专利名称：用于基因疗法和转移的预防以及肿瘤的基因疗法的药剂的制作方法恶性肿瘤疾患最常见的死因是器官转移。而在原发性肿瘤的早期或中期阶段，至少是能够用外科切除的，但在转移的情况下，这种切除的可能性就很小了。除少数例外不计，常规的化疗和放射疗法是有效的，虽然不是根治，不过那也只是达到转移肿瘤临床图像的一时性改善而已。结肠直肠癌属于常见的肿瘤。而源于结肠直肠的肝转移，则是结肠直肠癌患者经常发生的死因。由于原发性肿瘤在外科切除后往往经过较长时间才出现疾病的一些症状，所以它们就成为痊愈的治疗方案的可能目标(JA.德莱本和JE.尼德胡伯下部胃肠道的癌症——结肠癌，载于JE.尼德胡伯编“现代肿瘤疗法”。M.O.圣·路易防护剂，426-431)。然而，肝转移有可能治愈的外科切除仅有很小的百分率的病人是可能的，而且对化疗来说，虽然暂时显示减轻，可是仍不能延长寿命。因此，迫切需要的是改革治疗方式。研制十几年的现行基因疗法方案，根据其错综复杂性，是一种具有反传统的疗法形式，它显著地提高了可调整的范围。这个方案是能够在癌症基因疗法的领域内应用的，尤其是对于肿瘤有特异性的载体靶向或限制肿瘤组织的基因表达，而且特别适应转移的转基因的各种类型肿瘤的薄弱的环节。除了免疫学最新知识以外，迄追求的基因疗法方案，正如已经采用的常规方法一样，几乎只将侵润的肿瘤组织作为主攻对象。这里隐藏着一些肿瘤所不能彻底解决的疑难问题，它表现在瘤内压增高，血液供应受限，甚至还有人用一般方式将基因疗法的转移工具直接注射到瘤内，没有击中要害。在多种转移的情况下，有人指出，当时系统或部位所需的载体药量，甚至使周边的正常组织比肿瘤细胞还容易受到感染。本发明旨在改善肿瘤转移和原发性肿瘤的预防和治疗。本发明是按照要求而实现的。按照本发明所研究出来的策略，是围绕着肿瘤组织不易解决的难点，揭示以极易达到正常组织为主的靶向基因疗法。该法的特征在于使正常器官组织直接在有可能转移或已经发生转移的部位具有防御能力，这种能力就是防止转移发生和继续生长。同时也能防止未作手术的原发性肿瘤的继续扩展。这种孕育健康组织的策略大大不同于目前所采用的各种基因疗法和非基因疗法的方案。与系统的或腹膜内用合成蛋白酶抑制剂之类的药物相比(N.J.奈尔逊血管生成的抑制剂已进入三期试验，自然癌症研究所杂志，90，960-963)，基因疗法的配方是有其优点的，那就是它使局部靶器官中的有效物质达到极高的浓度，还有一些优点如副作用减少和可用多种抑制剂(见下文)。此外，就持续的基团表达而言，应用一次载体比长期反复服用合成的物质的费用要合算得多，副作用也少。以下临床记录是同上述方案相吻合的。1.手术前或手术中在靶器官内应用载体，可以防止原发性肿瘤在手术时有转移的肿瘤细胞脱落外渗。2.在靶组织内，连续几年出现的抑制剂辅药可以防止隐蔽的微转移物的生长，而且杀死它们，这主要用在高危组，如有淋巴结侵袭的需作手术的乳腺癌。3.限制已经发生转移的或未作手术的原发性肿瘤的生长。
实例1结肠直肠的肝转移通过金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的腺病毒传送到肝实质的基因疗法。
结肠直肠癌在转移时产生各种不同的蛋白酶(Protease)。这些蛋白酶是为了内渗和外渗以及侵犯靶组织的需要。其中有各种金属蛋白酶(MMPS)尤其是金属蛋白酶-2(MMP-2)和金属蛋白酶-9(MMP-9)，它们是管细胞外间质物质(ECM)成分的降解的(M.J.杜飞和K.麦克卡赛癌症的金属蛋白酶间质治疗的预后标记的靶向[综述]，国际肿瘤学杂志，12，1343-48)。被金属蛋白酶-2和-9首先裂解的是作为基底膜主要成分的胶原蛋白IV(Kollagen IV)。出于这种考虑，人们研制了合成的蛋白酶抑制剂(Proteaseinhibitor)，该抑制剂在临床上已经投入使用，并且在某些情况下已达到临床试验第三期(N.J.奈尔逊血管生成的抑制剂已进入三期试验，自然癌症研究所杂志，90，960-963)。
