专利名称：：Ryr1基因snp检测特异性引物、液相芯片和检测方法：理阿诺碱受体1(Ryanodinereceptors1，RYR1)作为一种钙离子通道蛋白，在肌细胞终未池钙离子释放和促发肌细胞收缩中起着关键性的作用。RYRl突变已被确认为是中2SIil^I(centralcoredisease,CCD)(multiminicoredisease,MmD)>i^fli(malignanthyperthermia,MH)&车由2S/(Core/roddisease,CRD)白勺主要原因。自从1993年zhang报道RYRl为CCD的致病基因后，到目前为止，已有44种RYRl突变报道与CCD相关，包括39个错义突变和5个缺失突变。研究表明，大部分的CCD均由RYRl基因突变所致。RYRl同样也是MmD的致病基因，但至今仅有数例报道，极为少见。CRD指的是在轴空病的肌肉病理中，10%以上的肌纤维中同时出现杆状体，近来不同的RYRl基因突变已在轴空/杆状体病的家系中被确定，这表明杆状体可能是某些CXD的继发性病理改变。而MH是由挥发性吸入麻醉药和琥珀胆碱所触发的骨骼肌异常高代谢状态，是一种具有家族遗传性的亚临床肌肉病。RYRl基因多态性是大部分MH发生的分子生物学基础，所以RYRl基因致病突变型的检测成为必要。RYRl渗漏通道的突变多位于N端和中央区域(如Tyr523Ser，Arg2163His，Arg2435Leu)，而兴奋收缩失藕联的突变多位于C端(如Gly4890Arg，Arg4892Trp,Ile4897The，Gly4898Glu，Gly4898Arg，Ala4905Val，Arg4913Gly)。然而C端的Ile4795Cys，产生的却是渗漏通道。目前，RYRl最常见的突变点为R614C、G2434R和G341R，它们约占恶性高热病例的10%。其中，R614C和G341R常见于欧洲大陆，G2434R常见于北美洲。日本报道的大多突变为R1667C、P1773S、Q3756E和P1763S。中国大陆仅有1例恶性高热基因突变报道其突变点为T2206M。目前国内外几乎没有检测RYRl基因多态性的产品上市，大部分仍处于实验研究阶段，尚未商品化，已有的检测技术主要建立在PCR的基础上，如直接测序法，荧光定量PCR,PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时，由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应一限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术一次只能进行一种突变的检测，耗时费力。
本发明的目的之一是提供RYRl基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测RYRl基因的正常基因型以及四种常见等位基因型G341R、R614C、T2206M和G2434R的变异。实现上述目的的技术方案如下一种RYRl基因SNP检测液相芯片，主要包括有(A).针对RYRl基因的SNP位点分别设计的ASPE弓丨物对每种ASPE引物由5，端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别为针对G341R位点的SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、针对R614C位点的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12、针对T2206M位点的SEQIDNO.13及SEQIDN0.14；和/或针对G2434R位点的SEQIDN0.15及SEQIDN0.16；所述tag序列选自SEQIDN0.1-8中的序列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag序列选自SEQIDN0.17SEQIDN0.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于分别扩增具有G341R、R614C、T2206M、和/或G2434RSNP位点的RYRl基因目标序列的扩增引物。优选地，所述扩增引物为针对G341R位点的SEQIDN0.25及SEQIDN0.26、针对R614C位点的SEQIDN0.27及SEQIDN0.28、针对T2206M位点的SEQIDN0.29及SEQIDN0.30、和/或针对G2434R位点的SEQIDN0.31及SEQIDN0.32。优选地，所述ASPE引物对为针对G341R位点的由SEQIDNO.1和SEQIDN0.9组成的序列及由SEQIDN0.2和SEQIDNO.10组成的序列、针对R614C位点的由SEQIDN0.3禾口SEQIDNO.11组成的序列及由SEQIDN0.4和SEQIDN0.12组成的序列、针对T2206M位点的由SEQIDN0.5和SEQIDN0.13组成的序列及由SEQIDN0.6和SEQIDN0.14组成的序列、和/或针对G2434R位点的由SEQIDN0.7和SEQIDN0.15组成的序列及由SEQIDN0.8和SEQIDN0.16组成的序列。优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对RYRl基因SNP进行检测的方法。具体技术方案如下一种使用上述液相芯片对RYRl基因SNP检测的方法，主要包括以下步骤(一)PCR扩增待测样品DNA；(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素_藻红蛋白进行反应；(六)通过荧光检测仪检测。本发明的另一目的是提供用于RYRl基因SNP检测的特异性引物。具体技术方案如下用于RYRl基因SNP检测的特异性引物，包括有针对G341R位点的SEQIDN0.9及SEQIDN0.10、针对R614C位点的SEQIDNO.11及SEQIDN0.12、针对T2206M位点的SEQIDN0.13及SEQIDN0.14、和/或针对G2434R位点的SEQIDN0.15及SEQIDN0.16。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的RYRl基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号_噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。2.本发明设计的ASPE特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型，并能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种引物、探针之间基本不存在非特异性结合。3.本发明的检测方法步骤简单，一步多重PCR即可完成四个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征，特别符合检测应用需要。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。同时，多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。具体实施例方式实施例IRYRl基因SNP检测液相芯片，主要包括有一、ASPE引物针对RYRl的四种常见SNP位点G341R、R614C、T2206M、G2434R分别设计特异性的引物序列。