子，例如HERl (EGFR)、VEGFR2和/或c_KIT)；⑵提供了增加的特异性(例如，三抗体接近检验增强了用于检测总的和/或磷酸化的信号转导分子的特异性)；(3)使得能进行通路描绘(例如可在来自患者的FNA或CTC中检测一种或更多种特别的信号转导分子的表达和/或活化状态)；以及(4)消除了关于获得患者样品的任何问题(例如，检验可在数个肿瘤细胞上进行)。虽然在本文描述的新颖的检验中可使用任何样品，但是CTC是特别有用的，因为它们代表着最具有侵略性的肿瘤细胞，每种肿瘤都已知会释放CTC，它们可能是残余肿瘤或难于接近的转移性肿瘤的唯一来源，并且它们可被发现于血液中。由此，在某些实施方式中，本发明的方法使得能对乳腺肿瘤组织进行依序采样，产生作为时间和疗法函数的、在肿瘤细胞中发生的变化的有价值的信息，并且为临床医师提供监测迅速进化中的癌症通路标识的手段。
总结之，本发明的方法通过使用多重、基于抗体的单项检测或接近检验，在肿瘤细胞上进行通路描绘，有利地提供了对最可能受益于靶向疗法的癌症患者(例如TNMBC患者)的精确选择和监测。
II.定义除非另有指明，在本文中使用时，下述术语具有归于它们的含义。术语“癌症”意欲包括特征在于异常细胞不受控制的生长的疾病类别的任何成员。该术语包括所有已知的癌症和赘生物病况，无论是被表征为恶性、良性、软组织或实体的，以及所有阶段和级别的癌症，包括转移前和转移后的癌症。不同类型的癌症的例子包括但不限于，乳腺癌；肺癌(例如非小细胞肺癌)；消化道和肠胃癌症，例如结直肠癌、胃肠道间质肿瘤、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌和胃(stomach，也作gastric)癌；食道癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；卵巢癌；肾癌(例如肾细胞癌)；中枢神经系统的癌症；皮肤癌；淋巴瘤；绒毛膜癌；头颈癌；骨原性肉瘤和血癌。在本文中使用时，“肿瘤”包含一种或更多种癌性细胞。在一种优选的实施方式中，乳腺肿瘤源于具有侵入性或原位形式的乳腺管癌和小叶癌的受试者。在另一优选的实施方式中，乳腺肿瘤源于具有复发性或转移性乳腺癌的受试者。术语“分析物”包括其存在、量(表达水平)、活化状态和/或身份被测定的感兴趣的任何分子，典型地是大分子，例如多肽。在某些情况下，分析物是信号转导分子，例如HERl(EGFR)、VEGFR2 或 c-KIT。术语“信号转导分子”或“信号转导子”包括进行下述过程的蛋白质和其它分子，通过所述过程，细胞将细胞外信号或刺激转化为应答，典型地，涉及细胞中生物化学反应的既定顺序。信号转导分子的例子包括但不限于受体酪氨酸激酶，例如，EGFR(例如EGFR/HER I/ErbB K HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4), VEGFRI/FLT I, VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR(例如 PDGFRA、PDGFRB)，c-KIT/SCFR，INSR(胰岛素受体)，IGF-IR, IGF-IIR, IRR(胰岛素受体相关的受体)，CSF-1R，FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4,TRK A-C, c-MET，RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYR03, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2,RET, c-ROS, V-钙粘蛋白，LTK(白细胞酪氨酸激酶)，ALK(间变型淋巴瘤激酶)，ROR 1-2,MUSK，AATYK 1-3和RTK 106 ;受体酪氨酸激酶的截短形式，例如没有氨基末端细胞外结构域的截短的HER2受体(例如p95ErbB2 (p95m)、pllO、p95c、p95n等等);受体酪氨酸激酶二体(例如 p95HER2/HER3、p95HER2/HER2、HER2/HER2、HER2/HER3、HER1/HER2、HER2/HER3、HER2/HER4 等等);非受体酪氨酸激酶，例如 BCR-ABL，Src, Frk, Btk, Csk, Abl，Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack和UMK ;酪氨酸激酶信号级联组分，例如AKT (例如AKT1、AKT2、AKT3)，MEK (MAP2K1)，ERK2 (MAPKl)，ERKl (MAPK3)，PI3K (例如 PIK3CA (pi 10)，PIK3R1 (p85))，PDKl，PDK2，磷酸酶和张力蛋白同源体(PTEN)，SGK3，4E-BP1，P70S6K(例如p70S6激酶剪接变体α I)，蛋白酪氨酸磷酸酶(例如 ΡΤΡ1Β、PTPNl3, BDPl 等等)，RAF，PLA2，MEKK, JNKK, JNK,p38, She (p66)，Ras (例如 K-Ras，N-Ras，H-Ras)，Rho，Racl, Cdc42, PLC, PKC, p53,细胞周期蛋白Dl，STAT1，STAT3，磷脂酰肌醇4，5- 二磷酸(PIP2)，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)，mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-I, NOS, GSK-3 β，RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67和桩蛋白(paxillin);核激素受体，例如雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)，雄激素受体，糖 皮质激素受体，盐质皮激素受体，维生素A受体，维生素D受体，类维生素A受体，甲状腺激素受体和孤儿受体(orphan receptors);核受体共活化因子和阻遏因子,例如分别在乳腺癌-I(AIBl)和核受体共阻遏因子I(NCOR)中扩增的；以及它们的组合。术语“活化状态”指特定信号转导分子是否被活化。类似地，术语“活化水平”指特定信号转导分子被活化的程度。活化状态或水平典型地对应于一种或更多种(例如多种)信号转导分子的磷酸化、泛素化和/或复合化的状态或水平。