按照本发明所研制的疗法的基本思路，是使金属蛋白酶的抑制物质对肝的实质进行封锁，以便抑制转移的肿瘤细胞外渗，防止外渗继续侵入已经发生转移的肿瘤，而对有血管供应的肿瘤，则利用抑制血管发育而将其结扎。首选的是金属蛋白酶-2的组织抑制剂(TIMP-2)，正如所用的许多物质一样，这种抑制剂也是以生理学方式负责限制金属蛋白酶在改组过程中的活力的。由于它连接在金属蛋白酶-2上，所以金属蛋白酶组织抑制剂-2可以抑制其活性。
建立试验的基团转移系统的第一代腺病毒(Erstgenerations-Adencviren)是用来作基因转移载体的(K.勃兰德和M.斯特劳斯基因转移的分子基础和基因疗法的应用，载于D.鲁克保尔和D.甘顿[出版者]分子医学手册，第2卷，肿瘤疾患，斯普灵格，柏林，海德堡，纽约)。这些载体不能因缺少腺病毒E1-基因而进行复制，它们高效地感染上皮细胞，并可在必要时大量地基因化。
a)为了证明体外肝细胞分泌金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)，可用不同的传染重复性(MOIs)和Ad-TIMP-2感染A2细胞(来自P53K.O.小鼠的肝细胞的细胞系)。Ad-TIMP-2的结构已有人描述过(A.H.贝克尔，G.W.威尔金逊，R.M.亨伯利，G.姆尔菲和A.C.纽贝带动高水平人体金属蛋白酶-9的表现和金属蛋白酶-1和-2基因的组织抑制剂的重组腺病毒的发育其在兔子平滑肌细胞中和在人类MCF-7腺癌细胞中的传染特点。间质生物学15383-395)。在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下，该病毒含有人类的TIMP-2互补DNA(cDNA)。经过24小时或48小时后，达到细胞培养突出点(ZKU)。将10μl涂在10％的聚丙烯酰胺凝胶上，经过电泳分离后再转移到硝化纤维膜上。要作免疫学证明，可应用单克隆抗体(T2-101，图1，迪阿诺瓦，汉堡，德国)。
西方文献指出，在Ad-TIMP-2感染细胞的突出点上有一个很强的TIMP-2带，而在未感染病毒的和感染对照病毒的突出点上则无此带。
b)金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)的功能是利用反向酶谱来检验的(A.H.贝克尔，G.W.威尔金逊，R.M.亨伯利，G.姆尔菲和A.C.纽贝带动高水平人体金属蛋白酶-9的表达和金属蛋白酶-1和-2基因的组织抑制剂的重组腺病毒的发育其在兔子平滑肌细胞中和在人类MCF-7腺癌细胞中的传染特点。间质生物学15383-395)。如a)所述，细胞受到感染。细胞培养突出点(ZKU)利用一个Amicon浓度计(Lexington，MA.U.S.A.)进行浓缩。加入NaN3、Brij氏去污剂和CaCl2，以获得0.1％、0.05％及5mM的最终浓度。样品用不还原的缓冲液混合，置于10％的聚丙烯酰胺凝胶上，该凝胶含有1mg/ml的白明胶(猪皮I型，bloom300，SIFMA G2500)和107ng/ml的活性金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白质(肿瘤发生，Cambridge，MA.U.S.A)。电泳后，将十二烷基磺酸钠(SDS)通过酝酿2小时在2.5％的三硝基甲苯(Triton x100)中与凝胶分离。