专利名称：检测耐多药结核分枝杆菌的方法及其相关引物和液相芯片的制作方法耐多药结核病在全球发病率高、死亡率高，尤其发生在亚洲，特别是中国和印度。现在对结核病进行治疗一般选择药物利福平(RIF)和异烟肼(INH)，临床上只要同时对该两种药物产生耐药即被诊断为耐多药结核病(MDR, Multi-drug-resistanttuberculosis)。耐多药结核病治疗十分困难，几乎成为不治之症。所以，医学界把严重的耐多药结核病等同于癌症。导致耐多药结合病的结合分支杆菌称为耐多药结核分枝杆菌。在现阶段，广泛采 用传统的药物敏感性试验来检测耐多药结核分枝杆菌，该方法是基于表现型耐药，在含多种相关药物的固体培养基上接种对数生长期的结核杆菌，当结核菌能在抑制结核菌生长的最低药物浓度(MIC)下生长时被界定为耐多药结核分枝杆菌，该方法培养条件要求高、工作量大、检测周期长、检出率低，不能满足临床要求。近年来，若干基于PCR的分子诊断技术逐渐应用于耐多药结核分枝杆菌检测中，这类方法是通过检查的基因突变来确定耐多药结核分枝杆菌。大多数这类方法以尼龙膜为载体进行核酸杂交，该方法载体前处理复杂，时间较长，灵敏度不高，结果需人为判断，且不易储存。等位基因特异性PCR，根据Taq DNA聚合酶不能修复引物在3’末端的碱基错配这一原理，当引物的3’末端核苷酸与等位基因序列完全互补时，模板被扩增，该技术无法判断检测位点突变成何种碱基，且结果由核酸电泳判断，灵敏度低、容易产生假阳性。PCR-线性探针杂交技术(PCR-LiPA)，其原理是核酸的反向杂交法，根据杂交结果判定突变存在与否。基于这一原理，目前市场上已经有用于检测耐药基因突变的商业化诊断试剂盒，主要包括 Genotype MTBDR (Hain Lifescience, GmbH, Nehren, Germany)和INNO-LiPA Rif. TB (Innogenetics, Ghent, Belgium)两种。这类试剂盒基本能有效地检测出耐多药结核分枝杆菌，但是只能对rpoB基因进行粗筛，其数据不易储存，结果受主观因素影响较大，并且实验费用昂贵，需要精密的实验仪器，在低收入、高发病率国家难以推广。而且，由于对耐多药结核分枝杆菌突变位点选择的原因，这些方法检测结果中假阳性和/或假阴性较高。另外上市的还有一种Xpert MTB的检测方法采用半巢式实时定量PCR方法扩增rpoB基因一段特殊的MTB序列，该序列作为一个探针和利福平耐药基因决定区突变的分子信标结合从而得到检测结果。该方法只能检测rpoB基因的突变，且由于实验条件的变化包括实验仪器及处理条件如温度时间等有变化而使实验结果不稳定，同时该方法采用了很多先进的硬件设备，这无疑大大的增加了检测成本，资金的大量投入使得一些发展中国家难以承受，另外该仪器也不能用于其他方面检测。传统固相芯片，诊断结核杆菌耐药的DNA芯片是固定在玻片、硅片、膜、高分子材料载体上固定DNA探针。为使其固定在载体上，对探针和载体都需要活化。将样品进行PCR扩增，进行荧光标记，再与DNA芯片杂交。可以通过专用激光芯片扫描仪进行检测。扫描获得的图像，用芯片图像专用分析软件分析每个基因探针位点的杂交信号的强弱，从而确定结核分支杆菌目标DNA是否发生突变。由于该检测环境为固相，不利于PCR产物与探针的结合，且检测载体为玻片，体积远远大于微米级别，当样本数量多的时候，则不能有效进行高通量的检测。另外，虽然该方法检测时间短，但是对仪器及技术人员要求高，重复性差，不能有效进行高通量检测。因此，本领域中需要一种准确度高、敏感性高、特异性强、步骤简单、快速并且高通量的检测耐多药结核分枝杆菌的方法。
本发明人经过多次尝试发现，通过检测katG315突变型I和/或II、rpoB526突变型I和/或II、rpoB531突变型I和/或II、inhA-15突变位点可以有效检测耐多药结核分 枝杆菌。为了实现本发明的方法，本发明人经过多次实验，提供了用于检测katG315突变型I和/或II、rpoB526突变型I和/或II、rpoB531突变型I和/或II、inhA-15突变位点的特异性引物序列，包括针对katG315野生型位点的SEQ ID NO. 12，针对katG315突变型I位点的SEQ ID NO. 13，针对katG315突变型II位点的SEQ ID NO. 14 ;针对rpoB526野生型位点的SEQ ID NO. 15，针对rpoB526突变型I位点的SEQ ID NO. 16，针对rpoB526突变型II位点的SEQ ID NO. 17 ;针对rpoB531野生型位点的SEQ ID NO. 18，针对rpoB531突变型I位点的SEQ ID NO. 19，针对rpoB531突变型II位点的SEQ ID NO. 20 ;针对inhA-15野生型的SEQ ID NO. 21，针对inhA-15突变型的SEQ ID NO. 22。