专利名称：用于感染的酶疗法的制作方法在联合国经济和社会事务部人口处(the United Nations Department of Economic and Social Affairs Population Division)的 1998 年世界人口估计和计划修订本(Revision of the World Population Estimates and Projections)中，预计世界人口将于1999年达到60亿。报告还说明，世界人口从50亿增加到60亿仅用了 12年，相比之下，世界人口从10亿增加到20亿却用了 123年。到21世纪中期，计划人口会在73亿至 107亿之间。最近十年间显著的人口增长部分是由于应用技术和集约化粮食生产措施导致的粮食生产的有效增加所致。对于将来的增长，需要粮食生产更有效的增加跟上增长。一种使动物性食品生产更为有效的方法涉及在动物饲料中广泛使用抗微生物化学药品和抗生素。在大规模农场内，感染的传播在密集型生产条件下非常迅速。因此，通过预防性和治疗性应用这些物质来控制流行性疾病。例如，通常的做法是在动物饲料中掺入防治球虫感染的化学药品(例如，沙利霉素、莫能星、罗沙胂(3-硝基)、哈喹诺、卡巴多司和奥喹多司)以及抗微生物的抗生素(例如，杆菌肽、维吉霉素、泰洛星、四环素、金霉素、青霉素、竹桃霉素、新生霉素、林可霉素、班贝霉素、安普霉素、螺旋霉素、红霉素、新霉素等等)。 众所周知这种做法可促进生长并提高饲料转化率。在诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilus influenza)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)禾口结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的人类病原体中，多重抗生素抗性的增加已产生这样的担心与家畜相关的微生物中发生的抗生素抗性可以通过可转移抗药性因子迁移至人类病原体中。有证据说明，喂以抗生素的动物是带有可转移抗药性因子的细菌源。参见Hooge，Feedstuffs 71 (20) :59，1999。虽然动物和人类所用的抗生素一般不同，但是在可能产生交叉抗性的机理方面有相似性。在一种情况下，氟喹诺酮(fluroquinolone)被批准用以防治某些动物的大肠杆菌感染(大肠杆菌病)并且也用于人类医药中。Hooge，参见上文。最近，由于发生氟喹诺酮抗性弯曲杆菌并且转移到人，因此FDA/CVM已经建议取消在家禽中使用氟喹诺酮恩氟沙星的批准。参见Murhead， S. Feedstuffs 72(45) 1-4，2000。如果在饲料中禁止使用抗生素和抗微生物药，则肉品生产业也担心会造成损失并可能发生动物病的死灰复燃。例如，在1986年，瑞典禁止使用饲用抗生素后，动物病增加。这伴随增加使用治疗性抗生素，导致抗生素使用总体增加以及肉畜生产成本增加。 参见 Smith，Feedstuffs 71 (13) :1，1999。1998 年 12 月，欧洲部长级会议(EU Councilof Ministers)决定暂停使用正式批准为饲料生长促进剂非处方药中的六种抗微生物药(Official Journal of the European Communities 29. 12.98, Council Regulaion No. 2821/98concerning Directive 70/524) 由于人们担心肉制品中的残留物，两种基于喹喔啉的添加剂也于1999年8月被禁止使用。这些做法的结果是增加了包括以下正式消除病症的流行肉用仔鸡坏死性肠炎；断奶仔猪中由于产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的肠炎；猪痢疾和螺旋体性腹泻；和大肠杆菌相关腹泻。参见Miller， United States Animal Health Association, 1999 Proceedings nnn sj] ^ ^Zfe Φ W 抗生素使用禾口抗性——欧洲前景(Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective)，，。每年有30，000人由于在医院内感染抗性病原体而死亡，但是由于经食物传播的病原体引起的死亡却少得多。由经食物传播的病原体引起的死亡中没有一例与抗生素抗性有关(参见Smith，参见上文)。因而，并不清楚肉品生产业使用抗生素是否对人类医院内感染抗药性病原体的问题产生影响。另一担心是缺乏治疗抗性病原体感染的新型抗生素。Henry, C. Μ. ，Chemical and Engineering News, 2000 ^ 3 ^ 6 H,H 41-58 胃。 能意味着，当发生重大抗生素抗性病原体时，可能没有有效治疗所述感染的新型抗生素。开发抗生素的困难、市场大小以及管理问题似乎都使大的制药公司不将其R&D集中到抗生素研制、尤其是用于动物的抗生素研制。对于注册动物用药物的新提出的规定如此之难，使得会停止研制动物用药物。参见Smith，参见上文。然而，已有数个小公司参与新型抗生素的研制(Henry，参见上文)。在某些动物群体中，传染病已经大流行。例如，禽球虫病就是一种只能处理，而没有得到真正控制的疾病。事实上所有禽群都被感染，并且通常在饲料中轮换使用抗球虫病化学药品，以控制损失，限制抗性株的发生。