活化状态的非限制性例子(括号中列出的)包括HERl/EGFR(EGFRvIII，磷酸化的(p-)EGFR，EGFR :Shc，泛素化的(u-)EGFR，p-EGFRvIII) ;ErbB2 (p_ErbB2，p95HER2 (截短的 ErbB2)，p-p95HER2，ErbB2 Shc,ErbB2 PI3K, ErbB2 EGFR, ErbB2 ErbB3, ErbB2 ErbB4) ；ErbB3(p-ErbB3, ErbB3 PI3K,p-ErbB3 PI3K, ErbB3 Shc) ；ErbB4(p-ErbB4, ErbB4 Shc) ；c-MET(p-c-MET, c-Met :HGF 复合体)；AKT1 (p-AKTl) ;AKT2 (p-AKT2) ; AKT 3 (p-AKT 3) ；PTEN(p-PTEN) ；P70S6K (p-P70S6K)；MEK(p-MEK) ;ERK1(p-ERKl) ；ERK2(p-ERK2) ；PDK1(p-PDKl) ；PDK2 (p-PDK2) ；SGK3(p-SGK3)；4E-BP1 (P-4E-BP1) ；PIK3R1(p-PIK3Rl) ;c_KIT (p-c-KIT) ；ER(p-ER) ;IGF-lR(p-IGF_lR,IGF-IR IRS, IRS :PI3K，p-IRS，IGF-IR PI3K) ； INSR (p-INSR) ；FLT3 (p-FLT3)；HGFRl(p-HGFRl) ；HGFR2(p-HGFR2) ；RET(p-RET) ；PDGFRA(p-PDGFRA) ；PDGFRB(p-PDGFRB)；VEGFRl(p-VEGFRl, VEGFRl PLC y，VEGFRl Src) ；VEGFR2(p-VEGFR2, VEGFR2 PLC y，VEGFR2 Src, VEGFR2 硫酸肝素，VEGFR2 VE-钙粘蛋白)；VEGFR3(p_VEGFR3)；FGFRl(p-FGFRl) ；FGFR2(p-FGFR2) ；FGFR3(p-FGFR3) ；FGFR4(p-FGFR4) ；TIE1 (p-TIEl)；TIE2(p-TIE2) ；EPHA(p-EPHA) ；EPHB(p-EPHB) ;GSK_3β (p-GSK-3β) ;NFKB(p-NFKB)，IKB(p-IKB, p-P65 IKB) ；BAD (p-BAD, BAD :14-3-3) ；mT0R (p-mT0R) ;Rsk_l(p-Rsk-1)；Jnk(p-Jnk) ；P38 (p-P38) ；STAT1 (p-STATl) ；STAT3 (p-STAT3) ；FAK (p-FAK) ；RB(p-RB)；Ki67 ；p53 (p-p53) ；CREB(p-CREB) ；c-Jun(p-c-Jun) ；c-Src(p-c-Src);桩蛋白(p-桩蛋白);GRB2(p-GRB2)，She (p-Shc), Ras(p-Ras)，GABl (p-GABl)，SHP2(p_SHP2)，GRB2 (p-GRB2)，CRKL (p-CRKL)，PLC y (p-PLC y ), PKC (例如 p-PKC a，p-PKC β，p-PKC δ )，内收蛋白(p-内收蛋白)，RBl (p-RBI)和 PYK2 (p-PYK2)。在本文中使用时，术语“稀释系列”意欲包括特定样品(例如细胞裂解物)或试剂(例如抗体)的一系列递减浓度。稀释系列典型地通过下述过程产生将经测量的量的起始浓度的样品或试剂与稀释剂(例如稀释缓冲液)混合，以产生更低浓度的样品或试剂，以及重复该过程足够的次数以获得合意的数目的系列稀释液。样品或试剂可以被稀释至少2、
3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500或 1000 倍，以产生包含至少 2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或 50 种递减浓度的样品或试剂的稀释系列。例如，包含起始浓度为lmg/ml的捕获抗体试剂的2倍系列稀释液的稀释系列可通过下述过程来产生将一定量的起始浓度的捕获抗体与等量的稀释缓冲液混合，以产生O. 5mg/ml浓度的捕获抗体，以及重复该过程，以获得O. 25mg/ml、0. 125mg/ml、O. 0625mg/ml、0. 0325mg/ml等等的捕获抗体浓度。术语“优越动态范围(superior dynamic range) ”在本文中使用时指用于在少至一个细胞或在多至数千细胞中检测具体待分析物的检验的能力。例如，本文描述的免疫检验具有优越动态范围，因为它们有利地使用捕获抗体浓缩物的稀释系列在大约1-10，000个细胞(例如大约 1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500 或 10，000 个细胞)中检测目的特定信号转导分子。术语“样品”在本文中使用时包括从患者获得的任何生物样本。样品包括但不限于全血、血浆、血清、血红细胞、白细胞(例如外周血单核细胞)、导管灌洗液(ductal lavagefluid)、乳头抽吸物、淋巴(例如淋巴结的弥散肿瘤细胞)、骨髓抽吸物、唾液、尿、大便(即粪便)、痰、支气管灌洗液、泪液、细针抽吸物(例如通过随机乳晕细针抽吸物收获的)，任何其它体液，组织样品(例如肿瘤组织)例如肿瘤(例如针吸活检)或淋巴结(例如前哨淋巴结活检)的活检，组织样品(例如肿瘤组织)例如肿瘤的手术切除，以及它们的细胞提取物。在一些实施方式中，样品是全血或其级分，例如血浆、血清或细胞沉淀团。在某些情况下，样品是通过使用本领域已知的任何技术将实体瘤的循环中细胞与全血或其细胞级分分离来获得的。在其它一些实施方式中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织样品，例如来自乳腺实体瘤的。“活检”指移出组织样品以用于诊断或预后评价的过程，以及指组织样本本身。本领域中已知的任何活检技术都可用于本发明的方法和组合物。应用的活检技术将通常取决于待评价的组织类型以及肿瘤的尺寸和类型(即，实体或悬浮的(即血或腹水))，其它因素等等。代表性的活检技术包括切除活检(excisional biopsy)、切口活检(incisionalbiopsy)、针吸活检(例如,核心针吸活检、细针抽吸物活检等等)、手术活检以及骨髓活检。活检技术被例如讨论于 Harrison’ s Principles of Internal Medicine, Kasper 等编著，第16次编辑，2005，第70章以及部分V通篇中。本领域技术人员将知道，可进行活检技术来在给定的组织样品中鉴定癌和/或前癌细胞。在本文中使用时，术语“循环中细胞”包含已从实体瘤转移或微转移的肿瘤外细胞。循环中细胞的例子包括但不限于循环中的肿瘤细胞、癌干细胞和/或迁移至肿瘤的细胞(例如循环中的内皮祖细胞、循环中的内皮细胞、循环中的前血管形成髓样细胞(circulating pro-angiogenic myeloid cells)、循环中的树突细胞等等)。含有循环中细胞的患者样品可从任何可取得的生物液体(例如全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物等等)获得。在某些情况下，全血样品被分离为血浆或血清级分以及细胞级分(即，细胞沉淀团)。细胞级分典型地含有血红细胞、白细胞以及实体瘤的循环中细胞，例如循环中的肿瘤细胞(CTC)、循环中的内皮细胞(CEC)、循环中的内皮祖细胞(CEPC)、癌干细胞(CSC)、淋巴结的弥散肿瘤细胞及它们的组合。