这些该引物序列特异性强，能够准确地区分出各种基因型，并且多位点同时检测不存在交叉干扰。另外，本发明人经过多次实验，还提供了扩增含有katG315、rpoB526、rpoB531、inhA-15位点的目标序列的扩增引物，所述扩增引物包括针对katG基因315密码子位点的SEQ ID NO. 34和SEQ ID NO. 35，针对rpoB基因526密码子、rpoB基因531密码子位点的 SEQ ID NO. 36 和 SEQ ID NO. 37，针对 inhA 基因启动子-15 位点的 SEQ ID NO. 38 和 SEQID NO. 39。因此，本发明的一个目的是提供一种使用上述特异性引物序列和扩增引物检测耐多药结核分枝杆菌的方法。在一个方面中，本发明提供了一种使用上述特异性引物序列和扩增引物检测耐多药结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤I)使用扩增引物扩增一个样品的DNA从而得到扩增产物，并纯化所述扩增产物，所述扩增引物的序列为SEQ ID NO. 34-SEQ ID NO. 39 ；2)用特异性引物对进行上述延伸反应产物进行延伸，所述特异性引物为SEQ IDNO. 12-SEQ ID NO. 22，如果SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 18 不延伸，而SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 22 中至少之一延伸并且 SEQ ID NO. 16,SEQ IDNO. 17、SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20中至少之一延伸，那么所述样品中存在耐多药结核分枝杆菌。本发明的另一个目的是提供一种检测耐多药结核分枝杆菌的液相芯片，该液相芯片可用于检测katG基因315密码子、rpoB基因526密码子、rpoB基因531密码子、inhA基因启动子-15位的野生基因型和已知7种常见的突变型。 在另一方面，本发明提供了一种检测耐多药结核分枝杆菌的液相芯片，包括I)带标签序列的特异性引物，每个带标签序列的特异性引物由5’端的标签序列和3’端的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 22 ；所述标签序列选自SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 11，不同引物序列连接不同标签序列； 2 )分别包被有标签互补序列的微球，所述标签互补序列是I)中的标签序列的互补序列，所述标签互补序列选自SEQ ID NO. 23-SEQ ID NO. 33。在一个具体实施方案中，本发明的液相芯片还包括3)用于扩增含有katG315、rpoB526、rpoB531、inhA-15位点的目标序列的扩增引物，所述扩增引物包括有针对katG基因315密码子位点的SEQ ID NO. 34和SEQ ID NO. 35，针对rpoB基因526密码子、rpoB基因531密码子位点的SEQ IDN0. 36和SEQ ID NO. 37，针对inhA基因启动子-15位点的SEQ ID NO. 38和SEQ ID NO. 39。本发明的另一目的是提供一种使用上述液相芯片检测耐多药结核分枝杆菌的方法。在一个方面，本发明提供了一种使用上述液相芯片检测耐多药结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤I)利于所述扩增引物序列扩增一个样品的DNA从而得到扩增产物；2)将所述扩增产物用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶(SAP)进行消化处理；3)用所述带标签序列的特异性引物进行延伸反应，在延伸反应过程进行标记；4)将所述包被有标签互补序列的微球与上述延伸反应产物进行杂交反应，不同标签互补序列包被在可相互区分的微球上；5)检测发生杂交反应的微球；6)通过区分微球得到通过标签序列和标签互补序列相互作用与微球相连的特异性引物的类型，从而确定步骤3)中发生延伸的特异性引物类型，如果SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 18 不延伸，而SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 22 中至少之一延伸并且 SEQ ID NO. 16,SEQ IDNO. 17、SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20中至少之一延伸，那么所述样品中存在耐多药结核分枝杆菌。