凝胶过夜在50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲剂(Tris HCl)，pH8.0，50mM NaCl，10nM CaCl2，0.05％Brij氏去污剂-35和0.02％NaN3中在温度37℃下酝酿成熟。凝胶用0.5％Coomassie亮蓝(Brilliantblau)(SIGMA R250，戴森霍芬，德国)染色，并具有凝胶酶抑制剂的活性，然后金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)在消光背景下显出深色。这种反向酶谱表明凝胶酶抑制剂的活性只存在于Ad-TIMP-2突出点所感染的细胞，而未感染的或感染对照病毒的细胞突出点上则无此现象。
c)金属蛋白酶-2(MMP-2)的产生是通过肿瘤细胞和通过凝胶酶谱测定证明的。如b)所述，将不同细胞系的细胞培养突出点(ZKU)收集起来，加以调节。按照b)中描述的方法，进行酶谱测定，只有金属蛋白酶-2不参加。结果显示白明胶有裂解的溶解带，在深色背景下可用肉眼看清。在许多细胞系中，LS174结肠肿瘤细胞所表现的金属蛋白酶-2的活性最强。
d)要证明秃鼠血液中重组的人类TIMP-2，可将不同剂量的Ad-TIMP-2经静脉内注射到秃鼠尾静脉。在各时间段采血，获得血清。样品利用TIMP-2ELISAs(德国专利号2618，阿迈沙姆，勃赫勒，勃劳恩什威格，德国)对TIMP-2成分进行检验。结果显示TIMP-2表现出对所用的病毒量有依赖性，TIPM-2-浓度为45μg/m，剂量为3×1010pfus(形成噬菌区的单位)。TIMP-2的血清浓度在2周后稳定下来。这一结果说明，TIMP-2经静脉内注射到血液中是受到封锁的。
e)要检验基因转移到肝的范围，可将腺病毒注射到秃鼠尾静脉。三天后杀死动物，再将肝脏置于液氮内冷冻。为了对TIMP-2作免疫组织化学检查，应用一个对人类TIMP-2的单克隆鼠的抗体(110，T2-101，图1，迪阿诺瓦，汉堡，德国)。再以FITC结合绵羊抗鼠抗体作继发性抗体。染色结果显示TIMP-2的表现在剂量为3×1010pfu时有40％的肝细胞，而在剂量为6×1010pfu时则有大于80％的肝细胞。类似的基因转移率在应用Ad-β半乳糖以及随后应用X-半乳糖染色而获得证明。
f)在LS174导致的肝转移的静脉内应用Ad-TIMP-2的效果，可以用下列实验证明。腺病毒的应用是在转移诱发前1天或10天后。通过应用2×106LS174细胞到动物脾脏来达到转移的诱发。转移诱发5周后，将动物杀死，同时测定肿瘤重量。在预防性试验方案中，于零日将Ad-TIMP-2或Ad-β半乳糖对照病毒以3×1010pfu的剂量注入尾静脉，大约可使40％肝细胞感染。3天后在上述脾内注射肿瘤细胞的地方获得转移诱发。4周后试验结束，测定肝瘤的体积。这说明不论在未治疗的对照组还是在用对照病毒的治疗组大多数动物均发生了转移，肝脏几乎消耗殆尽，而用Ad-TIMP-2治疗的动物以肉眼看来则多无肿瘤(图1未治疗的动物[左]，用Ad-β半乳糖治疗的动物[中]和用Ad-TIMP-2治疗的动物[右])。
定量评价的结果是，在试验组所得到的肿瘤重量的平均值的比例关系为1∶20(Ad-TIMP-2Ad-β半乳糖或未治疗组，图2，点表示一些动物，短横表示平均值)。Ad-金属蛋白酶组织抑制剂-2(Ad-TIMP-2)组的用肉眼看不到肿瘤的动物中，经组织病理学检查只发现一些孤立的微转移物。因此，可以断定，以基因疗法为媒介的金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)通过肝细胞的分泌大大限制了秃鼠模型中的结肠直肠肿瘤转移的数量或体积。这个发现确实惊人，而且说明MMP-2有一种不可替代的重要功能。因为在叙述方案时提到大约只有40％的肝细胞转移，显然它在这里是一种高效疗法，据推测肯定是通过有效物质在局部的高浓度对多种水平(外渗、侵润和血管发生)都具有抗转移作用。在二次试验中，治疗载体是在转移诱发一周之后应用的。在这种情形下，比起最初载体的用量来，疗效要小。但治疗组(TIMP-2)和对照组(Ad-β半乳糖或未治疗者)之间的差别却有极大意义。
