一种用于预防和治疗老年性痴呆的药物及制剂的制作方法[0002]老年性痴呆(Alzheimer Disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要症状表现为记忆力减退，认知能力低下和思维迟钝，且进行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般8~10年。随着社会老龄化进程的加快，AD的患病人数急剧上升，已成为威胁老龄特别是高龄人口身心健康的严重疾病，并带来了严重的社会、经济和家庭问题。[0003]AD病人主要脑病理改变是形成大量神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)和大量老年斑、其分子标志物分别是异常磷酸化的tau蛋白和β_淀粉样蛋白(Αβ)。国外学者已采用转基因技术，在小鼠成功地复制出β_淀粉样蛋白沉积形成的老年斑样病变，从而使得未来AD治疗将减少A β沉积作为药物干预的靶标成为可能。NFTs的数量与AD临床痴呆程度正相关。因此，干预NFTs对AD的防治尤为重要。自从发现NFTs的主要成分是异常、过度磷酸化的Tau蛋白聚集形成的双螺旋丝以来，国内外学者普遍公认，骨架蛋白tau的异常、过度磷酸化是NFTs形成的关键步骤。过度磷酸化tau蛋白的聚集不仅以缠结的形式存在， 它也是神经毡纤丝和老年斑中的营养不良突起的主要成分。[0004]目前尚没有针对老年性痴呆病理特征的特效治疗药物和方法，常用的减缓老年痴呆发作药物有:(I)改善胆碱神经传递药物:老年痴呆的一个主要原因是胆碱不足导致记忆衰退。因此乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂通过增强胆碱能作用在老年痴呆治疗方面发挥了重要作用；(2)改善脑血液循环和脑细胞代谢的药物:此类药物可以扩张脑血管以改善老年痴呆患者的糖、蛋白、核酸、脂质等代谢障碍；(3)钙拮抗剂:此类药物易于通过血脑屏障，选择性扩张脑血管，从而改善记忆和认知功能；(4)激素类药物:主要缓解女性患者的症状。然而，这些药物仅对中晚期老年性痴呆患者的痴呆症状有所轻度改善或延缓痴呆进展。因此研发新的针对老年性痴呆病理学特征的药物，成为全球的期待。[0005]米诺环素(Min)是第二代半合成的四环素类抗生素，临床上主要用来治疗感染性疾病，近年来研究表明，它不仅有抗微生物作用，还有显著的抗炎抗凋亡和抗氧化等作用，具有较强的抗炎作用高亲脂性长期用药安全性较好等特点。基础研究显示四环素类药物可通过多重机制发挥其脑保护作用，包括通过抗炎机制抑制基质金属蛋白激酶的活性保护血脑屏障保护神经元清除氧自由基及抗细胞凋亡途径等。
[0006]本发明的任务是提供一种用于预防和/或治疗老年性痴呆药物。[0007]实现本发的具体方案是:
[0008]本发明提供的用于预防和/或治疗老年性痴呆药物的药物是米诺环素，米诺环素能用于制备预防和/或治疗老年性痴呆的药物。[0009]本发明揭示了米诺环素(Min)能缓减老年性痴呆大鼠大脑海马区微管相关蛋白tau的异常过度磷酸化、能减少淀粉样蛋白沉积并改善动物学习、记忆障碍。米诺环素(Min)能用于老年性痴呆的预防和治疗。
[0010]实验材料:
[0011]本发明通过给大鼠注射米诺环素(Min)，发现其可以改善AD样动物模型的老年斑、tau蛋白过度磷酸化与学习、记忆障碍。
[0012]具体操作步骤如下:
[0013]1.实验对象
[0014]雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提供)，SPF级，体重250~320克，45只， 常规环境饲养。随机分为三组:①对照组(nor) 造模组(con)；③治疗组(Min);每组15只。
[0015]2.实验模型制备
[0016]①正常组:不处理
[0017]②造模组:通过尾静脉注射给予同型半胱氨酸(homocystin, Hcy),每天一次,持续14天，剂量为400 μ g / kg,构建早老性痴呆动物模型。
[0018]③治疗组:尾静脉注射Hcy (400 μ g / kg)，每天一次，持续14天；然后腹腔注射Min(50mg / kg),每天一次,持续14天。