例如，在一个实施方案中，在上述步骤3)中，掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个生物素标记；并且在步骤5)中，通过与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后通过荧光检测仪进行检测。本发明的结核分枝杆菌耐药性检测液相芯片和检测方法主要优点在于I.准确度高与测序法的吻合率高达100%;2.敏感性强检出限最低可能达到0. 01pg/ml，模板用量少，PCR产物只需2_4 y I即可完成后续检测；3.特异性强能够准确地区分出各位点的型别；4.步骤简单一步多重PCR反应即可完成4个具有SNP位点的目标序列的扩增；5.检测时间短检测过程操作时间为4. 5-5. 5小时，远远少于常规测序技术所需的检测时间；6.通量高一张检测板可同时进行96个临床样本，并且可以用多个检测板进行连续检测。本发明是分子生物学和新兴的液态芯片技术的结合，通过对几种基因PCR产物的等位基因特异引物延伸(ASPE)方法，结合不同标记的微球，可在一个反应体系中同时检测多种耐药基因型的检测。首次将Luminex液态芯片的方法用于对结核杆菌耐多药的检测。 在本发明中，耐多药结核分枝杆菌是指同时对利福平(RIF)和异烟肼(INH)产生 耐药的结核分枝杆菌。在本发明中，katG315是katG基因315密码子的缩写，rpoB526是rpoB基因526密码子的缩写，rpoB531是rpoB基因531密码子的缩写，inhA-15是inhA基因启动子-15位的缩写。在本发明中，结核分枝杆菌同时表现为katG315和inhA-15野生基因型,则为异烟肼敏感结核分枝杆菌，该两检测点之一或二者表现为突变型，则为异烟肼耐药结核分枝杆菌；结核分枝杆菌同时表现为rpoB526和rpoB531野生基因型，则为利福平敏感结核分枝杆菌，该两检测点之一或二者表现为突变型，则为利福平耐药结核分枝杆菌。结核分枝杆菌katG315和inhA-15之一或二者表现为突变型，并且rpoB526和rpoB531之一或二者表现为突变型，则为耐多药结核分枝杆菌。行病学调查结果显示目前耐多药结核分枝杆菌中90%是对利福平(RIF)和/或对异烟肼(INH)产生耐药的，而我们所选的4个检测位点几乎覆盖了所有耐药基因的突变。我们在实施例中证明同时检测4点与检测单点时数值差别无显著性差异；但在实施例中，通过实验验证了增加检测位点对检测结果有干扰。在本发明中使用的引物序列SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 22为针对katG315野生型位点的SEQ ID NO. 12，针对katG315突变型I位点的SEQ ID NO. 13，针对katG315突变型II位点的SEQ ID NO. 14 ;针对rpoB526野生型位点的SEQ ID NO. 15，针对rpoB526突变型I位点的SEQ ID NO. 16，针对rpoB526突变型II位点的SEQ ID NO. 17 ;针对rpoB531野生型位点的SEQID NO. 18，针对rpoB531突变型I位点的SEQ ID NO. 19，针对rpoB531突变型II位点SEQ ID NO. 20 ;针对inhA-15野生型的SEQ ID NO. 21，针对inhA-15突变型的SEQID NO. 22。在本发明中，扩增含有katG315、rpoB526、rpoB531、inhA-15位点的目标序列的扩增引物包括针对katG基因315密码子位点的SEQ ID NO. 34和SEQ ID NO. 35，针对rpoB基因526密码子、rpoB基因531密码子位点的SEQ ID NO. 36和SEQ ID NO. 37，针对inhA基因启动子-15位点的SEQ ID NO. 38和SEQ ID NO. 39。