此外，血浆或血清级分通常含有实体瘤的循环中细胞释放的蛋白质和核酸(例如DNA、RNA)。循环中细胞典型地是使用一种或更多种分离方法从患者样品分离的，例如免疫磁性分离(见例如 Racila 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 :4589-4594 (1998) ；Bilkenroth等，Int. J. Cancer, 92 :577-582 (2001)), CellTracks System by Tmmuni con (HuntingdonValley, PA),微流体分离(见例如 Mohamed 等，IEEE Trans. Nanobiosci. ,3 251-256 (2004) ；Lin 等，Abstract No. 5147，97th AACR Annual Meeting, Washington,D. C. (2006))，FACS (见例如 Mancuso 等，Blood, 97 :3658-3661 (2001))，密度梯度离心(见例如 Baker 等，Clin. Cancer Res.，13 :4865-4871 (2003))和消耗法(见例如 Meye 等，Int.J.Oncol.，21 :521-530 (2002))。目的信号转导分子典型地是在循环中细胞被分离之后短时间内提取的以维持它们的原位活化状态，优选地，在大约24、6或I小时内，以及更优选地，大约30、15或5分钟内。分离的细胞还可与一种或更多种生长因子(通常以纳摩尔至微摩尔浓度)一起 孵育大约1-30分钟，以复苏或刺激信号转导分子的活化(见例如Irish等，Cell，118 217-228 (2004))。例如，为针对个体患者评价潜在抗癌疗法，可将分离的细胞与浓度变动的一种或更多种抗癌药物一起孵育。然后可进行数分钟(例如大约1-5分钟)或若干小时(例如大约1-6小时)的生长因子刺激。有或没有抗癌药物的信号通路的差异性活化协助针对每个个体患者选择正确剂量的合适的癌症疗法。还可在抗癌药物治疗期间从患者样品分离循环中的细胞，以及可用一种或更多种生长因子对其加以刺激，以测定是否应当执行疗法变化。术语“受试者”或“患者”或“个体”典型地包括人，但还包括其它动物，例如，其它灵长类、啮齿类、犬科动物、猫科动物、马科动物、绵羊、猪等等。“阵列”或“微阵列”包含被固定于或被限制制于固体支持物上的捕获抗体的有区别的组和/或稀释系列，所述支持物例如是玻璃(例如玻片)、塑料、芯片、别针(Pin)、滤器、珠粒(例如磁性珠粒、聚苯乙烯珠粒等等)、纸、膜(例如尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)等等)、纤维束或者任何其它合适底物。捕获抗体通常通过共价或非共价相互作用(例如离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)被固定于或被限制于固体支持物上。在某些情况下，捕获抗体包含与固体支持物上结合的捕获剂相互作用的捕获标签。用于本文描述的检验中的阵列典型地包含多种不同的捕获抗体和/或捕获抗体浓度，它们在不同的已知/可寻址的位置与固体支持物表面偶联。术语“捕获抗体”意欲包括被固定的、特异于(即，与......结合、被......结
合或与......形成复合体)样品(例如细胞提取物)中一种或更多种目的分析物的抗
体。在一些特定的实施方式中，捕获抗体被限制于阵列中的固体支持物上。用于在固体支持物上固定多种信号转导分子中的任何的合适的捕获抗体可从Upstate (Temecula,CA)、Biosource(Camarillo, CA)、Cell Signaling Technologies (Danvers, MA)、R&DSystems(Minneapolis, MN)、Lab Vision(Fremont, CA)、Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz, CA) > Sigma (St. Louis, MO)和 BD Biosciences (San Jose, CA)获得。术语“检测抗体”在本文中使用时包括下述抗体，所述抗体包含可检测标记的特异于(s卩，与......结合、被......结合或与......形成复合体)样品中一种或更多种
目的分析物。该术语还包括特异于一种或更多种目的分析物的抗体，其中所述抗体可被包含可检测标记的另外的种类结合。可检测标记的例子包括但不限于，生物素/链霉抗生物素标记，核酸(例如寡核苷酸)标记，化学反应性标记，荧光标记，酶标记，放射活性标记以及它们的组合。用于检测多种信号转导分子中的任何的活化状态和/或总量的合适的检测抗体可从 Upstate (Temecula, CA)、Biosource (Camarillo, CA)、Cell SignalingTechnologies(Danvers, MA)、 R&D Systems(Minneapolis, MN)、 Lab Vision(Fremont,CA)、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)、Sigma (St.Louis, MO)和 BDBiosciences (San Jose, CA)获得。作为非限制性的例子，针对信号转导分子(例如EGFR，c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, AKT, MAPK, PTEN, Raf 和 MEK)的多种磷酸化形式的磷特异性抗体，可从Santa Cruz Biotechnology获得。术语“活化状态依赖性抗体”包括特异于(S卩，与......结合、被......结合或
与......形成复合体)样品中一种或更多种目的分析物的特定活化状态的检测抗体。在
一些优选的实施方式中，活化状态依赖性抗体检测一种或更多种分析物(例如一种或更多种信号转导分子)的磷酸化、泛素化和/或复合化。在一些实施方式中，受体酪氨酸激酶的EGFR家族的成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间异源二聚复合体的形成是使用活化状态依赖性抗体来检测的。