一种提高分枝杆菌对植物甾醇降解速率的方法[0002]4-雄烯二酮(化学名称:雄留-4-烯-3,17- 二酮,英文名4_Androstenedione,简称AD)，该产品外观形状呈近白色晶体粉末，无异味，无毒性，不溶于水，是一种当今世界上用途极广，科技含量高的生物化工中间体。[0003]雄烯二酮是生产激素类原料药的重要中间体，可以说几乎所有留体激素药物都可以以雄烯二酮为起始原料进行生产，如用于生产皮质激素、性激素、孕激素及蛋白同化激素，又可用于合成可的松、强的松、黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是用于生产抗早孕米非司酮和各类计划生育用药必不可少的原料。[0004]雄烯二酮作为合成留体类激素药物重要的原料和关键的中间体，市场前景广阔。甾体激素药物经过几十年的研究开发，目前已形成种类繁多、临床应用广泛和需要旺盛的一大类留体药物。从实际留体激素药物产业发展来看，国外1980年产量约9.5吨，销售15亿美元，占医药产品销售总额的4.3%；1990年产量增至105吨，销售108亿美元，平均递增10.4% ；2010年销售额达到400亿美元，约占世界医药销售额的18%，保持快速发展走势，药品品种达1920种之多。 [0005]我国留体激素药物经过40多年发展，开发实力非常强劲，企业发展非常迅速。甾体激素药物年产值超过80亿元，占医药工业总产值的5%，成为我国医药工业体系中的重要组成部分。拒统计，1996年我国留体激素药物年生产能力已达220吨，产量100余吨。雄烯二酮海关编号是29372900，海关数据表明，2005年留体激素及其衍生物进口 0.14吨，进口金额2335美元，出口 151.891吨，出口金额达2542万美元。主要出口地区是印度、德国、美国、荷兰、巴西等，进口地区主要来自瑞典与新加坡。2008年1-2月份，留体激素及其衍生物进口 26吨，进口金额45.3美元，出口 111.2吨，出口金额5655万美元，预计2012年进出口数量情况较往年将会大幅度增加，金额也会继续大幅增加，主要是由于我们的产品质量与档次提高的原因。国内出口比较活跃的地区是北京、天津、上海、陕西、浙江、湖北、云南等省份，大致与其资源与加工区域一致。[0006]目前，雄烯二酮全球市场800亿美元，市场增长率20%。我国雄烯二酮现生产能力大约在1000吨左右，与需求还有很大差距。据2004年国际市场留体激素类药物原料药统计，我国制药企业每年对雄烯二酮的需求量约6000吨，其中约3000吨来需来自薯蓣皂甙生产，另外约3000吨需来自植物留醇生产，这一比例随着环境污染的要求会增加植物留醇转化生产雄烯二酮的量(从薯蓣(黄姜)分离皂甙生产雄烯二酮污染严重，许多省份已禁止生产)。所以以植物留醇或胆固醇生产雄烯二酮的受到重视，可以预见，随着生产技术的进一步发展，全球市场上植物留醇转化为雄烯二酮的销售量还将快速增长。因此，对植物留醇转化雄烯二酮大规模生产的市场前景非常诱人。[0007]激素的生产工艺生产周期长，反应过程复杂，行业进入壁垒高，国内外的生产厂家不多，竞争对手数量较少，且非常集中。国内集中在天药股份、仙琚药业等一些企业，而目前它们大都采用化学合成方法生产皮质类激素。相比化学合成法，微生物转化法具有原料成本低、生产步骤简化、生产周期缩短、生产材料费用降低等优点。国外从1998年以来一直采用植物留醇为原料生产雄烯二酮的生产工艺，攻克微生物发酵生产激素的技术一直是国内厂商多年努力方向。[0008]我公司经多年研究，开发出一套高产AD的新技术，该技术是采用以植物甾醇为主，同时辅以黄豆粉、葡萄糖和其他常用的普通发酵用化工产品，综合运用现代生物技术，解决了微生物选择性降解侧链来获得雄烯二酮产品的工业化生产的一系列技术难点，菌种转化效率高，与化学合成相比，工艺流程短，反应条件温和，提取溶剂可以回收充分利用，有很高的成本优势，是一种区别于传统工艺的全新技术，有效地促进了传统工艺技术的升级换代。


[0009]目前，提高植物甾醇降解菌生产的能力，仍以诱变育种为主要手段。针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种通过对分枝杆菌进行复合诱变来提高其对植物留醇降解速率制备“雄烯二酮”的方法
1、本发明的一种通过对分枝杆菌进行复合诱变来提高其对植物留醇降解速率制备“雄烯二酮”的方法，其包括以下步骤:
(O以植物留醇降解菌为出发菌株，将植物留醇降解菌在斜面培养基上预培养3-4天获得新鲜成熟菌体。
[0010](2)将预培养后的植物留醇降解菌制备成菌体量为I X IO6个/mL的菌悬液进行离子束辐照诱变:诱变温度为25°C，诱变剂量为50Gy诱变后立即涂培养基斜面。(3)斜面成熟后制备种子液，种子液接种后培养14_16h后涂平板进行紫外诱变:用15W功率的紫外灯管和固定距离为20cm的条件下进行分剂量照射，照射剂量为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，诱变后再经培养基平板初筛和摇瓶发酵方法复筛，获得高产菌落。