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE引物序列(Tag+特异性引物序列)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异性引物序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用lOmmol/LTrisBufferm制成lOOpmol/mL的贮存液。二、anti-tag序列包被的微球根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的八种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>选择的8种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH20配成lOOnmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(η彡3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用Poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T。微球包被的过程如下分别取5XIO6个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入IOul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配M10ng/ml白勺EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(_自PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02%的Tween-20洗涤一次，再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于IOOul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，lmmol/LEDTA中，2_8°C避光保存。三、扩增出具有SNP位点的目标序列的引物目标检测RYRl的4种常见SNP位点G341R、R614C、T2206M、G2434R。利用Primer5.0设计四对引物(见表3)，分别扩增出四条具有SNP位点的目标序列。表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用IOmmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。实施例2运用实施例1所述RYRl基因SNP检测液相芯片对样本的检测所述各种溶液的配方如下50mM的MES缓冲液(ρΗ5·0)配方(250ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2XTm杂交缓冲液<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>过滤后贮存于4°C。ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。一、样本的DNA提取参照AxyPr印全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA。二、待测样品的PCR扩增利用Primer5.0设计四对引物，多重PCR—步扩增出RYRl具有SNP位点的目标序列，产物大小分别为260bp、374bp、268bp、400bp。引物序列(SEQNO.25-32)见上述表3所不。首先配制多重PCR引物工作液分别各取SEQNO.2532的引物贮存液IOOul于1.5ml微量离心管中，混合均勻即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>PCR扩增程序为95°C3min；94°C20s，56°C30s,72°C30s，30个循环；72°CIOmin；4°C保存备用。三、PCR产物的酶切处理参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下1.取7.5ulPCR反应后的产物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37°C孵育15min。80°C孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。首先配制混合的ASPE引物工作液分别各取G341R-W与G341R_m、R614C-W与R614C-m、T2206M-w与T2206M_m、G2434R-w与G2434R_m相应的ASPE引物贮存液IOul于1.5ml微量离心管中，加入IOmmol/LTrisBuffer补至200ul，混合均勻即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下10X缓冲液2ulMgCl2(50mmol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各lOOumol/L)IulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)Iul酶切处理的PCR扩增产物5ulddH2010.ul_共20ulPCR程序为96°C2min；94°C30s，58°Clmin，72°C2min，30个循环；4°C保存备用。五、杂交反应1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的八种微球(微球浓度均为2.5XIO5个/ml)；2.分别取Iul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；3.微球于≥1000g离心l_2min；4.弃去上清，微球重悬于IOOul的2XTm杂交缓冲液中，涡旋混勻；5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH20；6.取5_25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH20补足至50ul；7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95°C60s,37°C15min孵育杂交；8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；9.去上清，将微球重悬于75ul的IXTm杂交缓冲液中；10.微球于≥3000g离心2_5min；11将微球重悬于75ul的IXTm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；12.37°C孵育15min，于Luminex仪器上检测。六、结果检测与数据分析反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10XPCR阴性对照MFI；2.NETMFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值突变比值=突变型NETMFI+(突变型NETMFI+野生型NETMFI)4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。