专利名称：一种分枝杆菌多糖及其制备方法和应用的制作方法多糖是由许多单糖聚合而成的天然高分子化合物，相对分子质量从几千到几百万不等，是生命有机体的重要组成部分，自从20世纪50年末发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来，人们对多糖这类重要生命物质有了新的认识，多糖的研究和应用已渗入到医药、食品、化妆品、饲料等许多领域，从而使这一学科成为目前生命科学中最活跃的研究領域之一。 微生物多糖是细菌、真菌等微生物在代谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物，安全无毒、理化性质独特。其生产周期短，不受季节、地域等条件限制，具有较强的市场竞争カ和广阔的发展前景。本发明主要针对非结核分枝杆菌，主要为快速生长的非致病性分枝杆菌，提取其细胞壁或细胞荚膜中有活性的多糖成分，经检验，该多糖具有显著的抗肿瘤和免疫调节作用。首先，分枝杆菌及其菌体制剂本身即可产生良好的非特异性免疫作用，可用于治疗肿瘤和多种免疫性疾病。分枝杆菌种类较多，可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。自20世纪20年代用于预防结核的卡介苗(BCG，减毒的牛型结核分枝杆菌)问世以来，不断有研究发现其他非结核分枝杆菌如草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)等也可以用于结核病的免疫治疗,而且分枝杆菌具有非特异性免疫调节作用，对接受治疗的结核病患者原有的慢性气管炎、感冒、哮喘、风湿性疾病、神经性慢性皮炎等疾病也有疗效。因此，研究者注意到人体接种分枝杆菌属细菌，可产生良好的非特异性免疫，并可提高机体抗病毒能力，对ー些慢性常见病具有一定的治疗效果。目前国内外研究较多的分枝杆菌制剂主要有卡介菌制剂、草分枝杆菌制剂、母牛分枝杆菌制齐U、耻垢分枝杆菌制剂等。卡介菌苗是减毒牛型结核分枝杆菌，灭活的卡介菌苗是临床上用于预防结核病的有效疫苗，也是有力的细胞免疫增强剂，用于治疗恶性黑色素瘤，或在肺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤根治性手术或化疗后作为辅助治疗，尤其对浅表膀胱癌的防治，BCG疗效明确，是目前公认的首选疗法。草分枝杆菌是非结核分枝杆菌的ー种，基于它同結核菌的生物亲缘关系，通过特殊的物质交换，可持久地介入人体的免疫过程，不断调节机体免疫系统的免疫能力，特别是细胞免疫系统的功能，从而表现出杀菌、清除体内病原菌、增强抵抗力等免疫效应，达到治疗目的。由德国Sanum-Kehlbeck公司生产的草分枝杆菌注射液(Mycobacteriumphlei F. U. 36 injection),商品名乌体林斯(utilin “s” injection)(參见 Harders, G.，et al. Mitte丄 zur Immumisierung des menscnlichen Korpers bei HIV-Infektionen DE3728367C1 [P], 1988)能显著增强特异性细胞免疫功能，临床药理实验证明用药后机体免疫性能提高，减少肿瘤复发。母牛分枝杆菌也是非结核分枝杆菌的ー种，母牛分枝杆菌菌苗(Mycobacteriumvaccae vaccine)在结核病的免疫治疗、结核病感染高危人群(HIV感染者)的预防性治疗、癌症治疗(非小细胞肺癌、恶性间皮瘤、前列腺癌)、哮喘及过敏性皮炎的治疗等方面均有应用。安徽龙科马生物制药有限责任公司生产的注射用母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae forinjection),商品名为微卡(Vaccae)(參见李伟，陶立峰.冻干母牛分枝杆菌制剂(微卡)及其制备方法和用途中国，CN1332018C[P]. 2007-08-15)具有明显的双向免疫调节功能。目前主要用于对结核病的免疫辅助治疗，并在肿瘤、こ肝、类风湿关节炎、感冒、皮肤病、哮喘等疾病的治疗上均具有潜在的临床价值。 王国治等研究的耻垢分枝杆菌制剂由耻垢分枝杆菌(MycobacteriumSmegmatis)(參见王国治，徐苗，陈保文等.