[0011](4)对该高产菌落再进行制备斜面、种子液，种子液接种后培养14-16h后涂平板再次进行紫外与激光复合诱变:用15W功率的紫外灯管和固定距离为20cm的条件下进行照射2分钟，随后立即避光转移自激光处理装置中用YAG倍频脉冲激光照射，辐照次数分别为200、400、600、800、1000、1200。诱变后再经培养基平板初筛和摇瓶发酵方法复筛，最终获得高产菌落。
[0012]2、步骤(1)或步骤(2)或步骤(4)斜面养基的配方为:葡萄糖10g，硝酸铵12g，硫酸镁2.5g，磷酸二氢钾0.25g，酵母浸粉4.5g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0-7.2。步骤(3)或步骤(4)的平板培养基的配方为:葡萄糖10g，硝酸铵12g，硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾0.25g，酵母浸粉4.5g，琼脂粉20g,加水定容至1000ml,调pH值至
7.0-7.2。步骤(3)或步骤(4)的种子液培养基的配方为:葡萄糖2.4g，硝酸铵2.4g，硫酸镁0.6g，磷酸二氢钾0.80g，酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。
[0013]3、步骤(1)或步骤(2)步骤(3)或步骤(4)斜面和平板的培养条件为:温度为29±1°C，湿度为30-60%， 平板培养周期为6天，斜面培养周期为4天。[0014]4、步骤(3)或步骤(4)的种子液培养基的配方为:葡萄糖2.4g，硝酸铵2.4g，硫酸镁0.6g，磷酸二氢钾0.80g，酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。其培养条件为29°C，220转/分，16小时。
[0015]5、步骤(3)或步骤(4)的摇瓶种子瓶培养基的配方为:葡萄糖2.4g，硝酸铵2.4g，硫酸镁0.6g，磷酸二氢钾0.80g，酵母浸粉15g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。
[0016]摇瓶发酵培养基配方为:葡萄糖30g，酵母浸粉24g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾2g，硫酸亚铁0.005g，碳酸钙10g，植物留醇50g，PEG60g，树脂60g，加水定容至1000ml，调pH值至 7.0。
[0017]6、步骤(3)或步骤(4)的摇瓶发酵是将种子培养基中培养成熟的种子液按接种量为10%接入发酵摇瓶培养基中。
[0018]7、步骤(3)或步骤(4)的摇瓶种子液培养条件为:29°C，220转/分，振荡培养32-36h。步骤(3)或步骤(4)的摇瓶发酵液培养条件为:29°C，220转/分，振荡培养168h。
[0019]8、步骤(3)或步骤(4)的摇瓶发酵液培养成熟后其效价检测方法为高效液相色谱法:
色谱条件:色谱柱:Kromasil C18 5Mm 200X4.6mm,流动相:CH30H:H2O = 80:20 (v/v),流速:1.0ml/min，检测波长:242nm。
[0020]标准曲线的测定:
配制一系列不同浓度的AD标准溶液(50-500μ8/πι1)，分别取各浓度标准溶液的过滤液20μ1注入高效液相色谱仪中，测定其吸收峰面积，然后对浓度(Y)和吸收峰面积(X)进行一元线性回归，得到一元线性回归方程。
[0021]效价计算方法:
将待测样品制成合适浓度(50-50(^g/ml)的甲醇溶液，用0.45Mm的微孔滤膜过滤，准确吸取滤液20μ1注入HPLC中，记录色谱图，将AD峰面积代入上述的回归方程中，计算得到样品中AD量。
[0022]9、步骤(3)或步骤(4)的摇瓶发酵液培养成熟后植物留醇转化率计算方法:发酵完成后，发酵液经甲醇处理后，再用液相色谱定量测出雄烯二酮的含量，然后计算植物甾醇的转化率:转化率/%=发酵液中AD含量*100/ (投料油中留醇含量*0.66*0.95)。
[0023]10、一级种子罐培养基配方:葡萄糖9g，硝酸铵9g，硫酸镁2.25g，磷酸二氢钾
2.25g，酵母浸粉45g，加水定容至2L，调pH值至7.0。
[0024]发酵罐培养基配方为:葡萄糖500g，酵母浸粉375g，硝酸铵125g，硫酸镁50g，磷酸氢二钾30g，硫酸亚铁0.125g，碳酸钙25g，植物留醇1250g，树脂1500g，加水定容至20L，调pH值至7.0。
[0025]11、将培养成熟的分枝杆菌种子液按照10% (V/V)的接种量接入50L发酵罐中，300C，220转/分，通气培养7天左右，得雄烯二酮，利用HPLC测定效价。