[0019]3.研究方法
[0020]大鼠学习记忆的能力:Morris水迷宫训练及测试；
[0021]海马tau蛋白磷酸化:免疫印迹；
[0022]海马A β含量:酶联免疫吸附法
[0023]海马突触形态:高尔基染色
[0024]大鼠电生理:长时程增强电生理记录
[0025]4.实验结果
[0026]* Ρ〈0.05，与正常组比较
[0027]** Ρ〈0.01，与正常组比较
[0028]# Ρ〈0.05，与造模组比较
[0029]## Ρ〈0.01，与造模组比较
[0030](I)Morris水迷宫训练及测试结果:见图1。造模组(con)与正常组(nor)相比出现明显学习记忆障碍，统计结果表明水迷宫测试的潜伏期明显延长，学习的时间延长。造模组在目标象限停留时间和距离以及穿越平台的次数明显减少，说明记忆能力的减退，造模成功。治疗组(Min)与造模组(con)相比潜伏期时间变短，目标象限停留次数和穿越平台次数增加，其学习和记忆能力都得到了良好的改善。
[0031](2) Tau磷酸化免疫印迹结果:见图2。与正常组(nor)相比较，造模组(con)大鼠的大脑海马内tau蛋白在苏氨酸205，丝氨酸214，丝氨酸396，丝氨酸404位点，磷酸化水平明显增高，米诺环素(Min)处理后，tau磷酸化水平明显下降。
[0032](3)酶联免疫法检测大鼠皮层Αβ含量:见图3。酶联免疫吸附法(ELISA)检测发现，与正常组(nor)相比较，造模组(con)组大鼠的大脑海马内Αβ含量升高，米诺环素(Min)处理后，Aβ含量明显下降。[0033](4)高尔基染色结果:见图4。与正常组(nor)相比较，造模组(con)大鼠的大脑海马内树突棘密度明显减少，代表具有功能性的蘑菇状树突棘含量降低，说明造模组(con)出现突触形态异常变化，造模成功。治疗组(Min)与造模组(con)相比树突棘密度增加，蘑菇状树突棘含量增加。
[0034](5)电生理记录结果:见图5。与正常组(nor)相比较，造模组(con)大鼠的兴奋性突触后电位(EPSP)的幅度和频率都下降，说明造模组(con)出现突触功能障碍。治疗组(Min)与造模组(con)相比树突棘密度增加兴奋性突触后电位(EPSP)的幅度和频率都明显升高。
[0035]5.结论及用法建议:
[0036]以上结果显示腹腔注射米诺环素(Min)的老鼠水迷宫训练及检测过程中平台的潜伏期增加，穿越平台次数明显减少，说明大鼠的学习和记忆能力损伤，检测早老性痴呆相关指标tau蛋白磷酸化以及Αβ含量后发现，tau蛋白的磷酸化水平显著上升，Αβ含量也有明显升高，这些早老性痴呆的相关特征的改变，说明大鼠早老性痴呆造模成功。[0037]跟造模组相比较，在给与了米诺环素(Min)处理后，检测老鼠水迷宫行为学，其学习和记忆能力得到了有效的改善；同时，早老性痴呆相关指标tau蛋白磷酸化以及Αβ含量和造模组比较也有明显降低，说明米诺环素(Min)能缓减老年性痴呆大鼠大脑皮质和海马区骨架蛋白tau的异常过度磷酸化、能减少淀粉样蛋白沉积并改善动物学习、记忆障碍。米诺环素(Min)能用于老年性痴呆的预防和治疗。
[0038]参考徐舒云教授主编的《药理实验方法学，》在其附录中有一个表，列出了人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值。我们可以算出大鼠剂量与人的比值:
[0039]大鼠体型系数:0.09标准体重:200g=0.2kg
[0040]大鼠的折算系数=(体型系数大鼠*W大鼠2 / 3) / (体型系数人*W人2 / 3)
[0041]=(0.09*0.22 / 3) / (0.1*702 / 3)*70X / 0.4
[0042]=0018
[0043]经理论换算后，我们推荐临床上人的使用剂量为lmg/d，治疗阶段推荐采用周期疗法，连续服用21天，停用7天为一疗程；以预防保健为主，可减半剂量至0.5mg / d，长期服用。



[0044]所有图中，*P〈0.05，#P〈0.01与正常组比较；#P〈0.05，##P<0.01与造模组比较。正常组，不做任何处理；造模组，同型半胱氨酸(Hcy)尾静脉注射构建阿尔茨海默病变老鼠模型；治疗组:阿尔茨海默病变模型老鼠腹腔注射给予米诺环素(Min)，每天一次，持续14天，剂量为50mg / kg ο
