专利名称：一种黄素酶亲和介质及其合成和应用的制作方法自然界中存在大量辅酶依赖酶类，黄素酶是比较重要的一类，在众多的生物反应过程中发挥着重要的作用，如生物能量合成、氧化还原、生物发光、生物降解、染色体重构、 DNA修复、细胞凋亡、蛋白质折叠、生物解毒作用、神经发育、生物合成等。黄素酶类非常适用于使用生物催化的过程，具有较高的对映体及区域的选择性，应用潜力非常广泛；其中，氧化酶类和单加氧酶类的研究最多，由于其底物和辅酶的高度特异性(包括对映体选择性)， 在医药工业、精细化工和食品工业中有很大的应用潜力(见表1)。表1黄素氧化酶类和单加氧酶类的特性及应用"P 実名称，^jiSMffi.黄素甘氨酸氧化 ^硫胺素(维生素Bi)的生化合成,氧化_氨基以及D-氨基酸的脱氨基作用職糖氧化纤维素、多糖的降解P — 己糖氧化Ifr1 生产乳酸。 乳糖氧化生产乳酸。 巯基氧化食品生产过程中蛋白质或者肽段的 _氧化交联》 _L-色氨酸氧化抗肿瘤药物rebeccamycm的生化合 _^_芳香基-醇氧化多聚非饱和醇脱置反应^H00041胆固醇氧化B+ _体外诊断》·_
黄嘌呤氧化酶^_体外珍断^_
mm 黄素羟基化■ (α迎家族)ρ芳苷族的底物特异性的反应ρ
馳 B丑家族成员^_FM/FAD依赖型^_
氧· C丑家族成员^ 以FM为埔广泛参与生物代谢途美 _@_
JD-Hydr oxyphenylac etaie拥有乙酰辅HaK置■的功能^
a-hydro^ylase (D亚家族成员)_
E丑家族成员^氧化苯乙烯及其衍生物,生产对应
_的环氧化合物_
F 家族的成员-活化底物的定点氳化或溴化反应过
程，用于抗生素、抗肿瘤药物以及 _其他天然产物的大规模生产和修饰^ 长期以来，硫酸铵沉淀、三氯乙酸沉淀、透析、凝胶层析等传统方法被用于葡萄糖氧化酶、硫辛酰胺脱氢酶、乳酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、对苯二酚羟化酶等黄素酶的提取与制备；近二十年来，一些较为先进的纯化技术也被引入，如离子交换层析、 羟基磷灰石层析、共价层析、蓝染料层析、金属离子亲和层析等。总体而言，黄素酶种类繁多，各自的结构和功能性质各不相同，制备的方法也各不相同，整体制备步骤复杂且回收率较低。其中，金属离子亲和层析是基因工程菌表达重组蛋白酶纯化的重要手段，但组氨酸标签的加入可能对目标蛋白的结构和功能产生重大影响。蓝染料层析虽然对蛋白质的吸附量比较大，但是蓝染料分子本身具有较强的疏水性，非特异性吸附较强。因此，需要提供一种黄素酶亲和介质，其分离黄素酶快速简单高效，回收效率高。


本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种黄素酶亲和介质及其合成和应用，利用该黄素酶亲和介质可以大规模快速分离纯化黄素酶，可在仅用一步亲和层析的情况下，得到黄素酶纯品，蛋白和活性回收率较高，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种黄素酶亲和介质，其特点是，所述黄素酶亲和介质由黄素酶亲和配体和层析介质连接而成。较佳地，所述黄素酶亲和配体是黄素辅酶核心构件异咯嗪环的结构类似物，所述层析介质是kpharose、壳聚糖、硅胶或陶瓷颗粒。更佳地，所述的黄素辅酶核心构件异咯嗪环的结构类似物是乳清酸、胞嘧啶、7-氯异咯嗪或8-氯异咯嗪。较佳地，所述黄素酶亲和介质由黄素酶亲和配体和层析介质通过环氧氯丙烷和乙二胺、1，3_丙二胺、2-羟基_1，3丙二胺或1，4_ 丁二胺作为间隔臂进行连接。在本发明的第二方面，提供了一种上述的黄素酶亲和介质的合成方法，其特点是， 将所述黄素酶亲和配体和所述层析介质进行连接得到。较佳地，所述黄素酶亲和介质由黄素酶亲和配体和层析介质通过环氧氯丙烷和乙二胺、1，3_丙二胺、2-羟基_1，3丙二胺或1，4_ 丁二胺作为间隔臂进行连接。在本发明的第三方面，提供了一种利用上述的黄素酶亲和介质大规模纯化黄素酶的方法，其特点是，将含有黄素酶的溶液流经所述黄素酶亲和介质进行亲和吸附，然后采用清洗液冲洗所述黄素酶亲和介质，最后用洗脱缓冲液洗脱所述黄素酶亲和介质上吸附的黄素酶，从而纯化黄素酶。较佳地，所述黄素酶是胆固醇氧化酶或黄嘌呤氧化酶。较佳地，所述亲和吸附的条件为pH值6. 5 7. 5，电导率为5-lOms/cm。较佳地，采用清洗液冲洗所述黄素酶亲和介质的清洗条件为pH值6. 5 7. 5，电导率 5 IOms/cm。较佳地，用洗脱缓冲液洗脱所述黄素酶亲和介质上吸附的黄素酶的洗脱条件为pH 值 2. 8。本发明的有益效果具体如下1、本发明通过采用黄素辅酶核心构件异咯嗪环的结构类似物作为黄素酶亲和配体，与层析介质连接合成黄素酶亲和介质，可快速高效纯化黄素酶，适于大规模推广应用；2、本发明通过优化蛋白质吸附条件使得黄素酶的纯化效率显著增加，具有较大工业应用潜力，体现出较大的经济效益。