在一些特定的实施方式中，活化状态依赖性抗体可用于检测一种或更多种下述信号转导分子中磷酸化的一个或更多个位点(磷酸化位点对应于人蛋白质序列中氨基酸的位置)EGFR/HERl/ErbBl (例如酪氨酸(Y) 1068) ;ErbB2/HER2 (例如Y1248) ;ErbB3/HER3(例如 Y1289) ;ErbB4/HER4 (例如 Y1284) ;c_Met (例如 Y1003、Y1230、Y1234、Y1235 和 / 或 Y1349) ;SGK3(例如苏氨酸(T) 256 和 / 或丝氨酸(S) 422) ;4E_BP1 (例如 T70) ；ERK1 (例如 T185、Y187、T202 和 / 或 Y204) ；ERK2 (例如 T185、Y187、T202 和 / 或Y204) ;MEK(例如 S217 和 / 或 S221) ;PIK3R1 (例如 Y688) ;PDK1 (例如 S241) ;P70S6K(例如 T229、T389 和 / 或 S421) ;ΡΤΕΝ (例如 S380) ；ΑΚΤ1 (例如 S473 和 / 或 Τ308) ；ΑΚΤ2 (例如S474 和 / 或 Τ309) ；ΑΚΤ3 (例如 S472 和 / 或 Τ305) ;GSK_3 β (例如 S9) ；NFKB (例如 S536)；IKB (例如 S32) ;BAD (例如 SI 12 和 / 或 S136) ；mT0R(例如 S2448) ;Rsk_l (例如 T357 和 /或 S363) Jnk (例如 T183 和 / 或Y185) ;P38 (例如 T180 和 / 或 Y182) ;STAT3 (例如 Y705 和/ 或 S727) ;FAK (例如 Y397、Y576、S722、Y861 和 / 或 S910) ;RB (例如 S249、T252、S612 和/或S780) ；RB1(例如S780);内收蛋白(例如S662和/或S724) ；PYK2 (例如Υ402和/或Υ881) ；PKCa (例如 S657) ；PKC a / β (例如 Τ368 和 / 或 Τ641) ；PKC δ (例如 Τ505) ;ρ53(例如 S392 和 / 或 S20) ;CREB(例如 S133) ;c_Jun(例如 S63) ;c_Src (例如 Y416);和桩蛋白(例如￥31和/或￥118)。术语“不依赖活化状态的抗体”包括以与它们的活化状态无关的方式特异于(即，
与......结合、被......结合或与......形成复合体)样品中一种或更多种目的待分析
物的检测抗体。例如，不依赖活化状态的抗体可检测一种或更多种待分析物(例如一种或更多种信号转导分子)的磷酸化和非磷酸化形式二者。术语“核酸”或“多核苷酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的聚合物，例如DNA和RNA。核酸包括含有已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连接的核酸，其是合成的、天然存在和非天然存在的，并且其具有与参照核酸相似的结合性质。此类类似物的例子包括但不限于，硫代磷酸、磷酰胺盐/酯、甲基膦酸、手性-甲基膦酸、2’ -O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PM)。除非有明确限制，该术语包括含有已知天然核苷酸类似物的核酸，其与参照核酸具有相似的结合性质。除非另有指示，特定核酸序列无疑还包括其经保守修饰的变体和互补序列以及明确示出的序列。术语“寡核苷酸”包括RNA、DNA、RNA/DNA杂交体的单链寡聚物或多聚物，和/或其模拟物。在某些情况下，寡核苷酸由天然存在(即未经修饰的)核苷碱基、糖和核苷间(主链)连接构成。在某些其它情况下，寡核苷酸包含经修饰的核苷碱基、糖和/或核苷间连接。在本文中使用时，术语“错配基序”或“错配区域”指寡核苷酸与其互补序列不具有100%互补性的部分。寡核苷酸可具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个错配区域。错配区域可以是连续的，或者可以被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸分开。错配基序或区域可包含单个核苷酸或可包含两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸。短语“严格杂交条件”指下述条件，在所述条件下，寡核苷酸与其互补序列杂交 而不与其它序列杂交。杂交条件是序列依赖性的，并且将在不同情况下有所不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导见Tijssen, Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993)。通常，严格条件被选择为比在定义的离子强度pH下针对具体序列的热熔点CU低大约5-10°C。Tm是这样的温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度时，与靶互补的探针的50%在平衡下与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，在Tm时，探针的50%在平衡下被占据)。还可添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现严格条件。关于选择性或特异性杂交，阳性信号是至少两倍的背景，优选地，是10倍背景杂交。术语“实质相同”或“实质同一性”在两条或更多条核酸的上下文中指当使用序列比较算法或通过人工比对和视觉检查，在比较窗或指定的区域上，针对最大的对应性进行比较和比对时，相同的或具有指出的相同核苷酸百分比(即，在指出的区域上至少大约60 %，优选至少大约65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 %同一性)的两条或更多条序列或亚序列。当下文中指出时，该定义还类似地指序列的互补序列。优选地，优选地，在长度为至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个核苷酸的区域上存在实质同一性。术语“孵育”与“接触”和“暴露”同义使用，并且不暗示任何特别的时间或温度要求，除非另有指不。“受体酪氨酸激酶”或“RTK”包括特征在于跨膜结构域和酪氨酸激酶基序的五十六(56)种蛋白质的家族。RTK在细胞信号中发挥功能，并且传送调控生长、分化、粘附、迁移和凋亡的信号。受体酪氨酸激酶的突变性活化和/或过表达使细胞变形，并且在癌症的发育中具有决定性的作用。RTK已经成为了多种分子靶向型药剂(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗、吉非替尼、埃罗替尼、舒尼替尼(sunitinib)、伊马替尼(imatinib)、尼罗替尼(nilotinib)等等)的靶标。一种被良好表征的信号转导通路是MAP激酶通路，其在细胞中负责转导来自表皮生长因子(EGF)的信号，以促进细胞增殖。术语“无进展生存期”或“PFS”包括在疾病(例如癌症)治疗期间和之后的时间长度，其间患者带病生活，但没有疾病的额外症状。
术语“三阴性”在本发明上下文中包括肿瘤细胞(例如循环中的肿瘤细胞)、肿瘤或癌症，例如三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)，其中没有可检测到的雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)或人表皮生长因子受体2(HER2)的表达。
