专利名称：适合于电场条件下的石油烃降解菌及其应用的制作方法随着人类对石油的需求增大，石油泄漏的途径与机会增多，石油已经成为土壤中的大宗污染物之一。石油成分复杂，含有饱和烃、芳香烃等有机物，这些物质进入土壤后，先吸附在土壤大孔隙以及各种有机颗粒和无机颗粒的表面，然后逐渐扩散进入土壤微孔中，或者分配进土壤有机质内，也有少部分以纯固体或非水相物质存在。当石油渗入量超过土壤的自净容量后，积累的油类物质将长期残留，破坏土壤结构，对土壤植物和土壤微生物生态系统甚至地下水都产生严重影响，对人类造成危害。石油污染土壤修复已经受到国内外学者的高度重视，目前生物修复方法因其治理成本低廉和环境影响小等优点被广泛应用。该技术是借助于大量微生物利用石油烃作为碳源和能源而生长，通过新陈代谢作用将石油污染物降解成二氧化碳和水等无害物质。自然界中广泛存在能降解石油烃的微生物，据报道有200多种，分别属于细菌、酵母菌和霉菌等不同类别。但是生物修复受污染物的组成、土壤性质和外界环境等一系列因素影响，在实际应用中常常导致生物降解效率降低，限制了生物降解的作用。因此，如何强化微生物的环境条件，加快微生物对石油污染物的降解效率成为当前研究的热点。电动-微生物修复技术是近几年来发展起来的一种环境友好的有机污染土壤修复方法，目前已经成功的应用于石油烃、PAHs等污染土壤的修复。电动-微生物修复技术主要是利用直流电场产生的各种电动力学效应增强微生物的降解性能，但在实际应用中微生物的运动、活性和多样性等受外界环境因素的影响很大，土著微生物或接种微生物的数量和活性迅速降低，无法达到预期效果。因此，为了建立高效的电动-微生物修复技术，就必须筛选适合于电场条件下 的高效石油降解菌。
本发明目的是针对石油污染土壤电动-微生物修复技术存在的问题，提供一种适合于电场条件下的石油烃降解菌及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种适合于电场条件下的石油烃降解菌，石油烃降解菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5，已于2011年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC No:M 2011261。适合于电场条件下的石油烃降解菌的应用，所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5用于污染土壤的修复。所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5用于石油烃污染土壤的修复。在污染土壤施加单向和切换电场，并将所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5施入污染土壤，在0.5-2.0V/cm的电场条件存在下进行污染土壤的修复。本发明地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 可在不同电场条件下生长。所述的电场条件具体可指0.5V/cm、lV/cm、2V/cm单向电场和切换电场中的至少一种。本发明地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 可用于降解石油烃化合物。所述的石油烃化合物可为石油组分烷烃、芳烃和胶质及混合石油烃中的至少一种。本发明地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 可用于环境污染修复。所述环境污染可为石油烃污染。所述的石油烃化合物具体可为烷烃、芳烃和胶质及混合石油烃的一种。所述环境为土壤。本发明所提供的适合于电场条件下的石油烃降解菌是从辽河油田石油污染土壤中筛选得到的。根据其形态特征、培养特征、生理生化特性和16SrRNA基因序列分析证实属于芽孢杆菌属，将其命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5已于2011年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌珞珈山，武汉大学)，保藏登记号为CCTCC No:M 2011261。本发明地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 为革兰氏染色阳性，细胞为直的杆状，大小为0.6-0.8X1.2-2.5 μ m,单个或短链排列，具圆端，以周生鞭毛运动；芽孢中生或端生、椭圆形；为好氧细菌，可生长PH范围为5.7-8.5，最适生长pH值为7.2 ;可生长温度范围为15-50°C，最适生长温度是30°C ;能利用葡萄糖，接触酶阳性。在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶。本发明所具有的优点:1.本发明地衣芽孢杆菌(B acillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 可在电场条件下以石油烃作为唯一碳源和能源生长繁殖，同时将其降解。本发明为电动-微生物修复石油污染土壤提供了新的微生物资源，对于石油污染的治理具有重大价值，具有客观的经济效益和良好的社会效益。2.本发明分离得到菌株在电场条件作用下具有较高的活性，能提高电场条件下烷烃、芳烃、胶质和混合石油烃的降解率。在施加0.5V/cm、l.0V/cm,2.0V/cm电场后，地衣芽孢杆菌的降解活性增强，28天后烷烃、芳烃和胶质及混合石油烃的去除率分别增加了4.19-21.91%和7.64-23.32%。本发明可用于石油污染土壤的原位修复，具有快速、方便、环保的优点。图1 是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 在显微镜下的形态照片(100X)。图 2 是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) PS5 CCTCC No:M2011261 在不同电场条件下的细菌数量随时间变化曲线。图 3 是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) PS5 CCTCC No:M2011261 在不同电场条件下对烷烃、芳烃和胶质的降解率。图 4 是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) PS5 CCTCC No:M2011261 在不同电场条件下对混合石油烃的降解率。