[0026]本发明的优点:
1、本发明通过微生物发酵提取“AD”其工业化生产技术有着诱人的前景，不仅可从根本上改变传统化学合成留体药物步骤多、得率低、价格贵等不足之处，还可充分利用和发挥资源优势，摆脱原材料来源因季节、地域等自然因素对生产的制约，对保护自然资源和生态环境、维护人类健康起重大作用。[0027]2、本发明通过三种诱变方法、四次诱变、两次筛选，得到对植物留醇降解速率较高的突变分枝杆菌。通过本方法得到植物留醇降解菌在底物留醇浓度为5%，树脂浓度为6%的基础下50L发酵罐放罐平均效价可达25-30g/ml，对植物留醇的转化率为86.8%。这样在生产过程中就会大大降低生产成本。
[0028]本发明是通过下列技术措施来实现的:
1制备材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
菌种来源:DY20111816-102 (山东东药药业股份有限公司)
1.1.2仪器与分析条件
HPLC:安捷伦-1260,色谱条件:色谱柱---Kromasil C18 5Mm 200X4.6mm
流动相---CH3OHiH2O = 80:20 (v/v),流速---1.0ml/min,检测波长---242nm。试
剂:雄留-4-烯-3，17-二酮(AD)标准品和甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。含量用外标峰面积法计算。
[0029]1.2实施方法
1.2.1培养基
斜面和平板培养基:葡萄糖10g，硝酸铵12g，硫酸镁2.5g，磷酸二氢钾0.25g，酵母浸粉
4.5g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0-7.2。
[0030]种子瓶培养基:
葡萄糖2.4g,硝酸铵2.4g,硫酸镁0.6g,磷酸二氢钾0.80g,酵母浸粉15g,加水定容至1000ml，调 pH 值至 7.0。
[0031]发酵瓶培养基:葡萄糖30g，酵母浸粉24g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾2g，硫酸亚铁
0.005g，碳酸钙10g，植物甾醇50g，PEG60g，树脂60g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。
[0032]一级种子罐培养基配方:葡萄糖9g，硝酸铵9g，硫酸镁2.25g，磷酸二氢钾2.25g，酵母浸粉45g，加水定容至2L，调pH值至7.0。
[0033]发酵罐培养基配方为:葡萄糖500g，酵母浸粉375g，硝酸铵125g，硫酸镁50g，磷酸氢二钾30g，硫酸亚铁0.125g，碳酸钙25g，植物留醇1250g，树脂1500g，加水定容至20L，调pH值至7.0。
[0034]1.2.2培养条件:
平板和斜面:温度为29 ± I °C，湿度为30-60%，平板培养周期为5-7天，斜面培养周期为4-5 天。
[0035]摇瓶种子:29°C ±1，220转/分，振荡培养32_36h。
[0036]摇瓶发酵液培养条件为:29±1°C，220转/分，振荡培养168h。
[0037]1.2.3制备技术一诱变处理
(I)离子束辐照诱变:将预培养后的植物留醇降解菌制备成菌体量为I X IO6个/mL的菌悬液进行离子束辐照诱变:诱变温度为25°C，诱变剂量为50Gy诱变后立即涂培养基斜面。
[0038](2)紫外诱变:斜面成熟后制备种子液，种子液接种后培养14_16h后涂平板进行紫外诱变:先用15W功率的紫外灯管和固定距离为20cm的条件下进行分剂量照射，照射剂量为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，诱变后再经培养基平板初筛和摇瓶发酵方法复筛，
获得高产菌落。
[0039](3)紫外激光复合诱变:对该高产菌落再进行制备斜面、种子液，种子液接种后培养14-16h后涂平板再次进行紫外与激光复合诱变:用15W功率的紫外灯管和固定距离为20cm的条件下进行照射2分钟，随后立即避光转移自激光处理装置中用YAG倍频脉冲激光照射，辐照次数分别为200、400、600、800、1000、1200。诱变后再经培养基平板初筛和摇瓶发酵方法复筛，最终获得高产菌落。
[0040]2试验结果及分析
2.1离子束辐照诱变
将预培养后的植物留醇降解菌制备成菌体量为I X IO6个/mL的菌悬液在诱变温度为25°C，诱变剂量为50Gy的条件下进行诱变，诱变结束后立即涂培养基斜面。斜面成熟后菌层较对照组厚，颜色更重。
[0041]2.2紫外诱变
随机挑选一定数量经不同剂量紫外光照射的单菌落进行筛选。结果发现，虽然正突变率随诱变菌株死亡率的增加而提高，但正突变幅度最高的菌种出现在低剂量照射组(表1)。
[0042]表1 紫外诱变结果