III.对实施方式的描述本发明提供了使用检验例如如本文所描述的特异性的、多重、高通量接近检验来检测源于肿瘤组织的肿瘤细胞或实体肿瘤的循环中细胞中信号转导通路的组分的状况(例如表达和/或活化水平)的方法。本发明还提供了选择适当的疗法来下调一种或更多种去调控的信号转导通路的方法。因此，本发明的某些实施方式可用于帮助设计个性化的疗法，这基于通过给定患者的肿瘤(例如三阴性乳腺肿瘤)中总的和/或活化的信号转导蛋白质的集合提供的特定分子标识来设计。 在一些特定的方面，本发明提供了能使得测定或预测特定癌症是否能应答于或者是否可能有利地于应答于一种或更多种抗癌药物的分子标志物(生物标志物)，所述药物例如是贝伐单抗(Avastin )、卡钼和紫杉醇(例如Abraxane 或nabP)的组合(“二联疗法”))。在一些特别的实施方式中，测量VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR中至少一种、两种或更多种(例如全部)的表达和/或活化的水平特别用于选择合适的抗癌药物和/或鉴定或预测细胞(例如三阴性肿瘤细胞)中的疗效或对其的应答。在一个方面，本发明提供了用于测定三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性的方法，所述方法包括
(a)裂解肿瘤细胞，产生细胞提取物；
(b)测定细胞提取物中选自VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR构成的组的一种或更多种待分析物的表达水平；以及
(c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的参照表达水平相比较，
其中较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HERl表达的高水平和/或IGF-IR表达的低水平的存在指示肿瘤细胞对抗癌药物敏感。在一些实施方式中，较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的中等至高水平、c-KIT表达的中等至高水平、HERl表达的低至中等水平和/或IGF-IR表达的中等至高水平的存在指示肿瘤细胞对抗癌药物有耐药性。在一种特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2和c-KIT、基本由VEGFR2和c-KIT构成、或由VEGFR2和c-KIT构成的待分析物组合的表达水平。在另一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2和HER1、基本由VEGFR2和HERl构成、或由VEGFR2和HERl构成的待分析物组合的表达水平。在又一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含 VEGFR2、c-KIT 和 HER1，基本由 VEGFR2、c-KIT 和 HERl 构成，或由 VEGFR2、c-KIT和HERl构成的待分析物组合的表达水平。在还一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含 VEGFR2、c-KIT、HERl 和 IGF-1R，基本由 VEGFR2、c-KIT, HERl 和 IGF-IR构成，或由VEGFR2、c-KIT、HERl和IGF-IR构成的待分析物组合的表达水平。在某些实施方式中，本发明的方法还包括在细胞提取物中测定VEGFR2、c-KIT、HERl、IGF-lR和/或AKT中至少一种、两种或更多种(例如全部)的活化水平。在其它一些情况下，所述方法还包括在步骤(a)之前将肿瘤细胞与抗癌药物进行接触。
在其它一些实施方式中，肿瘤细胞是乳腺癌细胞。在某些情况下，肿瘤细胞是从肿瘤(例如三阴性乳腺肿瘤)获得或从获得自体液样品的循环中的肿瘤细胞(CTC)获得的细针抽吸物(FNA)细胞。肿瘤细胞典型地分离自下述样品,所述样品包括全血、血清、血衆或肿瘤组织。在一些特定的实施方式中，样品获得自具有三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)的受试者。在另一方面，本发明提供了预测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的方法，所述方法包括
(a)裂解从三阴性乳腺肿瘤获得的肿瘤细胞，产生细胞提取物；
(b)测定细胞提取物中VEGFR2、c-KIT.HERl和/或IGF-IR的表达水平；以及
(c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的参照表达水平相比较，
其中较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HERl表达的高水平和/或IGF-IR表达的低水平的存在预示对使用抗癌药物的疗法的应答。在一些实施方式中，细胞提取物中VEGFR2表达的中等至高水平、c-KIT表达的中等至高水平、HERl表达的低至中等水平和/或IGF-IR表达的中等至高水平的存在预示缺乏对使用抗癌药物的疗法的应答。在一种特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2和c-KIT、基本由VEGFR2和c-KIT构成、或由VEGFR2和c-KIT构成的待分析物组合的表达水平。在另一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2和HERl、基本由VEGFR2和HERl构成、或由VEGFR2和HERl构成的待分析物组合的表达水平。在又一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2、c-KIT和HERl，基本由VEGFR2、c-KIT和HERl构成，或由VEGFR2、c-KIT和HERl构成的待分析物组合的表达水平。在还一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2、c-KIT、HERl 和 IGF-1R，基本由 VEGFR2、c-KIT, HERl 和 IGF-IR 构成，或由 VEGFR2、c-KIT、HERl和IGF-IR构成的待分析物组合的表达水平。在某些实施方式中，本发明的方法还包括在细胞提取物中测定VEGFR2、c-KIT、HERU IGF-IR和/或AKT中至少一种、两种或更多种(例如全部)的活化水平。在其它一些情况下，所述方法还包括在步骤(a)之前将来自三阴性乳腺肿瘤的肿瘤细胞与抗癌药物进行接触。在其它一些实施方式中，肿瘤细胞是从肿瘤(例如三阴性乳腺肿瘤)获得或从获得自体液样品的循环中的肿瘤细胞(CTC)获得的细针抽吸物(FNA)细胞。肿瘤细胞典型地分离自下述样品，所述样品包括全血、血清、血浆或肿瘤组织。