耻垢分枝杆菌制剂及其应用中国，CN1318573C[P], 2007-05-30)经破碎裂解制备而成，是ー种安全、有效的免疫调节剂，具有双向免疫调剂作用，对结核病、肝炎如こ肝以及哮喘等疾病有潜在的预防或/和治疗效果。长春长生基因药业股份有限公司生产的无细胞耻垢分枝杆菌制剂已批准进入临床研究。但是，分枝杆菌全菌制剂抗原性强，不良反应较多，治病的机制，至今尚有争议，国际上尚无确切的定论。近年来研究表明，从分枝杆菌提纯得到的多糖类物质，具有特殊的理化和生物学性质，在临床和科研上已开始得到应用，在免疫调节方面具有特殊药效，逐步引起人们的重视。分枝杆菌多糖克服了分枝杆菌全菌制剂的抗原性，是分枝杆菌有效成分的活性提取物，成分明确，安全无毒，无副作用。一般认为分枝杆菌的细胞通常含有四种多糖，S卩阿拉伯半乳聚糖(AG)、阿拉伯甘露聚糖(AM)、甘露聚糖以及糖原样葡聚糖。有研究表明，阿拉伯半乳聚糖主要分布在细胞壁，阿拉伯甘露聚糖、甘露聚糖、糖原样葡聚糖分布在英膜样外膜中，阿拉伯甘露聚糖和甘露聚糖是主要的抗原性多糖。很多研究者已证实用热水从分枝杆菌细胞提取的多糖具有免疫调节和抗肿瘤活性(例如參见 Maes E, Coddeville B, Kremer L, et al. Polysaccharidestructural variability in mycobacteria identmcation and characterizationof phosphorylated mannan and arabinomannan[J]. Glycoconj J，2007，24 :439-448.)。Tian等用沸水提取母牛分枝杆菌(M. vaccae)完整細胞，认为3. 6KDa的多糖是抗肿瘤蛋白-多糖复合物的主要糖部分，NMR显示该糖是由α位连接的O-甲基化甘露糖組成的同聚糖(参见 Tian XX，Li AF, Farrugia IS, et al. Isolation and identification ofpoly-α - (I 一 4)-linked 3-0-methyl-D-mannopyranose irom a hot-water extract oiMycobacterium vaccae [J]. Carbohydrate Research，2000，324 :38-44.) DDinadayala 等从BCG Tice次代菌株中用沸水法提取到一种抗肿瘤多糖为6-a-葡聚糖(参见DinadayalaP，Lemassu A,branovski P，et al. Revisiting tne structure of the antι-neoplasticglucans of Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin[J]. Thejournal ofbiological chemistry，2004，279 (13) : 12369-12378.)。阿拉伯甘露聚糖也能刺激和激活免疫細胞，可用作疫苗以抵抗分枝杆菌的感染，也可作为免疫治疗剂用于癌症治疗(例如参见 WittKowski M，Mittelstadt J，Brandau S，et al. Capsular arabinomannansirom Mycobacterium avium with morphotype-specific structural differencesbut identical biological activity[J]· Thejournal ofbiological chemistry，2007，282(26) :19103-19112.)首都医科大学的陈仁等选用草分枝杆菌，经细菌培养、去蛋白、除核酸、脱脂肪等处理和柱层析纯化，提取制备了分枝杆菌多糖(Mycobacterial polysaccharides,MPS),研究表明MPS有显著的抗肿瘤活性。在临床上可适用于化疗患者的白细胞回升、类风湿性关节炎、慢性こ型肝炎、反复呼吸道感染、哮喘以及其他伴有免疫功能降低或因免疫功能低下而引起的多种疾病的治疗(參见陈仁，郭建强，潘燕春等.一种分枝杆菌多糖复合物及其制备方法:中国，CN100358535C[P], 2008-01-02.)。