球虫病使家禽生产者每年因损失和花在抗生素药物(例如沙利霉素)上的药品费用达$3. 5亿。参见Suszkiw，USDA Agricultural Research Service News，1997年10月沘日。截止1999年，据估计美国每年花费约$1. 1 亿用在抗球虫药上° 参见 Frost 禾口 Sullivan, U. S. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report 5245-54,1995。显然需要发现新的更为有效的方法，以防治采用集约农业技术培育的动物的消化道感染。这种需求基于获得更高生产效率，以便跟上快速膨胀的世界人口的需要。肠传染病防治的改进保证较快的生长率并提高饲料转化率。家畜生产中也需要代替抗生素的替代物，以解决人们担心人类病原体中可能发生抗生素抗性的问题。当采用以不同于所有抗生素的方式操作的基于酶的疗法时，没有刺激抗性致病微生物(它们给人类健康带来问题)进化的危险。由于酶是蛋白质，因此不可能在肉制品中掺入危险性化学残留物，用某些抗生素和抗球虫病化学药品会发生这种情况。参见American Feed Control Officials Inc. ,Official Publication，1999，“药物和饲料添加剂(Drugs and Feed Additives)，Section 30. OEnzymes, ”第 206-217 页，ISBN 1-878341-10-3。发明概述因此，本发明的一个目的是提供降低消化道感染影响的酶疗法。本发明的另一个目的是提供通过干扰病原体与消化道细胞的结合降低消化道感染影响的机制。就感染引起感染或坏死性肠炎的病原体的动物而论，本发明的又一个目的是提供提高增重和饲料转化率的方法。本发明的再一个目的是提供一种适合于口服的剂型，所述剂型有效改善被微生物病原体感染或有被微生物病原体感染危险的受治疗者的病症。在达到这些目的和其它目的的同时，按照本发明的一个方面，还提供一种包含以下组分的组合物(i) 一种切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶，所述酶不是内-1， 4-β-D-甘露聚糖酶，和(ii) 一种所述酶的生理上可接受的载体，其中所述组合物为适合于口服的形式并且不含除所述酶以外的抗感染药。在一个实施方案中，所述酶切割影响细胞表面蛋白释放的键。在一个优选的实施方案中，所述组合物中包括的酶是鞘磷脂酶或磷脂酶、尤其是 C型或D型磷脂酶。在另一个优选的实施方案中，所述选自切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酯酶、脑苷脂酶和糖酶。在另一个实施方案中，由蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株、优选ATCC 7004或ATCC 6464制备所述酶。或者，通过在巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)中表达编码所述酶的重组DNA获得所述酶。在另一个实施方案中， 所述酶包含在明胶胶囊壳内，并且在所述组合物中用量为200IU/Kg-4000IU/Kg饲料。按照本发明的另一方面，提供具有上述组分(i)和(ii)的组合物，其中所述生理上可接受的载体是在其中掺入所述酶的饲料。因此，所述组合物可以是不含除所述酶以外的其它抗感染药的动物饲料。本发明的动物饲料组合物还包含谷类物料(例如玉米、高粱、 小麦、大麦或燕麦)、蛋白质源(例如菜豆或豌豆)和维生素、氨基酸和矿物质。按照本发明的再一方面，本发明提供如上所述的为固体或液体剂型的组合物。还提供治疗消化道感染或降低消化道感染危险的方法，所述方法包括给予患有所述感染或有患所述感染危险的受治疗者口服有效量的切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶。其中所述酶不是内-I，4_i3-D-甘露聚糖酶。另外，所述方法不包括给予除所述酶本身以外的抗感染药。所述感染可以由原生动物(例如艾美耳球虫属(Eimeria)和隐孢子虫属(Cryptosporidium))、细菌(例如梭菌属(Clostridium))、真菌或酵母病原体引起。甚至还提供包含以下组分的组合物(i) 一种切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶和(ii) 一种所述酶的生理上可接受的载体，其中所述组合物为适合于口服的形式并且不含除所述酶以外的抗感染药。还提供治疗消化道感染或降低消化道感染危险的方法，所述方法包括给予患有所述感染或有患所述感染危险的受治疗者口服有效量的切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的酶，其中所述方法不包括与所述酶一起给予抗微生物有效量的另外的抗感染药。根据以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。虽然指出了优选实施方案，但所给出的详细描述和具体实施例仅用于说明，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员是显而易见的。此外，所述实施例证明了本发明的原理，但不能期望具体描述本发明对于显然对本领域技术人员有用的所有的感染实施例的应用。