在一些特定的实施方式中，样品获得自具有三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)的受试者。在一些情况下，VEGFR2表达的低水平的存在预示更长期的无进展生存期(PFS)。在其它一些情况下，c-KIT表达的低水平的存在预示更长期的PFS。在另一些情况下，HERl表达的高水平的存在预示更长期的PFS。在还一些情况下，IGF-IR表达的低水平的存在预示更长期的PFS。在一些特定的情况下，VEGFR2表达的低水平的存在组合c-KIT表达的低水平和/或HERl表达的高水平的存在预示更长期的PFS (较之VEGFR2、c-KIT或HERl单独的表达水平而言)。在某些实施方式中，本发明的方法(例如，用于测定三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性和用于预测三阴性乳腺肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的应答的方法)还可包含步骤(d):将在步骤(C)中获得的比较结果以可读形式提供给使用者(例如，临床医师，例如肿瘤学家，或普通医师)。在某些实施方式中，本发明的方法还可包括将在步骤(C)中获得的比较结果发送或报告给临床医师，例如肿瘤学家或普通医师。在其它一些情况下，本发明的方法还可包括将步骤(C)中获得的比较结果记录或储存于计算机数据库或其它合适的机器或设备中，用于储存信息，例如在实验室中。在一些特定的实施方式中，VEGFR2、c-KIT, HERl和/或IGF-1R的表达水平是通过检测VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的总蛋白质水平来测定的，这例如使用待分析物特异性的抗体用免疫检验来进行。总表达水平和/或状况可使用多种技术中的任何技术来测定。作为非限制性的例子，可如本文所述使用单项检测检验或使用接近双重检测检验来测定VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-IR的表达水平。在一些优选的实施方式中，接近双重检测检验是协同酶增强反应性免疫检验(￡ollaborative Enzyme Enhanced ReactiveImmunoAssay, CEER)。
在一些实施方式中，一种或更多种待分析物的表达(例如，总)水平和/或活化 (例如磷酸化)水平被表示为相对荧光单位(RFU)值，其对应于使用例如CEER测定的特定目的待分析物的信号强度。在其它一些实施方式中，一种或更多种待分析物的表达水平和/或活化水平是这样来定量的针对为特定目的待分析物产生的标准曲线，校正或归一化使用例如接近检验(例如CEER)测定的RFU值。在某些情况下，可基于标准曲线计算RFU值。在另一些实施方式中，一种或更多种待分析物的表达水平和/或活化水平被表示为“低”、“中等”或“高”，这对应于使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的逐渐增加的信号强度。在一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的不可检测到的或仅被最小程度检测到的表达或活化水平可被表示为“不可检测到”。在其它一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的表达或活化的低水平可被表示为“低”。在还一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的表达或活化的中度水平可被表示为“中等”。在又一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的目的特定待分析物的表达或活化的中度至高水平可被表示为“中等至高”。在另一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的表达或活化的非常高的水平可被表示为“高”。在一些特定的实施方式中，特定目的待分析物的参照表达水平和/或活化水平是从产生自样品(例如癌细胞系)的一条或更多条标准曲线计算的。作为非限制性的例子，针对用于测定特定目的待分析物的表达水平或活化水平的每种检验，可从制备自癌细胞系的经系列稀释的细胞裂解物的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种等等)浓度产生反曲(sigmoidal)标准曲线。在一些优选的实施方式中，癌细胞系表达一种或更多种目的待分析物，例如VEGFR2、c-KIT、HERl和/或IGF-1R。每条曲线可被绘制为信号强度对源于对数浓度的单位的函数，CU(计算后单位)可基于标准曲线来计算。实施例7提供了针对为特定目的待分析物产生的标准曲线来对特定目的待分析物的表达和/或活化水平进行的定量的更为详细的描述。在某些实施方式中，当表示为“低”、“中等”或“高”时，特定目的待分析物的表达水平或活化水平可对应于至少大约0、5，000、10，000、15，000,20 ;000、25，000,30, 000、35，000,40, 000,45, 000,50, 000,60, 000,70 ;000、80，000,90, 000,100, 000RFU 或更高的表达或活化水平，例如当较之阴性对照(例如IgG对照)中、在为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)中、在阳性对照(例如pan-CK对照)中、存在抗癌药物时和/或不存在抗癌药物时针对该特定目的待分析物的参照表达水平和/或活化水平而言。在一些情况下，关联是待分析物特异性的。作为非限制性的例子，当较之参照表达或活化水平时，使用例如接近检验(例如CEER)测定的表达或活化的“低”水平针对一种待分析物可对应于表达或活化的10，000RFU，针对另一待分析物可对应于50，000RFU。在某些实施方式中，特定目的待分析物的表达或活化水平可对应于相对于针对该特定目的待分析物的参照表达水平或活化水平而言被称为“低”、“中等”或“高”的表达或活化水平，例如当较之阴性对照(例如IgG对照)，当较之为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)，当较之阳性对照(例如pan-CK对照)，当较之存在抗癌药物时测定的表达或活化水平，和/或当较之不存在抗癌药物时测定的表达或活化水平而言。在一些情况下，关联是待分析物特异性的。作为非限制性的例子，当较之参照表达或活化水平时，使用例如接近检验(例如CEER)测定的表达或活化的“低”水平针对一种待分 析物可对应于表达或活化的2倍增加，针对另一待分析物可对应于5倍增加。 在某些实施方式中，特定目的待分析物的表达或活化水平可对应于较之在阴性对照(例如IgG对照)中、在为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)中、在阳性对照(例如pan-CK对照)中、存在抗癌药物时和/或不存在抗癌药物时针对该特定目的待分析物的参照表达水平和/或活化水平的表达或活化水平。在某些实施方式中，当表达或活化水平是在阴性对照(例如IgG对照)中、在为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)中、在阳性对照(例如pan-CK对照)中、存在抗癌药物时和/或不存在抗癌药物时针对该特定目的待分析物的参照表达或活化水平的至少大约 I. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、