本发明的任务是从非结核分枝杆菌中提取分枝杆菌多糖，得到具有免疫调节作用的活性多糖，本发明提供了ー种具有创新性的分离纯化方法，使其具有エ艺简单、产率高、成本低廉的特点。与上述专利方法不同的是，本发明侧重于ー类快速生长的非致病性分枝杆菌，也属于非结核分枝杆菌，并着重提取其细胞壁或细胞荚膜中有活性的多糖成分，成分和结构 明确，纯度高，并具有明显的抗肿瘤作用。同时本发明采用新颖的水提与碱提相结合的方法，既得到杂多糖的复合物，又得到単一的匀多糖，多糖成分明确，结合蛋白少。得到水提多糖为含4 6种杂多糖成分的多糖复合物，多糖纯度可达到90%以上；碱提多糖是ー种匀多糖，为单ー的甘露聚糖，纯度可达到95%以上，这种制备エ艺，提高了分枝杆菌的利用率，提高了多糖的收率，使分枝杆菌多糖的生产成本降低，无副作用，将其开发成免疫调节类药物，将会有良好的应用前景。
根据上述需要，本发明提供了一种抗肿瘤作用的分枝杆菌多糖及其制备方法和用途，所制得的分枝杆菌多糖具有较高的抗肿瘤活性，纯度高，且制备方法简单易行，成本较低廉。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下ー种具有抗肿瘤活性的分枝杆菌多糖，为杂多糖复合物或匀多糖，重均分子量为I万 10万道尔顿,单糖组成为甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等。在本发明的优选方案中，上述的分枝杆菌是非结核分枝杆菌，可以是草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、母牛分枝杆菌、胃分枝杆菌、偶发分枝杆菌、戈登分枝杆菌等非结核分枝杆菌中的ー种，优选草分枝杆菌和耻垢分枝杆菌。在本发明中，分枝杆菌多糖含O 10%的结合蛋白质。所述具有抗肿瘤活性的分枝杆菌多糖由下法制得A.将含有分枝杆菌的传代培养物进行扩增培养至生长成淡黄色菌膜；B.水提多糖制备收集菌膜，依次脱脂，采用超声辅助沸水提取，离心，提取液采用Sevag法除蛋白，浓缩，こ醇沉淀得到粗多糖；C.碱提多糖制备将上述水提残渣采用稀碱在低温下提取，离心得提取液，将提取液中和，提取液采用Sevag法除蛋白，浓缩，こ醇沉淀得到粗多糖；D.多糖精制上述粗多糖分别经离子交換柱精制，透析，浓缩，冷冻干燥得到两种分枝杆菌多糖。在本发明中，水提多糖是ー种杂多糖的复合物，重均分子量为I万 10万道尔顿，单糖组成为甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等；碱提多糖是均一的甘露聚糖，重均分子量为I万 10万道尔顿，单糖组成为甘露糖；在本发明中，分枝杆菌的传代培养物接种于液体苏通培养基或马铃薯培养基上，于37°C培养15 25天，收集液体表面的菌膜为淡黄色、多皱状，培养过程中保持分枝杆菌传代数小于等于五代。在本发明中，采用有机溶剂于70°C回流脱脂，有机溶剂为丙酮、石油醚等。在本发明中，采用超声提取时间为40 60分钟，固液比为I : 100 I : 200，提取次数为I 2次。 在本发明中，加入菌体量8 10倍的水，沸水提取2次，提取时间为4 8h，浓缩相当于菌体干重的2倍体积，得浓缩液。在本发明中，所用的碱提多糖提取采用碱为NaOH、KOH、NaHC03、KHCO3> K2CO3，碱液浓度为O. I 2mol ·じ1NaOH，提取温度为4 10°C。在本发明中，采用Sevag法除蛋白的具体方法是Sevag试剂中氯仿正丁醇=5 : I。Sevag试剂与多糖样品的体积比为I : 5,振摇萃取时间为20 30min,萃取次数为4 8次。在本发明中，所述浓缩液经こ醇沉淀分离得到粗多糖的方法是向浓缩液加入こ醇，使溶液こ醇浓度达80%以上，分离沉淀，得粗多糖。在本发明中，所用离子交换柱为DEAE纤维素柱或DEAE琼脂糖柱，洗脱液为蒸馏水和O. I Imol ·じ1的NaCl溶液,分步收集,用苯酹-浓硫酸法检测。分枝杆菌多糖含量测定采用苯酚-浓硫酸法。(I)标准曲线的绘制精密称取葡萄糖对照品lOOmg，置于IOOml容量瓶内.加入蒸馏水溶解并定容至刻度。用移液管精密吸取O. 25,0. 5、I. O、I. 5,2. 0,2. 5ml溶液分别置于具塞刻度试管中，蒸懼水补充至5ml,加入5%的苯酹溶液I. Oml,再用酸式滴定管滴加浓硫酸5. 