g)两种实验方案的动物肝脏经过组织学上的修整后，对肿瘤参数的标准、凋落(Apoptose)、扩散及血管发生的范围进行了研究。
要确定血管发生、扩散和凋落，可制作肝的石蜡切处，并以下列抗体完成染色证明血管时，可用CD31抗体(达科，汉堡，德国)，而测定扩散细胞的百分率时，则用MIB-1(Ki-67)抗体(dia505，迪阿诺瓦)。利用含生物素的第二种抗体以及一种马-小萝卜-结合的抗生物素蛋白(Avidin)(达科)加以证明。为了证明凋落，可应用一个标记凋落的萤光素原位凋落箱(In-fergen，牛津，英国，TUNEL法)。去掉石蜡后的切片先用蛋白酶K进行处理。最初染色用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，并以结合在萤光素上的抗狄戈辛作指示器分子(Reporfer Molekul)。用Propidiumiodid作对照色。在苏木精/伊红染色的切片上，给有丝分裂进行计数。每个动物在计数时有10个显微镜视野，用X400放大倍数(MIB，有丝分裂，CD31)或油侵物镜(X1000，TUNEL)的卡尔·蔡司萤光显微镜(Axioskop，Carl Zeiss，耶拿，德国)，并且求出平均值。在一些治疗组内，均要计算携带肿瘤动物的所有数据的平均值，而为了统计分析可应用学生测试法。以Ad-TIMP-2治疗的动物和没有治疗或以对照病毒治疗的动物的比较表明，这是很有意义的，甚至是非常有意义的，因为它降低了扩散率和血管数字并且提高了凋落率。
本发明的其他运用方式涉及载体、增强子/启动子、转基因、跨膜支撑和靶器官。
载体(Vektoren)首先，隐蔽的转移是存在的，要重新激活它们经过多年的潜伏期之后才有可能，而且在手术前预防转移时，转移的基因的长期表现最为重要。应用第一代腺病毒的疗效只限短暂的数周。接受免疫防御反应的人对此是可以负责的。这似乎决定于腺病毒基因的休止表达(Y.杨等人利用病毒抗原的细胞免疫来限制E1-缺失的腺病毒的基因疗法。美国自然科学院会议录，91，4407-4411)。减少免疫遗传极有希望的方案是转移来自治疗载体的一切有密码的腺病毒的基因组段(H.H.陈等人缺少一切病毒基因的腺病素载体在肌肉中的持久性，美国自然科学院会议录，94，1645-1650)。同时，这些病毒的运载能力有很大提高，以致有载体的地方就有较多的转基因，使转移连续激活，处处都可能成为一个攻击点。这种携带金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)的所谓依赖性辅助剂(HD，helper dependent)的空洞的或最小的腺病毒(Minimal-Adenoviren)也许能显示出生长期防止器官的转移。其他有长期持续的异体基因表达的载体是逆转录病毒(Refrovirus)和腺相关病毒(AAVs)。两种病毒都不是免疫原，而且是以必要的方式(逆转录病毒)或以潜在的方式(腺相关病毒)汇集到宿主细胞的基因组的。人们还在研究逆转录病毒对靶细胞复制的必要性和高价滴定病毒悬浮物增殖的难题的时候，现代腺相关病毒载体(AAV-Vektoren)已经作为蛋白酶抑制剂的基因转移来到了中期。此外，极有前途的载体是慢病毒(Lentiviren)的杂种结构以及单纯性疱疹病毒，它们对神经元有高度亲和力，因此特别适合于大脑转移和恶性胶质瘤的治疗。