附图简述图1显示由巨大芽孢杆菌菌株产生的重组PI-PLC酶的抗隐孢子虫活性。发明详述已经发现一类特定的酶在口服给药后显示出显著的抗生素活性，所述酶的特征在于切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的能力，所述酶例如在治疗消化道感染时有效。 所述酶类包括但不限于鞘磷脂酶和C型磷脂酶和D型磷脂酶以及有类似切割特异性的酶。 因此，该类酶的示例是切割和释放通过连接于磷脂酰肌醇的键而锚定膜的糖蛋白或糖类的酶。因此，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (E. C. 3. 1.4. 10)(也简称为PI-PLC或1-磷脂酰肌醇磷酸二酯酶)是该类中的一个成员。另一个实例是糖基-磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D或 GPI-PLD。 Low 禾口 Prasad，Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :980-984,1988。已经描述了来源于真核生物的GPI-PLD和PI-PLC酶。参见Low，“通过特异性磷脂酶降解糖基-磷脂酰肌醇锚着点(Degradation of glycosyl-phosphatidylinositol anchors by specific phospholipases) ”，第二章，第 35-63 页，载于 MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS :GLYC0LIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS, A. J. Turner (编辑)，Ellis Horwood, New York, 1990 ；Low 禾口 Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :980-984,1988 ；Essen 等，Nature 380 :595-602,1996 禾口 Essen 等，Biochemistry 36 :2753-2762,1997。已经描述了来源于原核生物的PI-PLC，包括由细菌胞外产生的 PI-PLC0在PI-PLC已知的细菌源中有蜡样芽孢杆菌(Stein和Logan, J. Bacteriol. 85 369-381,1963 ；Stein 禾口 Logan, J. Bacteriol. 90 :69-81,1965 ；Ikezawa 等，Biochimica et Biophysica Acta 450 :154-164,1976 ；Griffith 等，Methods in Enzymology 197 :493-502,1991 ；Volwerk 等，J. Cell. Biochem. 39 :315-325, 1989 ；禾口 Kuppe 等， J.Bacteriol. 171 :6077-6083,1989)> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) (Ikezawa 和 Taguchi，Methodsin Enzymology 71 :731-741,1981 ；日本专利文件 JP 55034039)、金黄色葡萄球菌(Low 和 Finean，Biochem J. 162 :235-240,1977)和诺氏梭菌 (Clostridium novyi)(Taguchi 禾口 Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys. 186 :196-201,1978)。已经基于荧光底物设计出PI-PLC酶的改进酶测定技术。参见Hendrickson 等，Biochemistry. 31 :12169-12172,1992 ；Hendrickson, Anal.Biochem. 219 :1-8,1994 ； Hendrickson 等，Bioorg. Med. Chem. Letters. 1 :619-622,1991。虽然不明确归于任何理论，但本发明强调PI-PLC酶有切割细胞表面蛋白的磷脂酰肌醇糖脂锚着点和其它糖基磷脂酰肌醇的能力。参见Low，参见上文；Low和Mltiel， Science 239 :268_275，1988。例如，几种原生动物寄生虫的变异型表面糖蛋白和其它表面蛋白以及糖类被糖基-磷脂酰肌醇磷脂(GPI锚着点)锚定，并且对PI-PLC消化和释放敏感。说明性的物种属于血吸虫属(Schistosoma)、弓形体属(Toxoplasma)、疟原虫属 (Plasmodium)、锥虫属(Trypanosoma)和利什曼原虫属(Leishmania) (Low，参见上文)以及艾美耳球虫属(Eimeria)、巴贝虫属(Babesia)、泰累尔梨虫属(Theileria)、贾第鞭毛虫属(Giardia)、细滴虫属(I^ptomonas)和内阿米巴属(Entamoeba)。参见 McConville 和 Ferguson, Biochemical J. 294 :305-324,1993 ；Pearce 禾口 Sher，J.Immunol. 142 :979-984, 1989 ；Sauma 等，Mol. Med. Biochem. Parasito 1. 