0ml，振摇5min，沸水水浴加热15min，取出，冷水冷却30min。以空白为參比，用紫外可见光分光光度计在波长490nm处测吸光度。以糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。(2)分枝杆菌多糖的含量測定精密称取多糖O. 05g,加入90ml蒸馏水，加热使溶解，移入IOOml容量瓶内，蒸馏水定容至刻度。再精密吸取溶液2. Oml置于具塞刻度试管中，定容到5ml,加入5%苯酹溶液I. Oml,浓硫酸5. Oml,振摇5min,沸水水浴加热15min,取出，冷水冷却30min，以空白为參比，在紫外可见波长490nm处测吸光度，由标准曲线方程计算出多糖的含量。每份样品平行測定3次。分枝杆菌多糖纯度测定采用液相色谱法。色谱条件反相C-18色谱柱(250mm X 4. 6mm, 5 μ m),流动相为O. I %三氟こ酸こ腈(9 :1)，流速I. OmL · mirT1，柱温35°C，进样量20 μ I，检测器为示差折光检测器或蒸发光检测器。測定方法将样品稀释后注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。分枝杆菌多糖重均分子量测定采用HPGPC法。色谱条件TSK-GEL3000SW色谱柱(7. 8X 300mm)，流动相为水，流速 L OmL .mirT1,柱温35°C，进样量20 μ 1，标样为已知分子量的葡聚糖(分子量分别为600，7100，21400，41100,84400,133800，中国药品生物制品检定所)，检测器为示差折光检测器或蒸发光检测器。测定方法将样品与已知分子量的标样葡聚糖，分别溶解制成每IOmg ι Γ1的溶液注入液相色谱仪，由GPC软件计算该样品的相对分子质量。分枝杆菌多糖的单糖组分測定采用气相色谱法。(I)单糖衍生物的制备准确称取标准单糖样品10. Omg于试管中，加入盐酸羟胺IOmg和内标8mg，加入吡啶O. 5ml，振荡混匀，放入90°C水浴中加热反应30min。取出后冷却至室温，加入O. 5ml醋酸酐，在90°C下继续反应30min进行こ酰化，70°C水浴中将反应产物吹干，加入Iml氯仿重新溶解，去O. 5 μ I进行GC分析。 (2)多糖样品的水解和衍生化水解精密称取分枝杆菌多糖样品10. Omg溶解到4mol ·じ1三氟こ酸溶液中，配成10. 0g·じ1的多糖水解溶液，转移此溶液到安瓿中封ロ，置于105°C烘箱中加热水解。取出，70°C水浴中吹干。衍生化将上述水解后的分枝杆菌多糖按照上述单糖衍生化的方法，依次加入各种试剂进行衍生化反应，取O. 5 μ I经过氯仿重新溶解的衍生化产物进行GC分析。(3)气相色谱的条件为分离柱采用HP-5MS(30mX0. 25mm，0. 25μπι)，氢气流速16mL · mirT1,空气流速15OmL · mirT1,氮气流速2OmL · mirT1,进ロ温度230 °C,检测器温度230 V，柱采用程序升温，起始温度130で，以5 °C · mirT1升至180 V，保持2min，再以5°C ^mirT1升至220°C，保持3min。对照样品与标准品的出峰位置判断多糖组成。本发明利用生物技木，从ー类快速生长的非结核分枝杆菌菌种培养得到的菌体中提取分离具有明显抗肿瘤活性和免疫机能的分枝杆菌多糖，采用新颖的水提与碱提相结合的方法，既得到杂多糖的复合物，又得到单ー的匀多糖，多糖成分明确，结合蛋白少。得到水提多糖为含4 6种杂多糖成分的多糖复合物，多糖纯度可达到90%以上；碱提多糖是一种匀多糖，为单ー的甘露聚糖，纯度可达到95%以上，并制定了严格的质量标准。所用方法简单易行，提高了分枝杆菌的利用率，提高了多糖的收率，使分枝杆菌多糖的生产成本降低，成本较低廉，所得分枝杆菌多糖具有较高的抗肿瘤活性，可用于制备提高免疫机能和抗肿瘤的药物或保健品。对小鼠脾淋巴细胞增殖实验表明，本发明分枝杆菌多糖可以能显著促进脾淋巴细胞的增埴，甚至超过卡介菌多糖核酸的效果。对植入Sarcoma 180肿瘤的小鼠进行体内腹腔注射实验的生物活性结果表明，本发明分枝杆菌多糖对肿瘤细胞有明显的抑制作用。分枝杆菌多糖的体外抗肿瘤实验结果表明，其对肉瘤细胞S180、肝癌细胞SMMC-7721、胃癌细胞SGC-7901、肺癌细胞A549等肿瘤细胞的生长均有抑制作用，且呈剂量依赖关系。