图1是本发明的16种黄素酶亲和介质的间隔臂与亲和配体的结构示意图。图2是图1所示的16种黄素酶亲和介质在处理与大肠杆菌破碎液混合后的胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶溶液的特异性吸附结果SDS-PAGE电泳图，其中A.泳道M 分子量marker ；泳道1 大肠杆菌破碎液；泳道2 胆固醇氧化酶标准品；泳道3 黄嘌呤氧化酶标准品；泳道4 胆固醇氧化酶与大肠杆菌破碎液混合物；泳道5 黄嘌呤氧化酶与大肠杆菌破碎液混合物；B.泳道M 分子量marker ；泳道1_4 =L-A-I至L_A_4吸附的胆固醇氧化酶；泳道 5-8 =L-B-I至L-B-4吸附的胆固醇氧化酶；泳道9_12 =L-C-I至L-C-4吸附的胆固醇氧化酶；泳道13-16 =L-D-I至L-D-4吸附的胆固醇氧化酶；C.泳道M 分子量marker ；泳道1_4 =L-A-I至L_A_4吸附的黄嘌呤氧化酶；泳道 5-8 =L-B-I至L-B-4吸附的黄嘌呤氧化酶；泳道9_12 =L-C-I至L-C-4吸附的黄嘌呤氧化酶；泳道13-16 =L-D-I至L-D-4吸附的黄嘌呤氧化酶。

L ；叠氮钠0. 2g/L ；过氧化物酶:5000U/L ；磷酸钾缓冲液:25mmol/L, pH 7. 5)，150 μ 1溶液 Β(胆固醇8. 26mg/ml ；Triton X-100 体积分数4. 26%;异丙醇为溶剂),50 μ 1酶液，37°C 反应5min，沸水浴3min，于500nm测吸光度。酶活(U/ml) = 1.6832XA500。酶活力单位定义37°C，lmin转化Ιμπιο 胆固醇生成胆甾_4_烯_3_酮的酶量定义为1个酶活单位(U)。黄嘌呤氧化酶活性测定检测反应显色液4-氨基安替比林 (4-Aminoantipyrine, ΑΑΡ),Immo1/L ；苯酚(Phenic Acid, PA),6mmol/L ;50mmol/L Tris-HCL 缓冲液，50mmol/L ；叠氮钠，0. 02% ；辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)，7000U/L。在具塞试管中，依次加入3mL反应显色液，100 μ L黄嘌呤(Xanthine，XAN)溶液 (40mmol/L)，50 μ L黄嘌呤氧化酶(XOD)酶液(3200U/L)。混勻在37°C加热20min，煮沸5min 终止反应。以不加XOD反应体系作为参比，测定UV-Vis谱(508nm)。实施例2 =Sepharose-胞嘧啶的合成及应用Sepharose CL 4B(100g)用10倍体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于 50ml活化缓冲液(0. 8M NaOH，20%二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次10倍体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液PH至中性，在抽干成湿饼状。SKWkpharose CL 4B介质悬浮于500ml0. IM NaOH 溶液，加入20ml乙二胺(或1，3-丙二胺、2-羟基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺等溶液)，凝胶在搅拌OOOrpm)下30°C恒温12h，用去离子水清洗。胞嘧啶(Cytosine)与50ml活化缓冲液(0. 8M NaOH，20%二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5h后与介质在0. IM NaOH溶液中30°C恒温12h。 反应完毕，用500ml去离子水充分洗涤，抽干。依据乙二胺、1，3_丙二胺、2-羟基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺溶液的不同，可以得到四种不同的黄素酶亲和介质，分别命名为L-B-l，L-B-2, L-B-3, L-B-4。(1)介质最大吸附量的确定确定介质的最大吸附量。取胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶标准品，用去离子水稀释至浓度为 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，调节 pH 值为 7. 0，分别加入 o.oig湿介质，4°C充分振荡ai后，测定上清胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶浓度，计算介质的最大吸附量。吸附量与上清蛋白浓度关系见表2。(2)特异性吸附的验证考察该组介质对胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶的特异性识别，分别取Img胆固醇氧化酶及2mg黄嘌呤氧化酶与20mg大肠杆菌破碎后提取蛋白(提取液用20mM PBs, pH 7. 0)混合，与该组介质进行吸附用pH 7. 0的20mM PBs清洗，最后用0. IM HAc洗脱，采用与实施例1相同的方法测定酶活、含量并进行电泳分析，见表3，图2。实施例3 :Sepharose-7氯异咯嗪的合成及应用Sepharose CL 4B(100g)用10倍体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于 50ml活化缓冲液(0. 8M NaOH，20%二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次10倍体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液PH至中性，在抽干成湿饼状。