专利名称:一种肿瘤用药个体化指导的检测方法目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等,都是针对特异性靶基因进行检测。其中,荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点是灵敏性高,并可精确定量,在对EGFR,BRAF, KRAS等的检测中都取得了良好效果。利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大,并利用一 种新型探针在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测,具有很高的特异性和敏感度。其中目前在肿瘤个体化分子诊断领域最重要的EGFR、KRAS、BRAF三种基因突变检测试剂产品已获得SFDA《医疗器械注册证》和欧盟CE认证。荧光定量PCR的缺点通量低,一次只能检测一个基因,如需要检测多种相关基因突变,SNP,表达情况,就需要多台PCR仪同时工作,效率低,周期长;成本相对较高因一次只能检测一个基因位点,当一个样品同时需要检测多种肿瘤相关基因时,必须一个一个检测,成本相对增高;不适用于检测固定包埋后的病理组织,但患者可供的多数是固定后的组织;只能设定一个内参基因(管家基因),但肿瘤组织的管家基因有别于正常组织,需要一组管家基因作内参;只能同步检测最多三种基因,但个体化治疗需要同步检测十几种甚至更多的基因。
本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的肿瘤用药个体化指导的检测方法。本发明采用如下技术方案一种肿瘤用药个体化指导的检测方法,包括如下步骤(I)采集患者样品,并提取核酸;(2)以患者核酸为模板进行反转录;(3)以反转录产物为模板进行PCR反应;(4)以毛细电泳的方法分离样品。优选地,所述步骤(I)中的患者样品包括新鲜、冰冻肿瘤组织等等。优选地,所述步骤(2)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。优选地,所述步骤(2)中的孵育温度分别为48°C、42°C、95°C、4°C。优选地,所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。优选地,所述步骤(3)的子步骤中的热循环温度分别为95°C、94°C、55°C、70°C、4。。。本发明的有益效果为1.灵敏度高、重复性好采用激光诱导荧光-PMT,具有超高灵敏度。2.准确性强采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测,可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离,最大程度降低假阳性。3.高通量本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术,实现单个反应检测30-40个位点,可同时做192个反应(如192个患者样品,每个样品检测11个相关基因),本方法可一次性给出准确报告,避免漏检。4.精确定量可精确定量基因突变,SNP,表达拷贝数。5.灵活性强可随时根据需求调整检测的靶基因,例如新发现的靶向位点,可立即设计特异性引物,将其放入“肿瘤个体化治疗用药指导多重基因检测方案”中去。 6.成本低每个样品的检测成本少于Y50,利于大规模推广。
本发明公开了一种肿瘤用药个体化指导的检测方法,包括如下步骤(1)采集患者样品,并提取核酸;(2)以患者核酸为模板进行反转录;(3)以反转录产物为模板进行PCR反应;(4)以毛细电泳的方法分离样品。本发明一种肿瘤用药个体化指导的检测方法具有灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的优点。
一种肿瘤用药个体化指导的检测方法
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