46 :73-80,1991 ；Hawn 禾口 Strand，Mol. Med. Biochem. Parasito1. 59 :73-82,1993。看来细胞表面组分的这种锚定机制对于范围从酵母到哺乳动物的真核细胞而言是普遍存在的。被认为是非常原始的真核生物一兰氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)体内存在GPI锚着点，表明这种锚着点很早在真核生物中进化。与这一了解相一致的是在古细菌中发现了一种新型甘油磷脂GlcNal-6-肌醇-P-二烷基甘油(Nishihara等，J. Biol. Chem. 267 :12432-12435)，它是已进化的更为复杂的真核生物GPI锚着点结构的基础。在原生动物中，使用GPI锚定系统比在高等真核生物中更为大量，有证据说明GPI-锚定结构对于寄生物在昆虫和哺乳动物宿主体内存活很重要(McC0nville*i^rguS0n，参见上文)。 例如，变异型表面糖蛋白的频繁脱落可能是避免免疫系统攻击的机制。原生动物柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)含有与布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的糖蛋白/糖脂类似的磷脂酰肌醇锚定结构。认为这些结构对于膜附着以及后续感染很重要。参见 Gurnett 等，Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41 :177_186，1990。艾美耳球虫属结构被锥虫脂酶和苏云金芽孢杆菌PI-PLC切割(Gurnett，参见上文)。用PI-PLC 体内治疗寄生虫，如果证明切实可行的话，可能有助于宿主免疫系统并且干扰进入消化道的病原体的附着和感染。艾美耳球虫分布广，并且是养禽业费用大的问题。另一种原生动物寄生虫微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)分布广，并且在人类和许多动物中引起急性腹泻性疾病。基于DNA序列，预测子孢子蛋白GP15/45/60为GPI联蛋白，并且与该子孢子蛋白反应的单克隆抗体抑制感染(Strong，W. B.等，hfection and Immunity 68: 4117-4134,2000 ；Cevallos,A. Μ.等，Infection and Immunity 68 :4108-4116,2000) 因此，微小隐孢子虫是另一种可用PI-PLC潜在治疗的病原体。原核细菌不含被磷脂酰肌醇锚定的表面糖蛋白和糖类(McConville和Ferguson， 参见上文)，但是PI-PLC仍可能通过干扰附着过程来降低细菌感染。致病大肠杆菌和许多其它熟知的致病肠杆菌科(Enterobacteriaceae)表达细菌粘附素FimH，一种存在于菌毛远端的^kD甘露糖结合凝集素。Abraham等，Nature 336 :682_684，1988。已经显示这种粘附素与肥大细胞的CD48，即GPI锚着分子结合。参见Malaviya等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8110-8115,1999。用PI-PLC体外消化，降低了突变型GPI锚着白喉毒素(来自白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria))受体与鼠类NIH3T3细胞的结合。参见Lanzrein 等，EMBO J. 15 :725-734，1996。另外，败毒梭菌(Clostridium septicum) α 毒素和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气单胞菌溶素均借助于C末端GPI锚着点附着于细胞表面，并且可以通过用PI-PLC处理而从细胞表面去除。参见Gordon等，J. Biol. Chem. 274 27274-27280,1999。PI-PLC降低细菌感染影响的机制涉及从宿主肥大细胞释放CD48结合部位。此外， FimH与肥大细胞结合触发炎症反应。因而按照本发明，由于炎症反应涉及肿瘤坏死因子α 的释放，因此减少结合部位也应该减少可能极度损害肠健康本身的炎症(Malaviya，参见上文)。因此，通过这种减少炎症和构成肿瘤坏死因子分泌的基础的机制，按照本发明进行磷脂酶处理，应该缓解特征性病症(例如过敏性肠综合征、结肠炎和局限性回肠炎)的症状。 参见 van Deventer, S. J. , Ann. Rheum. Dis. 58 (1) :1114-1120 (1999 年 11 月)。针对病毒性感染，本发明也应该有效，由于它破坏病毒粒子和该病毒将体内感染的细胞之间的结合。根据本发明人的发现，本文中描述的口服给药是有效的，有趣的是，用磷脂酶C预处理流感病毒，引起约50%病毒磷脂的释放，导致显著减少鸡胚内的感染性。参见Mizutani等，Nature 204 :781-782,1964.相反，用从产气荚膜梭菌中分离的磷脂酶C预处理培养的鸡胚成纤维细胞，显著抑制西门利启森林甲病毒(Semliki Forest Virus)对细胞的后续感染。参见 Friedman 和 Pastan，Proc. Natl. Acaa. ki. USA 59 :1371_1378，1968。