9.9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 或 100 倍高(例如大约 I. 5-3、2-3、2-4、2-5、2_10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20 或 5-50 倍高)，认为在样品(例如细胞提取物)中存在特定目的待分析物的表达或活化的较高水平。在其它一些实施方式中，当表达或活化水平是在阴性对照(例如IgG对照)中、在为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)中、在阳性对照(例如pan-CK对照)中、存在抗癌药物时和/或不存在抗癌药物时针对该特定目的待分析物的参照表达或活化水平的至少大约 I. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、
9.9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 或 100 倍低(例如大约 I. 5-3、2-3、2-4、2-5、2_10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20 或 5-50 倍低)，认为在样品(例如细胞提取物)中存在特定目的待分析物的表达或活化的较低水平。在另一些实施方式中，特定目的待分析物的参照表达或活化水平是分离点值(cutoff value)。在一些情况下,分离点值包括基于对特定目的待分析物的群体分析选择的数，其用于比较细胞提取物中该待分析物的表达或活化水平。作为非限制性的例子，分离点值可通过将来自个体群体的特定目的待分析物的表达或活化水平分入“高”和“低”组来获得，并且其被选为处于或紧邻群体中该待分析物的中位表达或活化水平。可将细胞提取物中目的待分析物的表达或活化水平与分离点值相比，并基于细胞提取物中的待分析物的表达或活化水平是否高于(例如“高”)或低于(例如“低”)分离点值将其确定为表达或活化的“高”和“低”水平。实施例5提供了根据本发明的方法计算、选择和使用分离点值的一种示例性实施方式。在其它一些实施方式中，分离点值可从为特定目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)获得，并与细胞提取物中该待分析物的表达或活化水平相比较。本领域技术人员将认识到，可根据使用者的需要和被分析的群体的特征来测定分离点值。在一些实施方式中，抗癌药物包含干扰癌细胞中不正常表达和/或活化的信号转导通路组分的功能的一种或更多种药剂。此类药剂的非限制性例子包括下面在PCT公开No. WO 2010/132723的表I中列出的那些，就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文。在某些实施方式中，抗癌药物包含抗信号剂(anti-signaling agent)(即，细胞生长抑制药(cytostatic drug)),例如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗剂(即细胞毒性药)；激素性治疗剂；放疗剂；疫苗；和/或具有降低或终止异常细胞(例如癌 细胞)不受控制的生长的任何其它化合物。在一些实施方式中，用一种或更多种抗信号剂、抗增殖剂和/或激素性治疗剂组合至少一种化疗剂来处理经分离的细胞。适用于本发明的抗信号剂包括但不限于，单克隆抗体，例如曲妥珠单抗(Herceptin )，帕妥珠单抗(pertuzumab) (2C4),阿仑单抗
(alemtuzumab) (Campath^)，贝伐单抗(Avastin⑧)，西妥昔单抗(Erbitux⑧)，
吉姆单抗(gemtuzumab) ( Mylotarg^ )，帕尼单抗(panitumumab) (Vectibix )，利妥昔单抗(rituximab) (Rituxan )和托西莫单抗(tositumomab) (BEXXAR );酪氨酸激
酶抑制剂，例如吉非替尼(Iressa@ )，舒尼替尼(SutenP)，埃罗替尼(Tarceva@ )，
拉帕替尼(Iapatinib) (GW-572016 ； Tykcrb )，卡奈替尼(canertinib) (Cl 1033)，semaxinib (SU5416)，伐他拉尼(vatalanib) (PTK787/ZK222584)，索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006 ；Nexavar )，甲磺酸伊马替尼(Gleevec )，来氟米特(Ieflunomide)(SUlOl)，凡德他尼(vandetanib) (ZACTIMA ;ZD6474)，培利替尼(pelitinib)，CP-654577，CP-724714, ΗΚΙ-272, ΡΚΙ-166，AEE788, BMS-599626，HKI-357，BIBff 2992，ARRY-334543，JNJ-26483327 和 JNJ-26483327 ;和它们的组合。示例性的抗增殖剂包括mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)，坦西莫司(temsirolimus) (CCI-779)，依维莫司(everolimus) (RAD001)，BEZ235 和 XL765 ；AKT抑制剂，例如1L6-羟基甲基-手性-肌醇-2- (R) -2-0-甲基-3-0-十八基-sn_甘油碳酸酯，9-甲氧基-2-methylellipticinium 乙酸盐 / 酯，1,3- 二氢-1-(1-((4-(6-苯基-IH-咪唑[4，5-g]喹喔啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮，10_(4’ - (N- 二乙基氨基)丁基)-2_氯吩卩惡嗪，3-甲酸基色酮缩氨基硫脲(Cu(II)Cl2复合体)，API-2，源自原癌基因TCLl的氨基酸10-24的15体肽(Hiromura等，J. Biol.Chem. ,279 :53407-53418 (2004))，KP372-1，以及 Kozikowski 等，J. Am. Chem. Soc.