在非病毒性载体系统中，脂质体(Liposomen)是很显著的。
本发明优先采用一种形式是改变病毒的表面结构，使载体有可能重建目标。只要有一个适宜的配体在病毒的棘上表现出来，就有可能使固定的正常组织起到靶向的转导作用。这是能够办到的。所以，例如通过肝素领域的结合，可将肝素实验的细胞转化为有靶向的腺病毒。
增强子/启动子(Enhancer/Promotoren)增强子/启动子是可以利用的，这是因为它们有时对受保护的正常组织有活性。其中，大多数情况属于器官实质。个别的是，抗肿瘤转基因的一种表现也能通过器官以下有代表性的细胞而具有意义，例如下面将要谈到的胶原蛋白的分泌就是通过成纤维细胞的。
另外一种方式是应用启动子，它们在添加异体物质之后才被激活。对于这些启动子，如与四环素有关的启动子成分或有甾类化合物反应的成分，人们可能只是分散地进行孕育或者在转移最危险的时刻进行选择。
转基因(Transgene)1.金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)是治疗LS174-细胞所诱发的转移的合适的蛋白质，为TIMP-2所控制，TIMP-2属于与肿瘤细胞入侵关系最密切的蛋白酶。但其他细胞系也产生其他MMPs，而且也反映出蛋白酶模式中的人类肿瘤。靶器官的细胞外间质的构造是随着肿瘤细胞蛋白酶的要求的不同而不同的。因此，除TIMP-2以外，一个普通适用的方案必须也将其他蛋白酶抑制物质，如TIMP-1、纤溶酶原激活物质抑制酶-1(PAI-1)或PAI-2包括在内。天然产生的抑制物在结构上的变化会导致效率的提高或某些副作用的减少。这种变化在于缩短分子或者通过DNA的某些基的交换和顺序的变更。例如通过分离TIMP-2分子的一个终端(C-末端)部分就能成功地分离其所不需要的蛋白酶-激活功能。
2.抑制细胞外间质物质(ECM)降解的一个方案是增强或改变它们。在这里能将特殊的细胞间质的天然方式产生的成分充分表现出来。其中，各种胶原蛋白(Kollagen)、纤维结合素(Fi-bronekfin)、层粘连蛋白(Laminin)及其产物的基因，是用于合成细胞外间质物质的非蛋白成分的。此外，细胞外间质物质的成分，一般不是在有关的器官中表现出来的，而是在不同地点表现出来的，因而使转移的器官的特异性发生变化。还有，对转移的细胞来说，作为一个不可逾越的障碍的不裂解或难裂解的物质，也可以表现出来。
实例2长期以来，人所共知在肝硬化时要比肝脏正常时发生转移的机会少得多。究其原因是由于防止了转移细胞向纤维组织的扩展。这个结论也可利用在治疗上，通过其基因的转移而推广到肝的正常组织，使其微解剖结构发生基因变化，从而形成有限度的人工肝硬化/纤维化，以免转移细胞的扩展。胶原蛋白IV是基底膜的主要成分。这种物质是不能存在于肝细胞和窦状隙之间的。只有少数的胶原蛋白组织散布其间。胶原蛋白含量的细微增加，就会有很敏感地限制转移的能力。
载体结构由胶原蛋白原纤维的三股螺旋(Tripelhelix)基因化而成的两个多肽链，从一个最小-腺病毒棱形载体中被克隆出来。对强激活反应剂(tet-Aktivator-vesponsiver)和强力霉素(Doxycyclin)有依赖性的启动子用作启动子，以便调控转基因表达的大小。于是，强激活剂就进入了梭形质粒。应用一个任意充填的系统可以制造出最小-腺病毒(＝HDAD-tetColl)。
载体试验通过秃鼠注射LS174细胞来诱发肝转移。对依赖性辅助剂HDAD-tetcol扩展的方法与实例1类似。利用效果相同。