1.0V/cm、2.0V/cm,电极间距为24cm, 土壤湿度为25%,实验运行28天。以不施加电场单独添加微生物的反应系统作为对照。每7d采样I次，测定土壤中地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5活细菌数量，土壤中细菌数量采用平板计数法。从图2中可以看出，经过一段时间的处理，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5数量都有所增加，但施加电场处理中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5数量明显高于空白对照，说明外加电场有利于土壤中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) PS5的生长。比较7d、14d、21d和28d时各处理土壤中地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5数量,发现电场强度大小会对土壤中微生物的数量产生一定影响，2.0V/cm电场强度更利于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5的生长，数量大小顺序为:2.0V/cm > 1.0V/cm > 0.5V/cm ;同时，从图中也可以看出切换电场处理土壤中地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5数量高于未切换电场处理。从以上结果来看，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5能够在适宜的电场条件下生长，2.0V/cm的电场条件最适宜，切换电场处理的效果要高于不进行切换电场处理效
果O实施例3:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 在不同电场条件下对烷烃、芳烃和胶质的降解作用将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) PS5接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后在30°C、160r/min恒温摇床振荡培养3天；室温下8000r/min离心收集菌体，再用磷酸盐缓冲液将菌体制备成菌悬液。将制备好的菌悬液分别接种于含烷烃(550mg/kg)、芳烃(350mg/kg)、胶质(200mg/kg)的污染土壤中，土壤中地衣芽孢杆菌的浓度为6.8X107CFU/g干土。同时在供试土壤中施加单向和切换电场，电压分别为0.5V/cm、l.0V/cm、2.0V/cm,电极间距为24cm,土壤湿度为25%,实验运行28天。以不施加电场但添加微生物的反应系统作为对照。每7d采样I次，样品为中间、两端土壤的混合样，采用重量法测定土壤中各污染物的浓度，计算各污染物的去除率。从图3中可以看出，各处理烷烃、芳烃和胶质均有不同程度的去除，其中烷烃的去除率要高于芳烃和胶质 。比较外加电场处理和单独微生物处理，施加电场后烷烃、芳烃和胶质的去除率都有所增加，烷烃的去除率增加较明显，烷烃、芳烃和胶质的最大去除率分别增加了 21.91%，12.51%和4.19 %，说明在电场作用下地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5的生物活性增强，电场促进了其对污染物的降解。同时，从图中也可以看出电场强度和电场的作用方式影响地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5的活性，各处理去除率的大小顺序为:2.0V/cm > 1.0V/cm > 0.5V/cm,切换电场处理土壤中各污染物的去除率要高于未切换电场处理。实施例4:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 在不同电场条件下对混合石油烃的降解作用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5菌悬液的制备参照实施例3。将制备好的菌悬液接种于石油污染土壤中，土壤中混合石油烃的总浓度为1200.00mg/kg，土壤中地衣芽孢杆菌的浓度为6.8X107CFU/g干土。同时在供试土壤中施加单向和切换电场，电压分别为0.5V/cm、l.0V/cm、2.0V/cm,电极间距为24cm,土壤湿度为25%,实验运行28天。以不施加电场但添加微生物的反应系统作为对照。每7d采样I次，样品为中间、两端土壤的混合样，采用重量法测定土壤中石油烃的浓度，计算土壤中石油烃的去除率。从图4中可以看出，外加电场处理中混合石油烃的去除率明显高于单独的微生物处理，说明外加电场提高了地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5的生物活性，促进了其对石油烃的降解作用，其去除率分别提高了 7.64%、10.02%,9.20%, 13.73%、17.00%和23.32%。同时，从图中也可以看出电场强度和作用方式也影响了地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PS5的活性,各处理对石油烃去除率的大小顺序为:2.0V/cm >
1.0V/cm > 0.5V/cm，切换电场处理土壤中石油烃的去除率要高于未切换电场处理。


本发明公开了一株适合于电场条件下的石油烃降解菌及其应用。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PS5分离自石油污染土壤，能够降解石油烃，已于2011年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NoM 2011261。所述地衣芽孢杆菌PS5用于污染土壤的修复。本发明分离得到的菌株在0.5-2.0V/cm电场条件作用下具有较高的活性，能提高烷烃、芳烃和胶质及混合石油烃的去除率。在施加电场后，地衣芽孢杆菌PS5的降解活性增强，28天后对石油烃单一组分和混合石油烃的去除率分别增加了4.19-21.91％和7.64-23.32％。