图I为草分枝杆菌水提多糖液相色谱示意图说明水提多糖为含有4 6种多糖的复合物，图为E101013批水提多糖液相色谱图。色谱条件反相C-18色谱柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),流动相为O. 1%三氟こ酸乙腈(9 I)，流速I. OmL .mirT1,柱温35°C，进样量20 μ 1，检测器为SEDEX75蒸发光检测器。
图2为草分枝杆菌碱提多糖液相色谱示意图说明碱提多糖含主要为甘露聚糖，图为E101013批碱提多糖液相色谱图。色谱条件反相C-18色谱柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),流动相为O. 1%三氟こ酸乙腈(9 I)，流速I. OmL .mirT1,柱温35°C，进样量20 μ 1，检测器为SEDEX75蒸发光检测器。图3为耻垢分枝杆菌水提多糖液相色谱示意图说明水提多糖为含有4 6种多糖的复合物，图为Ε101020批水提多糖液相色谱图。色谱条件反相C-18色谱柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),流动相为O. 1%三氟こ酸乙腈(9 I)，流速I. OmL .mirT1,柱温35°C，进样量20 μ 1，检测器为SEDEX75蒸发光检测器。图4为耻垢分枝杆菌碱提多糖液相色谱示意图说明水提多糖主要为甘露聚糖，图为Ε101020批碱提多糖液相色谱图。色谱条件反相C-18色谱柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),流动相为O. 1%三氟こ酸乙腈(9 I)，流速I. OmL .mirT1,柱温35°C，进样量20 μ 1，检测器为SEDEX75蒸发光检测器。

实施例2采用罗氏鸡蛋培养基培养耻垢分枝杆菌，培养过程中保持分枝杆菌传代数小于等于五代。采用马铃薯培养基进行扩增培养，在37°C培养20 25天，培养基表面长成淡黄色、多皱状菌膜，过滤收集菌体。培养过程中，注意监测培养物未染菌，无异常，采用生物显微镜抽样检查。上述培养物加入菌体量十倍的丙酮，于70°C用回流脱脂两次，毎次4小吋，然后过滤收集菌体，自然挥干，加入菌体量150倍的蒸馏水，超声提取两次，毎次40分钟，再煮沸提取两次，毎次4小吋，离心收集提取液，浓缩至初始菌体量的2倍，为水提浓缩液。将上述水提残渣加入稀碱，至终浓度为O. 5mol ·じ1NaOH，4°C搅拌过夜，离心收集上清，弃残渣，于上清加稀酸中和至PH6 8，浓缩至初始菌体量的2倍，为碱提浓缩液。将上述浓缩液分别采用Sevag法除蛋白，Sevag试剂中氯仿正丁醇=5 I,Sevag试剂与浓缩液体积比为I : 5,振摇萃取时间为20min,萃取6次。向浓缩液加入こ醇，使溶液こ醇浓度达80%，离心分离沉淀，用蒸馏水溶解，得粗多糖溶液。将粗多糖溶液透析后，上DEAE纤维素柱，分别用蒸馏水和O. 25mol ·じ1、Imol ·じ1的NaCl溶液洗脱，分步收集，采用苯酚-浓硫酸法跟踪检测，从洗脱曲线上看到三个峰，第ー个峰含量高，为目的产物，将其收集、透析，浓缩，冷冻干燥，分别得到水提和碱提分枝杆菌多糖。采用苯酚-浓硫酸法測定多糖的含量，用带有蒸发光或示差检测器的液相色谱测定其纯度，用HPGPC法測定重均分子量(Mw)，用气相色谱法測定其单糖组成。经过多批次提取多糖试验证明，多糖质量稳定，收率理想，纯度高，结果见附表2。附表2三批耻垢分枝杆菌多糖的质量情况


本发明涉及一种分枝杆菌多糖。其制法是，将分枝杆菌培养15～25天，收集菌膜，依次脱脂，采用超声辅助沸水提取，离心；残渣采用稀碱提取，中和；提取液除蛋白，乙醇沉淀得到粗多糖，最后经过离子交换柱，透析，浓缩，冷冻干燥得分枝杆菌多糖，得到产品为杂多糖复合物或匀多糖，重均分子量为1万-10万，单糖组成为甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等，总收率可达20～30mg/L培养液，多糖成品纯度高，工艺简单，产品质量稳定，成本低，易于工业化生产。所得分枝杆菌多糖具有较高的抗肿瘤活性，可用于制备提高免疫机能和抗肿瘤的药物或保健品。