3.另一防止肿瘤细胞侵犯和游动的方法，是增强细胞和细胞之间以及细胞和间质之间的粘着性。举例来说，有的与蛋白质类凝血激酶(Clandin)和闭塞素(Occludin)有密切的接合，有的同主要蛋白钙粘素(Cadhevin)、整合蛋白(Integrine)有桥粒式(Desmosomen)和粘着式接合，它们是先同细胞外间质物质的成分发生变化的，还有免疫球蛋白的超族(Superfamilie)、选择蛋白(Selectine)和粘蛋白(Muzine)。
实例3已经有人指出，E-钙粘素(E-Cadherin)是用于上皮细胞的相互作用的，而它的耗损却由原发生肿瘤的转移细胞来维持(W.毕什麦尔，E-钙粘素就是肿瘤(侵入)的抑制基因生物论文集，1797-99)。E-钙粘素的表达一方面是通过正常细胞导至同肿瘤细胞相粘着，防止其游动，而另一方面则是促使正常细胞之间的粘着。
载体结构建立第一代腺病毒，这种病毒在劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子的控制下携带E-钙粘素基因Ad-劳氏肉瘤病毒-E-钙粘素。
体外试验要作机能试验，可用Ad-劳氏肉瘤病病毒-E-钙粘素，使A2细胞转导。粘着的增加是通过测定持续时间来求得的，这需要有胰蛋白酶(Trypsin)裂解细胞。
载体试验通过注射LS174细胞诱发秃鼠的肝转移。Ad-劳氏肉瘤病毒-E-钙粘素的转移方法与实例1类似。利用效果相同。
具有膜撑顺序的转基因在本发明的意义上应用自杀基因(Suizigene)是为了孕育正常组织的，因此它们必须装备有膜撑顺序，以便在细胞外能够生效，而且在细胞外能毒化所应用的药物前体(prodrug)。
实例4在HNF清蛋白-启动子的控制下，自杀基因嘧啶脱氨[基]酶(GytosinDesaminae)的基因要具有膜撑顺序，所以在转染后有固定膜表现出来。这种盒式表现是在一种腺相关病毒梭形质粒(AAV-Shuffle Plasmid)中被克隆出来的，并且在应用任意辅助剂系统中制造出腺相关病毒(＝AAV-HNF-Alb-CD-Tm)。
体外试验用腺相关病毒-HNFAlb-CD-Tm使A2细胞转导。转导后24小时将药物前体5-FC给与细胞培养突出点(ZKU)。现在将S-FC通过固定膜中的钙粘素运至有细胞毒性的S-FU处。24小时后将突出点收集起来，而且给与细胞系LS174以及静止的原发性肝细胞。再过72小时，进行细胞计数，测定凋落范围。
体外试验载体应用和疗效求法与实例1类似。
靶器官鉴于在腺病毒系统给药时肝所表现的突出的易感染性以及治疗结肠直肠转移时在临床上的重大意义，本发明利用上述疾病模型研制了这个方法。该模型也可以应用到其他肿瘤疾患。最常见的疾病征象是乳腺癌在切除原发性肿瘤后潜伏达10年之久而在过去一段时间内迄今未愈以致向肝、肺、骨骼和大脑的转移，还有气管癌时对大脑的转移和前列腺癌时对骨骼的转移。
此外，有些原发性肿瘤，根据进一步研究是原发性的，但未做手术，如常见的恶性胶质瘤和肝细胞癌。按照上述原则，可想而知这是一种延长寿命的措施，在这里不过是为了保护周边的正常组织而已。


图1为通过系统应用Ad-TIMP-2来防止肝转移。在零日将3×1010pfu的Ad-TIMP-2或Ad-β半乳糖注入秃鼠尾静脉。三天后在动物脾内注射LS174结肠癌细胞以诱发肝转移。原位照片显示5周后未治疗的动物(左)、用Ad-β半乳糖治疗的动物(中)和用Ad-TIMP-2治疗的动物(右)。
图2所述方法请参见图1。5周后将动物杀死测定肿块。点代表一些动物，短横表示平均值。


本发明涉及用于原发性肿瘤和转移的预防和治疗的药剂。其主要内容关系到基因疗法的载体以及具有增强子/启动子成分和转基因的DNA顺序。药剂的个别成分的选择是要保证它们孕育在有可能或已经遭受侵袭的器官的正常组织,以抵卸入侵的肿瘤细胞。这样就能防止转移部位的产生,诱发现有部位的萎缩或限制原发性肿瘤的侵犯。