虽然当时本领域并没有认识到这些现象中的治疗意义，但事后认识到，它们与认为构成本发明基础的一种机制相一致，即病原体-表面配体和/或其相关的细胞膜受体的切割，中断了感染所必需的相互作用。本发明在预防病毒性感染方面可能有效的另一种方式是消除了病毒GPI锚定蛋白与易感细胞的结合。对PI-PLC消化敏感的病毒GPI锚定蛋白的一个实例是登革病毒(Dengue Virus) NSl (非结构蛋白 1)。参见 Jacobs 等，FASEB J 14:1603-1610， 2000。有多个作为病毒结合部位的宿主细胞GPI锚定蛋白的实例。这些实例包括结合 GPI锚定CD55(衰变加速因子，DAF)的人艾可病毒(Echovirus)6、7、12和21以及肠道病毒(Enterovirus) 70。 参见 Clarkson 等，J. Virology 69 :5497-5501,1995；Bergelson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :6245-6248,1994 ；禾Π Karnauchow 等，J. Virology 70 5143-5152,1996。犬细小病毒(Canine Parvovirus) (CPV)感染可以通过用PI-PLC预处理猫细胞来体外阻断。参见 Barbis 和 Parrish，Brazilian J. Med. Biol. Res. 27 :401-407, 1994。推定对起始感染重要的某些细胞表面受体通过非GPI锚着点的机制附着于膜上。 这些包括以下结构例如胆固醇酯(Rostand和Esko, J. Biol. Chem. 268 =24053-24059, 1993)、非磷酸化鞘糖脂(Kar Is son, Ann Rev. Biochem 58 :309-350,1989)和诸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的其它磷脂。参见Sylvester，Infect. Immun. 64 :4060-4066,1996。因此，由于上述原因，在按照本发明口服给药后，用对从细胞表面释放这些结构有活性的合适酯酶、脑苷脂酶、糖酶和磷脂酶靶向这样的结构，应该对治疗消化道感染具有有益的效应。鉴于真核生物中的磷脂酰肌醇连接的表面蛋白的普遍性，需要给予酶来急性或预防性切下这种细胞表面蛋白和/或糖类的锚定键的本发明的治疗方法，，将发现可广泛应用于控制消化道的原生动物、细菌、真菌和病毒感染。为此，本发明的一个关键方面是证实可以口服给予作为抗感染药的一种酶，所述酶不仅在切除细胞表面组分中有活性，而且在体内也有效。值得注意的是，自I960年起一直就可以利用合适的代表性酶PI-PLC，但是迄今为止本方法还没有被提出过。本发明的另一方面是应用如上所述的酶作为动物饲料制剂中的有效抗感染药，所述酶治疗消耗所述饲料的动物的消化道感染或降低所述消化道感染的危险。含有内-1， 4-β-D-甘露聚糖酶的饲料制剂是已知的，并且有些报道已经提出甘露聚糖酶的抗真菌活性。参见 WO 00/21381 (PCT/EP99/07835)和 Kudo 等，Experentia 48:227-281,1992。虽然已经广泛地讨论了在不含抗生素的饲料中酶应用的前景，但是在这些情况下，都是将甘露聚糖酶与已知的抗生素混合。Adams, Feed Mix (2000年特刊)，第16-18页。因此，在本发明的一个方面，本发明涉及含有特征为上述切割活性的酶的组合物， 包括饲料组合物，所述酶不是甘露聚糖酶，或更准确地说不是内-I，4_i3-D-甘露聚糖酶， 与例如针对甘露聚糖的酶的区别在于具有不同的切割特异性，如在ENZYME NOMENCLATURE 1992 (Academic Press)(参见条目 3. 2. 1. 77,3. 2. 1. 78,3. 2. 1. 101,3. 2. 1. 106,3. 2. 1. 130 和3. 2. 1. 137)中所述。此外，本发明考虑了含有这种酶(包括甘露聚糖酶)、但不含其它抗感染药的组合物。因此，按照本发明，可以用得自蜡样芽孢杆菌并将PI-PLC含量标准化的胞外酶制9剂，在感染存在时在增重和饲料转化率方面产生非常显著的改善。这种结果是出乎人们所料的，因为蜡样芽孢杆菌是通常引起食物传染性胃肠炎和蜡样芽孢杆菌眼内炎的机会致病菌。早期研究报道将炭疽芽孢杆菌(B. anthracis)胞外酶或蜡样芽孢杆菌胞外酶注射到兔子体内，引起磷酸酶血症，甚至死亡。例如，参见Mein和Logan，J. Bacteriol. 85 369-381,1963。因此，令人惊奇的是，按照本发明，对于由细菌性感染引起的疾病来说，得自引起胃肠炎的病原体的胞外酶会具有治疗效应。蜡样芽孢杆菌合成各种各样的由磷脂酶C和鞘磷脂酶组成的胞外膜活性酶和溶细胞毒素，包括 PI-PLC 和赌溶素(Cereolysin)AB。参见 GiImore，J. Bacteriol. 171 744-753,1989。在上述酶制剂中，由蜡样芽孢杆菌产生的胞外磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C[E. C. 3. 1. 4. 10]被认为是一种有效成分。本发明的酶疗法有效地作为抑球虫剂和抗生素起作用。因此，本发明的疗法特别是在禁止目前使用的物质时是一种治疗消化道感染的有效的商业上有前途的方法。如果不包衣，酶能够由于胃内的胃液而不可逆失活。