使用本方法检测大量样本的RYRl基因多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子；30%-70%视为杂合子；80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的RYRl基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的RYRl基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出RYRl基因的SNP类型，且结果稳定可靠。表4样本检测结果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对RYRl基因SNP检测基因突变的检测一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)以RYRl基因G341R位点突变的检测液相芯片为例，针对G341R的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQIDNO.I-SEQIDNO.8中的6条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQIDNO.17-SEQIDNO.24。具体设计如下表(表6)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。表6液相芯片制备的设计<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>SEQIDNO.6SEQIDNO.22Group3二、样品检测采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下表7样本检测结果(MFI)与基因多态性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。权利要求一种RYR1基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A).针对RYR1基因的SNP位点分别设计的ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别为针对G341R位点的SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、针对R614C位点的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12、针对T2206M位点的SEQIDNO.13及SEQIDNO.14；和/或针对G2434R位点的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16；所述tag序列选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.8中的序列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag序列选自SEQIDNO.17～SEQIDNO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于分别扩增具有G341R、R614C、T2206M和/或G2434RSNP位点的RYR1基因目标序列的扩增引物。2.根据权利要求1所述的RYRl基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对G341R位点的SEQIDNO.25及SEQIDNO.26、针对R614C位点的SEQIDNO.27及SEQIDNO.28、针对T2206M位点的SEQIDNO.29及SEQIDNO.30、和/或针对G2434R位点的SEQIDNO.31及SEQIDNO.32。3.根据权利要求1或2所述的RYRl基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为针对G341R位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.9组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDN0.10组成的序列、针对R614C位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.11组成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.12组成的序列、针对T2206M位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.13组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.14组成的序列、和/或针对G2434R位点的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.15组成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.16组成的序列。4.根据权利要求1所述的RYRl基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。5.根据权利要求4所述的RYRl基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T06.一种使用权利要求1-5任一项所述的液相芯片对RYRl基因SNP检测的方法，其特征在于主要包括以下步骤(一)PCR扩增待测样品DNA;(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素_藻红蛋白进行反应；(六)通过荧光检测仪检测。7.用于RYRl基因SNP检测的特异性引物，其特征在于包括有针对G341R位点的SEQIDN0.9及SEQIDN0.10、针对R614C位点的SEQIDNO.11及SEQIDN0.12、针对T2206M位点的SEQIDNO.13及SEQIDNO.14、和/或针对G2434R位点的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16。全文摘要本发明公开了RYR1基因SNP检测特异性引物、液相芯片和方法，所述液相芯片包括针对每种型别的突变位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对、分别包被有特异的anti-tag序列的微球，和用于分别扩增具有G341R、R614C、T2206M和/或G2434R位点的RYR1基因目标序列的引物。所制备的RYR1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。所述检测方法步骤简单，4种SNP位点可以一步检测完成，操作方便，并且避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。文档编号C12Q1/68GK101812523SQ201010148409公开日2010年8月25日申请日期2010年4月9日优先权日2010年4月9日发明者朱泽尧,许嘉森申请人:广州益善生物技术有限公司