，125 1144-1145(2003)和 Kau 等，Cancer Cell，4 :463-476 (2003)中描述的化合物；PI3K 抑制齐U，例如PX-866,渥曼青霉素(wortmannin), LY 294002,栎精(quercetin),河豚毒素朽1檬酸盐 / 酯，硫丙咪胺马来酸盐 / 酯(thioperamide maleate), GDC-0941 (957054-30-7),IC87114, PI-103, PIK93, BEZ235 (NVP-BEZ235)，TGX-115, ZSTK474, (_)_ 鱼藤素，NU 7026，杨梅酮，坦度替尼(tandutinib)，( C-0941 二甲磺酸酯，GSK690693, KU-55933，MK-2206，0SU-03012，哌立福新(perifosine),曲西立滨(triciribine), XL-147, PIK75, TGX-221, NU7441，PI 828，XL-765 和 WHI-P 154 ;MEK 抑制剂，例如 PD98059，ARRY-162，RDEA119，U0126，⑶C-0973，PD184161, AZD6244, AZD8330, PD0325901 和 ARRY-142886 ;和它们的组合。pan-HER抑制剂的非限制性例子包括PF-00299804，奈拉替尼(neratinib)(HKI-272), AC480(BMS-599626)， BMS-690154， PF-02341066， HM781-36B， CI-1033，BIBW-2992，和它们的组合。化疗剂的非限制性例子包括基于钼的药物(例如奥沙利钼(oxaliplatin)，顺钼，卡钼，螺钼(spiroplatin),异丙钼(iproplatin), sat raplatin 等等)，烧基化药剂(例如环磷酰胺，异环磷酰胺，苯丁酸氮芥，白消安，美法仑，氮芥，乌拉莫司汀，噻替派，亚硝基脲类等等)，抗代谢药(例如5-氟脲，硫唑嘌呤(azathioprine),6-巯基嘌呤，甲氨蝶呤，甲酰四氢叶酸，卡培他滨(capecitabine)，阿糖胞苷，氟尿苷(floxuridine),氟达拉滨(fIudarabine),吉西他滨(gemcitabine) (Gemzar )，培美曲塞(pemetrexed) (AT,TMT A )，雷替曲塞(raltitrexed)等等)，植物生物碱类(例如长春新碱，长春碱，长春瑞滨，长春地辛(vindesine),鬼白毒素(podophyllotoxin),紫杉醇(Taxol )，多西他赛(docetaxel) (Taxotere )等等)，拓扑异构酶抑制剂(例如依立替康(irinotecan),托泊替康(topotecan),安卩丫丨淀(amsacrine),依托泊苷(etoposide) (VP16),依托泊苷磷酸盐/酯,替尼泊苷(teniposide)等等)，抗肿瘤抗生素(例如阿霉素(doxorubicin),阿霉素(adriamycin),道诺霉素(daunorubicin),表柔比星(epirubicin),放射菌素(actinomycin),博莱霉素,丝裂霉素,米托蒽醌(mitoxantrone),普卡霉素(plicamycin)等等)，可药用的其盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物，和它们的组合。激素性治疗剂的例子包括但不限于，芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特(aminoglutethimide),阿那曲唑(anastrozole) (Arimidex@)，来曲唑(Ietrozole) (Femara )，伏氯唑(vorozole),依西美坦(exemestane) ( Aromasill ) , 4_ 雄留稀 _3,6,17-二丽(6-0X0), I, 4,6_ 雄留二稀-3,17- 二酮(ATD),福美坦(formestane) ( Lentaron )等等)，选择性雌激素受体调节剂(例如巴多昔芬(bazedoxifene),氯米芬(clomifene),氟维司群(fulvestrant),拉索昔芬(Iasofoxifene),雷洛昔芬(raloxifene),它莫西芬(tamoxifen),托瑞米芬(toremifene)等等)，固醇类(例如地塞米松)，非那司提(finasteride)和释放促性腺激素的激素激动剂(GnRH),例如戈舍瑞林(goserelin),可药用的其盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物，和它们的组合。可用于本发明的癌症疫苗的非限制性例子包括来自Active Biotech的ANYARA,来自Northwest Biotherapeutics 的 DCVax-LB,来自 IDM Pharma 的 EP-2101,来自 Pharmexa的 GV1001,来自 Idera Pharmaceuticals 的 10-2055,来自 Introgen Therapeutics 的 INGN225 和来自 Biomira/Merck 的 Stimuvax。
放疗剂的例子包括但不限于放射性核素，例如47Sc、64CU、67CU、89Sr、86Y、87Y、9°Y、105Rh、inAg、mIn、117mSn、149pm、153Sm、166HO、177Lu、186Re、188Re、211At 和 212Bi,任选地，与针对肿瘤抗原的抗体缀合。在一些优选的实施方式中，抗癌药物是贝伐单抗(Avastin )、卡钼和紫杉醇的组合(“三联疗法”))。在一些情况下，紫杉醇是纳米颗粒清蛋白结合的(nab)紫杉醇(Abraxane 或nabP)。在其它一些实施方式中，抗癌药物包含下述中的一种或更多种贝伐单抗(Avastin ),卡钼，紫杉醇(例如nabP)，iniparib (BSI 201 ；4~碘-3-硝基苯甲酰胺)，NK012(释放SN-38的纳米设备，通过将SN-38与嵌段共聚物PEG-PGlu共价连结、之后在水性介质中两亲性嵌段共聚物进行自装配而构建的)，glembatumumabvedotin(也已知为⑶X-011*CR011-vcMMAE ;与靶向表达跨膜糖蛋白NMB的癌细胞的单甲基auristatin E (MMAE)相连的人单克隆抗体glembatumumab (CROll)),或它们的组合。在一种特定的实施方式中，抗癌药物是iniparib (PARP抑制剂),吉西他滨(Gemzar )和卡钼的组合。
在一些实施方式中，所述方法还包括在细胞提取物中测定一种或更多种额外的信号转导分子的表达和/或活化水平。可针对在样品(例如细胞提取物)中的表达(例如总量)水平和/或活化(例如磷酸化)水平进行考察的额外的信号转导分子的非限制性例子包括受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号级联组分、核激素