美国专利第4，079，125号描述了改进的可供缺乏酶的哺乳动物摄入的包肠衣的含酶组合物。令人惊奇的是，将没有包衣的PI-PLC加入到动物饲料中导致有效治疗病原体性感染。按照本发明的酶组合物最好配制为干燥的固体或液体口服组合物。这种组合物一般会包括稳定剂，例如缓冲剂、糖类和/或甘醇。按照本发明，适合于在片剂或胶囊中掺入的干燥的贮存稳定的酶制剂如下制备例如可以通过冻干法，在含有惰性或糖载体的流化床干燥器中进行喷雾干燥，或利用结合成玻璃稳定剂的蒸发技术。参见Franks等， Biopharm. 4 =38-55,1991。另一种方法包括盐沉淀(例如硫酸铵沉淀)或溶剂沉淀(如用丙酮)，形成粉末，随后干燥并与载体混合。某些糖类、特别是单糖、二糖和低聚寡糖是重要的成玻璃糖类。用作载体的示例性糖其中有木糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇和麦芽三糖，如Franks所述，参见上文。基于与所述酶的相容性、低吸湿倾向和有利的玻璃化转变曲线，选择糖载体。稳定剂海藻糖特别适用于生产环境温度稳定的生物制品。参见美国专利第4，891，319号；Roser, Biopharm. 4(8) 47-53,1991 ；Colaco 等，Bio/Technology 10 1007-1011,1992 ；Aldridge, Genetic Engineering News, 1995 年 3 月 15 日，第 10-11 页。本发明的酶可以配制为液体，例如作为含有降低水活度并且稳定所述蛋白的山梨糖醇或甘油的糖浆。这种溶液通常在制药应用之前进行过滤除菌。如上所述，一方面，本发明涉及作为饲料或食料组分的酶的传递。饲料主要由谷类物料、蛋白质源、维生素、氨基酸和矿物质构成。所述谷类物料通常包括玉米、高粱、小麦、大麦或燕麦。所述蛋白质源可以是例如菜豆或豌豆。示例性矿物质、氨基酸和维生素包括b12、 Α、泛酸、烟酸、核黄素、K、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、氯化胆碱、叶酸、磷酸二钙、磺酸镁、硫酸钾、碳酸钙、氯化钠、亚硒酸钠、一氧化锰、碘酸钙、一氧化铜、氧化锌和D-活化的动物甾醇。供饲料中使用，可以用盐水(例如，NaCl, 15-18% w/w)或降低浓缩产品中水活度并防止微生物生长的糖浆制备液体酶制剂。诸如苯甲酸钠、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸钠或山梨酸钾、以及棕榈酸抗坏血酸酯的其它饲料用防腐剂都是经批准的化学防腐剂的实例， 所述防腐剂也可以用来防止制品中由于微生物生长引起的潜在变质。参见Association ofAmerican Feed Control Officials, Inc. , Official Publication 2000，第 18 部分，“化学防腐剂”，第215-217页，ISBN 1-878341-11-1。这些防腐剂可以用自动喷雾技术通过制粒后大量稀释而应用于饲料。参见i^odge等，FeedStuffS，1997年9月四日。如果相容的话，这种液体制剂可以含有稳定性糖类，例如山梨糖醇或甘油。为提高转化率，可以包括作为饲料所需组分的材料，例如其它酶或热不稳定的维生素。在饲料以非颗粒的粉料形式(即不经热处理)使用的情况下，本发明的酶可以作为干浓缩物提供，以供在饲料混合器中添加。这种干酶浓缩物如下制备首先采用 IOKd NMWC或其它合适的超滤器浓缩液体酶制剂，以达到高百分率的酶含量，然后与非常干的载体例如粗玉米粉、粗大豆粉或甚至批准用于饲料的惰性物质或不溶性盐掺混。参见 Official Publication, American Feed Control Officials，参见上文，第 582 部分，“动物饲料中一般认为安全的物质”。有多种技术可用来产生足以耐受某些饲料碾磨机制粒过程、同时在较低温度下保持足够的活性以在消化道内起作用的稳定的酶。众所周知修饰蛋白质结构，主要通过改变编码DNA序列，或者其次，通过化学修饰，可以使酶更稳定，以抵抗失活。在该方面的一个说明是应用酶晶体的化学交联。参见Collins等，Organic Process Research and Development 2(6) :400-406,1998.增加本发明酶稳定性的另一种方法需要通过诱变编码目的酶的基因来改变氨基酸，或获得可供改组的基因或基因的一部分。参见Crameri等， Nature 391 :288-291,1998 ；Arnold，Nature Biotechnol. 16 :617-618,1998b ；Zhao 等， Nature Biotechnol. 16 :258-235,1998 ；Zhao 禾口 Arnold，Protein Eng. 12 :47_53，1999。突变和选择以使具有所需特性的酶“定向进化”也是切实可行的。例如，参见Giver等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 12809-12813，1998 ;Liao 等，Proc. Nat’ 1. Acad. Sci. USA 83: 576-580，1986 ；Cherry 等，Nature Biotechnol. 17 :379-384,1999。某些蛋白质的修饰(包括糖基化、PEG化(PEGylation)和琥珀酰化)也可以增强稳定性并改变最适PH，这些是可以使本发明中所用酶最优化的特征。