SKWkpharose CL 4B介质悬浮于500ml0. IM NaOH溶液，加入20ml乙二胺(或1，3_丙二胺、2-羟基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺等溶液)，凝胶在搅拌OOOrpm)下30°C恒温12h，用去离子水清洗。7 氯异咯嗪(7-chloroalloxazine)与 50ml 活化缓冲液(0. 8M Na0H，20%二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5h后与介质在0. IM NaOH溶液中30°C恒温12h。反应完毕，用500ml去离子水充分洗涤，抽干。依据乙二胺、1，3_丙二胺、2-羟基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺溶液的不同，可以得到四种不同的黄素酶亲和介质，分别命名为L-C-l，L-C-2，L-C-3，L-C-4。(1)介质最大吸附量的确定确定介质的最大吸附量。取胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶标准品，用去离子水稀释至浓度为 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，调节 pH 值为 7. 0，分别加入 o.oig湿介质，4°C充分振荡ai后，测定上清胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶浓度，计算介质的最大吸附量。吸附量与上清蛋白浓度关系见表2。(2)特异性吸附的验证考察该组介质对胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶的特异性识别，分别取Img胆固醇氧化酶及2mg黄嘌呤氧化酶与20mg大肠杆菌破碎后提取蛋白(提取液采用20mM PBs, pH 7. 0)混合，与该组介质进行吸附用pH 7. 0的20mM PBs清洗，最后用0. IM HAc洗脱，采用与实施例1相同的方法测定酶活、含量并进行电泳分析，见表3，图2。实施例4 :Sepharose-8氯异咯嗪的合成及应用Sepharose CL 4B(100g)用10倍体积的去离子水洗涤，抽干成湿饼状；悬浮于 50ml活化缓冲液(0. 8M NaOH, 20%二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽滤下经过每次10倍体积的蒸馏水洗涤，直到洗涤液PH至中性，在抽干成湿饼状。SKWkpharose CL 4B介质悬浮于500ml0. IM NaOH 溶液，加入20ml乙二胺(或1，3_丙二胺、2-羟基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺等溶液)，凝胶在搅拌OOOrpm)下30°C恒温12h，用去离子水清洗。8 氯异咯嗪(8-chloroalloxazine)与 50ml 活化缓冲液(0. 8M Na0H，20%二甲亚砜，10%环氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氢化钠)40°C摇床震荡2. 5h后与介质在0. IM NaOH溶液中30°C恒温12h。反应完毕，用500ml去离子水充分洗涤，抽干。依据乙二胺、1，3_丙二胺、2-羟基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺溶液的不同，可以得到四种不同的黄素酶亲和介质，分别命名为L-D-l，L-D-2，L-D-3，L-D-4。(1)介质最大吸附量的确定确定介质的最大吸附量。取胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶标准品，用去离子水稀释至浓度为 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，调节 pH 值为 7. 0，分别加入 o.oig湿介质，4°C充分振荡ai后，测定上清胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶浓度，计算介质的最大吸附量。吸附量与上清蛋白浓度关系见表2。(2)特异性吸附的验证考察该组介质对胆固醇氧化酶及黄嘌呤氧化酶的特异性识别，分别取Img胆固醇氧化酶及2mg黄嘌呤氧化酶与20mg大肠杆菌破碎后提取蛋白(提取液采用20mM PBs, pH 7. 0)混合，与该组介质进行吸附用pH 7. 0的20mM PBs清洗，最后用0. IM HAc洗脱，采用与实施例1相同的方法测定酶活、含量并进行电泳分析，见表3，图2。


本发明涉及一种黄素酶亲和介质，由黄素酶亲和配体和层析介质连接而成。较佳地，黄素酶亲和配体是黄素辅酶核心构件异咯嗪环的结构类似物，层析介质是Sepharose、壳聚糖、硅胶或陶瓷颗粒；黄素酶亲和配体和层析介质通过环氧氯丙烷和乙二胺、1，3-丙二胺、2-羟基-1，3丙二胺或1，4-丁二胺作为间隔臂进行连接。还提供了一种上述的黄素酶亲和介质的合成方法及使用方法，利用该黄素酶亲和介质可以大规模快速分离纯化黄素酶，可在仅用一步亲和层析的情况下，得到黄素酶纯品，蛋白和活性回收率较高，适于大规模推广应用。