[0045]图1大鼠水迷宫实验结果。
[0046]雄性Wistar大鼠随机分为三组:正常组、造模组、治疗组；分别进行Morris水迷宫实验。实验所采用Morris水迷宫测试系统包括圆形水池直径120cm，高60cm ;圆柱形有机玻璃平台直径10cm，高40cm。水池中水面高约45cm，室温及水温均保持在26±2°C，平台放置于某一象限的中心位置，并没于水面下约2cm。训练时将大鼠从任一象限I / 2弧度处头面向池壁轻放于水中，检测其潜伏期(即大鼠从入水点起到找到平台所用的时间)、路径作为衡量大鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只大鼠每天在4个象限共训练4次，每次游泳时限为60s，即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，休息30s后进行下一次训练。首先训练时间为6天，在第7天的时候，记录大鼠找到平台期所需时间，记录大鼠找到平台所需潜伏期。休息一天，去平台，计算I分钟内大鼠在目标象限的停留时间并分析其在平台所在位置的穿越次数，以评价其记忆能力。
[0047]结果显示跟正常组相比造模组大鼠游泳轨迹混乱，找到平台所需潜伏期时间最长，说明大鼠学习能力受到损伤，在给予米诺环素(Min)后，治疗组大鼠跟造模组相比轨迹重新恢复简单，潜伏期变短；造模组大鼠穿越平台的时间和距离最短，次数最少，说明造模组老鼠的记忆能力受到损害，不记得平台的位置；治疗组大鼠跟造模组相比穿越平台的时间和距离恢复到正常一致，穿越平台次数也相应增加，其记忆能力在给予米诺环素(Min)后得到明显恢复。
[0048]图2大鼠海马tau蛋白磷酸化结果。
[0049]水迷宫训练完成后，颈椎脱臼断头处死大鼠，迅速取出大脑脑组织置于0-40C 0.05M Tris缓冲盐溶液(TB, ρΗ7.0)内，快速分离双侧海马，制成10%的蛋白匀浆，在1000rmp离心5分钟，取上清，测定蛋白含量后备用。
[0050]分别检测tau蛋白不同位点的磷酸化水平，包括pS396，pS404, pS214，pT205。GAPDH为内参条带，证明蛋白上样量的一致性。通过与总tau R134d比较，造模组磷酸化位点磷酸化水平明显增加，tau发生过度磷酸化；治疗组给药米诺环素(Min)后，tau的过度磷酸化得到改善。
[0051 ] 图3酶联免疫法测定大鼠皮层A β水平结果
[0052]样品制备同免疫印迹，用Αβ 40或Αβ 42的抗体进行包被后漂洗，加入样品，用四甲基联苯胺(3,3，，5, 5’ -tetramethylbenzidine, TMB)显色,并在分光光度计上波长450nm读数。
[0053]阿尔茨海默病病人的另一病理学特征是脑内Αβ聚集，Αβ的产生是由于淡粉样蛋白前体蛋白(APP)的剪切错误导致的，可以产生两种剪切片段Αβ 40和Αβ 42。其中，Aβ 42具有较高的毒性作用。实验结果显示，造模组老鼠中Αβ 42片段的释放明显增多，米诺环素(Min)治疗后，治疗组Αβ 42回到正常组水平，进一步证明米诺环素(Min)能够改善阿尔茨海默病模型老鼠出现的病理特征。
[0054]图4大鼠海马神经元树突棘形态结果
[0055]水迷宫训练完成后，进行麻醉处理，并依次采用4%甲醛生理盐水、含重铬酸钾媒染液、I %硝酸银溶液灌流，经震荡切片机进行切片，采用梯度酒精脱水，二甲苯透明处理后，中性树胶封片，显微镜下观察树突棘形态。造模组大鼠的大脑海马内树突棘数量减少，蘑菇状树突棘比例下降，治疗组增加了树突棘密度和蘑菇状树突棘含量。
[0056] 图5大鼠电生理记录结果
[0057]大鼠麻醉后固定于立体定位仪上，施行局部开颅术，将刺激电极和记录电极分别放在海马CA3和CAl区域。刺激CA3区诱发场电位。选择合适的刺激和记录电极位置。绘制I / O曲线，选择诱发fEPSP幅度最大值的40%当作刺激强度，使用一串高频刺激(100Hz, Is)刺激 CA3 区 Schaeffer collateral-commissural fibers 诱导 CAl 区长时程增强(LTP)，记录120分钟。[0058]与正常组(nor)相比较，造模组(con)大鼠的兴奋性突触后电位(EPSP)的幅度和频率都下降，说明造模组(con)出现突触功能障碍。治疗组(Min)与造模组(con)相比树突棘密度增加兴奋性突触后电位(EPSP)的幅度和频率都明显升高。