因此，已知的方法可以在这方面用来制备经修饰的酶，以供按照实施例进行测试，以估计本发明疗法的适应性。用于生产PI-PLC的一种有效方法是将蜡样芽孢杆菌基因克隆到巨大芽孢杆菌中。表达系统(Rygus 和 HiIlen，Appl. Microbiol. Bacteriol. 35 :594-599,1991)利用得自巨大芽孢杆菌木糖调节子的元件(Rygus等，Arch. Microbiol. 155 =535-542,1991)，并可在市场上从BIOlOl Corp. (Vista，California)获得。在用四环素抗性稳定化质粒中，在 PI-PLC基因前导编码序列和巨大芽孢杆菌xylA基因的前三个氨基酸之间产生融合体，所述融合体受木糖效应阻抑蛋白调节。具有增强表达的该类型的菌株为生产按照本发明掺入到动物饲料中的商业上有用量的PI-PLC提供了一种切实可行的方法。某些蜡样芽孢杆菌分离株产生诸如衣霉素的抗生素。参见Kamogashira等， Agric. Biol. Chem. 52 :859-861,1988。赌样芽孢杆菌的另一分离株(ATCC 53522)在美国专利第4，877，738号和第5，049，379号中被描述为预防植物猝倒病和根腐病的生物防治药。 认为这种作用是由于以下两种抗生素的作用引起的名为“Zwittermicin”，一种396道尔顿线性氨基多元醇；和“抗生素B”，一种氨基糖苷。在下文详述的实施例中，通过排除酶制剂中可能的低分子量抗生素，消除涉及这两种抗生素的可能性。具体地说，借助于一种IOKd分子量截止膜，浓缩无细胞发酵肉汤。含有大于IOKd的蛋白质的浓缩物用于进一步加工。诸如Handelsman描述的小分子量抗生素(参见上文) 会通过该滤膜。而且，利用硫酸铵沉淀法沉淀溶液中的高分子量蛋白质，留下低分子量物质。将硫酸铵沉淀物重新溶解后，所得酶溶液对缓冲液透析，再一次处理以去除低分子量抗生素。最后，将所述蛋白质再用硫酸铵第二次沉淀，以去除溶液中任何余下的低分子量化合物。这四种处理法的联合应用非常不利于下述的可能性所观察到的抗生素效应是由于ATCC 6464或ATCC 7004产生的低分子量抗生素引起的。也用大肠杆菌试验菌株，测试发酵肉汤中存在的抗生素，但未检测到抗生素的活性。参照以下说明性实施例，下文进一步描述了本发明。实施例1蜡样芽孢杆菌ATCC 6464和ATCC 7004冷冻储备培养物的制备打开得自ATCC的装有冻干细胞的管形瓶，将冻干细胞接种到由10g/L Amberferm 4015 (Red Star) ,5g/L Amberex 695 (Red Star)和 5g/L 氯化钠、pH 7.0 构成的种子培养基中，于30°C生长。将原始培养物在LB肉汤琼脂板上划线接种，然后将所得单菌落接种到装有20mL种子培养基的250mL带挡板的摇瓶(Bellco)中，于30°C振荡培养。当培养物密度达到OD6tltl读数为1. 5时，加入无菌甘油至约10% v/v，将装有1. SmL培养物的管形瓶于-80°C 冷冻。实施例2培养蜡样芽孢杆菌ATCC 6464和ATCC 7004分离株用以生产磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C两个Biostat C发酵罐(每个30升)，分批装入自来水中的以下物质组成的培养基:25g/L 2号营养肉汤(Oxoid)，10g/L胰蛋白胨(Difco)，10g/L酵母提取物(Difco)和 0. lmL/L Mazu DPlOP Modll消泡剂(BASF)。原始批料体积为9. 5L,肉汤于121°C灭菌40 分钟。灭菌后，将初始PH用氨气调至7.0。在含500mL相同培养基的4升带挡板的摇瓶中，制备种子培养物用于接种，所述摇瓶带有抽气器连接件(Bellco)以及与连接件连接的硅氧烷管。将摇瓶在高压灭菌器中于 121°C灭菌50分钟，然后用由ATTC寄出的样品(shipment)制备的1. SmL冷冻储用培养物 (实施例1)接种前。将种子摇瓶培养物在可控环境震荡培养器(NBS G-25型)中以200RPM 于30°C振摇培养5. 5小时。接种前，ATCC 7004培养物的OD600为1. 53，pH为6. 58。ATCC 6464 培养物的 OD600 为 1. 28，pH 为 6. 79。将500mL种子培养物接种到30_L发酵罐中并在以下条件下进行操作温度30°C， 混合RPM 600，气流10升/分钟，压力0. 5巴。原始培养物的OD6tltl为0. 81。在6小时时， 终止发酵，ATCC 7004的终OD6tltl为22. 1，ATCC 6464的终OD6tltl为2。在不控制pH下进行发酵，ATCC 7004的终pH为8. 17，ATCC 6464的终pH为8. 13。进一步加工之前，从发酵罐中取出肉汤，将其冷却至8 °C。实际上用与所述两种ATCC蜡样芽孢杆菌分离株相同的方法，所述发酵罐再进行第二次发酵。在这种情况下，使用第6小时的种子培养物，0D_为2.86(ATCC 7004)，OD600 为 1. 98 (ATCC 6464)，pH 为 6. 69 (ATCC 7004)，pH 为 6. 65 (ATCC 6464)。主发酵进行 6. 5 小时，终 0D_ 为 35. 9 (ATCC 7004)，终 OD6tltl 为 33. 6 (ATCC 6464)。冷藏时的终 pH 为 8. 38 (ATCC 7004)，终 pH 为 8. 