在一个具体实施方案中，本发明中所述的带标签序列的特异性引物分别选自针对katG基因315密码子的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 12组成的序列，由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 13组成的序列，由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 14组成的序列；针对rpoB基因526密码子的由序列SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 15组成的序列，由SEQ ID NO. 5和SEQ IDNO. 16组成的序列，和由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 17组成的序列；针对rpoB基因531密码子的由序列SEQ ID NO. 7和序列SEQ ID NO. 18组成的序列，由序列SEQ ID NO. 8和序列SEQ ID NO. 19组成的序列，和由序列SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 20组成的序列；针对inhA基因启动子-15位的由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 21组成的序列及由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 22组成的序列。本发明中涉及的DNA扩增方法、从样品提取DNA的方法可以是本领域中的任何可用方法。所述方法可以由本领域技术人员根据具体情况进行选择。在本发明中，使用的液态芯片(luminex xTAG)的检测原理如下待检测的目的片段，经PCR扩增，进行等位基因特异性延伸反应，与特异性荧光编码微球杂交，加入亲和素修饰的藻红蛋白(SAPE)为荧光报告分子，经双激光系统检测。该方法可同时检测多个位点、多基因型的突变。 在本发明的一个实施方案中，所述液相芯片技术可以是以微球为载体的悬浮液相芯片技术。例如，在一个具体的实施方案中，该技术的核心是把直径为5. 6iim的聚苯乙烯小球用荧光染色的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多可达100种具有不同特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合，在一个反应孔内可以同时完成最多达100种不同的检测反应。最后进行分析，仪器通过两束激光分别识别微球的编码和检测微球上报告分子的突光强度。在本发明中，标签序列和标签互补序列的选择原则就是尽量使微球之间、微球与带标签序列的特异性引物之间不发生非特异性交联；并且与物种基因组DNA之间无相似性。标签序列和标签互补序列的选择是本领域技术人员可以实现的。另外，还可以通过市购获得。例如，微球为市售的，序列是生产商设计的，微球表面已经包被有标签互补序列，每种微球上的标签互补序列是特异性核苷酸序列，最大程度保证微球之间互不交联。带标签序列的特异性引物上的标签序列与微球上的标签互补序列互补，过程中有一步杂交就是使特异的微球识别特异的带标签序列的特异性产物，达到微球与序列一一对应的目的。在本发中其中所述标签序列长度优选为10至50个核苷酸。在本发明中，所述标签互补序列与微球连接中间可以没有间隔序列，也可以设有间隔臂序列，间隔臂间隔在微球和标签互补序列之间。例如，所述间隔臂序列可以为5-10个T。或者，所述间隔臂序列可以来自提供微球的供应商，例如Luminex公司。本发明的检测耐多药结核分枝杆菌的液相芯片和方法可用于检测多种来源的样品中耐多药结核分枝杆菌基因组，所述样品可以来自人或动物体的体液，例如痰液、泪液，小便；来自实验样品，例如培养基中的耐多药结核分枝杆菌；来自医疗用品，例如医疗物品、血液制品；来自环境，例如土壤，水；来自食品，例如污染的食品，饮料；来自动物制品，例如动物饲料。提出以下实施例，以便使本领域普通技术人员更好地理解本发明，所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本公开的范围。实施例I检测耐多药结核分枝杆菌的液相芯片，包括一、带标签序列的特异性引物针对耐多药结核分枝杆菌相关位点katG531、rpoB526、rpoB531、inhA-15,分别设计特异性的引物序列。带标签序列的特异性引物由“标签序列+特异性引物序列”组成。带标签序列的特异性引物序列如下表所示 表I带标签序列的特异性引物序列(标签序列+特异性引物序列)


本发明提供了检测耐多药结核分枝杆菌的方法及和芯片。本发明的方法和芯片涉及对katG315突变型I和/或II、rpoB526突变型I和/或II、rpoB531突变型I和/或II、inhA-15突变型的检测。本发明还提供了用于检测上述突变型的引物。