[0059]实施例1
[0060]给大鼠注射米诺环素(Min),以改善AD样动物模型的老年斑、tau蛋白过度磷酸化与学习、记忆障碍。具体操作如下:
[0061]实验对象:雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提供)，SPF级，体重250~320克，45只，常规环境饲养。随机分为三组:①对照组(nor) ?’②造模组(con) !③治疗组(Min);每组15只。
[0062]实验模型制备:①正常组:不处理造模组:通过尾静脉注射给予同型半胱氨酸(homocystin, Hcy),每天一次,持 续14天,剂量为400 μ g / kg,构建早老性痴呆动物模型。③治疗组:尾静脉注射Hcy (400 μ g / kg),每天一次,持续14天；然后腹腔注射Min (50mg /kg),每天一次,持续14天。
[0063]研究方法:
[0064]大鼠学习记忆的能力:Morris水迷宫训练及测试；
[0065]海马tau蛋白磷酸化:免疫印迹；
[0066]海马A β含量:酶联免疫吸附法
[0067]海马突触形态:高尔基染色
[0068]大鼠电生理:长时程增强电生理记录
[0069]实验结果:
[0070]* Ρ〈0.05，与正常组比较
[0071]林Ρ〈0.01，与正常组比较
[0072]# Ρ〈0.05，与造模组比较
[0073]## Ρ〈0.01，与造模组比较
[0074](I)Morris水迷宫训练及测试结果:见图1。造模组(con)与正常组(nor)相比出现明显学习记忆障碍，统计结果表明水迷宫测试的潜伏期明显延长，学习的时间延长。造模组在目标象限停留时间和距离以及穿越平台的次数明显减少，说明记忆能力的减退，造模成功。治疗组(Min)与造模组(con)相比潜伏期时间变短，目标象限停留次数和穿越平台次数增加，其学习和记忆能力都得到了良好的改善。
[0075](2) Tau磷酸化免疫印迹结果:见图2。与正常组(nor)相比较，造模组(con)大鼠的大脑海马内tau蛋白在苏氨酸205，丝氨酸214，丝氨酸396，丝氨酸404位点，磷酸化水平明显增高，米诺环素(Min)处理后，tau磷酸化水平明显下降。
[0076](3)酶联免疫法检测大鼠皮层Αβ含量:见图3。酶联免疫吸附法(ELISA)检测发现，与正常组(nor)相比较，造模组(con)组大鼠的大脑海马内Αβ含量升高，米诺环素(Min)处理后，Aβ含量明显下降。
[0077](4)高尔基染色结果:见图4。与正常组(nor)相比较，造模组(con)大鼠的大脑海马内树突棘密度明显减少，代表具有功能性的蘑菇状树突棘含量降低，说明造模组(con)出现突触形态异常变化，造模成功。治疗组(Min)与造模组(con)相比树突棘密度增加，蘑菇状树突棘含量增加。
[0078](5)电生理记录结果:见图5。与正常组(nor)相比较，造模组(con)大鼠的兴奋性突触后电位(EPSP)的幅度和频率都下降，说明造模组(con)出现突触功能障碍。治疗组(Min)与造模组(con)相比树突棘密度增加兴奋性突触后电位(EPSP)的幅度和频率都明显升高。
[0079]结论:以上结果显示腹腔注射米诺环素(Min)的老鼠水迷宫训练及检测过程中平台的潜伏期增加，穿越平台次数明显减少，说明大鼠的学习和记忆能力损伤，检测早老性痴呆相关指标tau蛋白磷酸化以及Αβ含量后发现，tau蛋白的磷酸化水平显著上升，Αβ含量也有明显升高，这些早老性痴呆的相关特征的改变，说明大鼠早老性痴呆造模成功。跟造模组相比较，在给与了米诺环素(Min)处理后，检测老鼠水迷宫行为学，其学习和记忆能力得到了有效的改善；同时，早老性痴呆相关指标tau蛋白磷酸化以及Αβ含量和造模组比较也有明显降低，说明米诺环素(Min)能缓减老年性痴呆大鼠大脑皮质和海马区骨架蛋白tau的异常过度磷酸化、能减少淀粉样蛋白沉积并改善动物学习、记忆障碍。米诺环素(Min)能用于老年性痴呆的预防和治疗。