47 (ATCC 6464)。实施例3通过过滤去除细胞以及PI-PLC酶的浓缩采用两个首尾相连的A/G Technology (UFP-500-K-6A) 3mm中空纤维500，000分子量截止(500Kd NMWC)滤器，从4个发酵罐批料中每个批料取出并洗涤细胞。用蠕动泵以约 2升/分钟，通过滤膜泵出冷却的肉汤，再循环回贮存器。将含所述酶的透过液收集到冰上冷却的贮存器中。将含细胞的肉汤原始体积约9升浓缩至约2升，此时用IOmM Tris-HCl, PH8. 5开始渗滤。在收集总体积约14升透过液后，终止细胞洗涤。用两个首尾相连的A/G Technology (UFP-10-C-4XTCA) 0. 5mm 中空纤维 10，000 分子量截止滤器(IOKd)，浓缩500Kd透过液(每个发酵罐约14升)。使用浓缩物再循环的相同泵送方法，只是弃去透过液。将得自每个发酵罐体积约500mL的终浓缩物用于下一个加
工步骤。实施例4PI-PLC酶的进一步纯化和浓缩将得自每种蜡样芽孢杆菌发酵的IOKd超滤浓缩物(实施例3)用硫酸铵调至80% 饱和度，在冰上混合60分钟。将溶液在Sorvall GSA转子中以6000RPM离心15分钟。弃去上清液，将沉淀溶于最小体积的IOmM Tris-HCUO. 2mM EDTA(pH 7.5)中，然后对同样缓冲液冷透析。采用染料结合测定(BioRad)测量每种浓缩物中的蛋白质，采用基于HPLC的检测方法和荧光底物(Molecular Probes, Inc.，P-3764，1_芘丁基肌醇磷酸，锂盐)，测定 PI-PLC 的水平(Hendrickson 等，Bioorg. Med. Chem. Letters 1 :619-622,1991)。下表 1 总结了测定数据，并根据对4种制剂中的每种制剂所得的纯度，预测了大致纯度和总酶量。酶制剂于-20°C冻藏待进一步加工。表1. PI-PLC粗酶制剂的分析汇总
ATCC蛋白质比活制剂中估计的按纯量酶制剂菌林mg/LU/mg1总蛋白纯度2计算的编号(Hlg)%总 PI-PLC(mg)170041.861.753252.929.49264641.440.523450.8672.99370041.354.422087.3615.3464642.061.722561.955.001U =单位=1微摩尔/分种。2基于假定100%纯蛋白质的比活为60U/mg(HendrickSOn，参见上文)。实施例5酶制剂应用于动物饲料之前的合并和浓缩合并所述酶制剂1、2、3和4，总体积为675mL。缓慢加入硫酸铵(492g)，然后将溶液在冰上混合几分钟。将溶液离心，收集沉淀。将沉淀部分溶于最小量的20mM磷酸缓冲液 (pH 7. 0)中。所得溶液为70. 9mL，密度1. 057克/cc。测定的蛋白质浓度约为25. 5mg/mL。测定的PI-PLC活性约为1. 13U/mg,PI-PLC的估计纯度为1. 88%。将全部溶液于_20°C冻藏，解冻后用于均勻处理200磅鸡饲料。
实施例6蜡样芽孢杆菌PI-PLC基因的克隆和在巨大芽孢杆菌中表达已经对编码磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的基因进行了测序。参见Kuppe 等，J. Bacteriol. 171 =6077-6083,1989 采用 PCR 技术，从蜡样芽孢杆菌(ATCC 6464)染色体DNA中克隆PI-PLC基因。使用巨大芽孢杆菌表达载体pMEGA (BIO 101, Vista, CA) 0设计两种引物，即 5，-GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3，(弓丨物 1)和 5，-CGGGATCCATATTGTTGG TTATTGG-3’ (引物2)，其中引物-1中有一个SpeI位点，引物_2中有一个BamHI位点。将经PCR扩增的PI-PLC基因连接到pMEGA的SpeI-BamHI位点中，产生质粒 PCG682。在所述表达载体中的SpeI位点上，将PI-PLC蛋白与xylA基因产物的前三个氨基酸融合。PI-PLC基因的表达在xylA启动子的调节下进行。用摇瓶发酵评价巨大芽孢杆菌中磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的产量。用0. 2mL种子培养物接种含有10 μ g/ml四环素的 LB肉汤(20mL)，于37°C在250rpm的摇床上培养。在OD6tltl约为0. 5时，加入5g/L D-⑴-木糖，以诱导xylA启动子。3小时后，通过离心收获上清液。根据荧光底物方法(Hendrickson 等，Biochemistry 31 12169—12172，1992 ；Hendrickson, Anal. Biochem. 219 :1_8，1994)， 使用I-芘丁基肌醇-I-磷酸底物(Molecular Probes, Eugene, OR)，并通过HPLC检测，测定磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的活性。表2. PI-PLC表达的测量


一类特殊的酶，所述酶的特征在于切割影响细胞表面蛋白或糖类释放的键的能力，不含抗感染药的所述酶显示出显著的抗感染活性。口服后，这些酶例如有效治疗人和动物的消化道感染。在后一情况下，有显著提高生长率、饲料转化率并且改善总体健康状况的益处。