专利名称：柴胡总多糖在治疗急性肺损伤药物中的用途的制作方法急性肺损伤(acute lung injury，ALI)为由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性加重的呼吸困难、难治性低氧血症和肺水肿。是一种以肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞损伤为病理特征的临床上常见非特异性免疫反应疾病，即为全身炎症导致系统性功能障碍综合征的肺部表现(章卓，万敬员，罗福玲等.中草药杂志，2008，39: 1196-1199.)。研究发现，诱发ALI模型的因素可分为细菌性的和非细菌性的。严重感染败血症、创伤、中毒、大量输血、体外循环和弥漫性血管内凝血(DIC)等均可导致ALI，而以严重感染最为常见，严重阶段ALI的病死率高达40% (Mclntyre RC,Pulido EJ,Bensard DD, et al.Crit Care Med 2000，28 :3314-3331.)。内毒素是经典的诱发ALI模型的细菌性诱因之一，LPS进入体内后很容易被免疫防御系统识别，通过传递炎症反应的一些细胞介质来引起肺部组织损伤。临床研究表明，ALI主要症状表现为局部募集反应、肺中性粒细胞聚集和促炎因子和介质的大量释放、肺内皮及上皮细胞受损引起的弥漫性肺间质及肺泡水肿、 蛋白的大量渗出和髓过氧化物酶(MPO)活性的增强等。研究表明由中性粒细胞为主介导的肺局部炎症反应，是形成肺毛细血管通透性增高及肺水肿的病理基础。柴胡为伞形科柴胡属(Bupleurum)植物。是我国的传统中药和常用中药，临床应用十分广泛。其性味苦凉，有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气之功效(中华人民共和国卫生部药典委员会。中国药典。一部。北京中国医药科技出版社，2010:263)，用于治疗寒热往来，胸满胁痛，口苦耳聋，头痛目眩等。早期的研究认为，北柴胡的主要有效成分为柴胡皂苷和挥发油。药理学研究证明，北柴胡具有解热、抗炎、镇痛、免疫增强、保肝利胆、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用；与北柴胡相仿，小叶黑柴胡具有明显的解热、抗炎、镇痛和增强免疫功能的作用(赵玉珍，陶上乘，王英华等.中药材，1998，21 (6) :307-309)。文献报道北柴胡的提取成分(水提取成分，50%乙醇提取成分，氢氧化钡提取成分)对小鼠脾淋巴细胞的增殖，白细胞介素-2和肿瘤坏死因子的分泌水平，均有明显的增强作用。文献(张兴权，陈鸿珊.中国药理学与毒理学杂志，1989,3(1) :31.)报道柴胡 (Bupleurum chinense DC)多糖能显著增加脾系数；提高巨噬细胞和天然杀伤细胞功能；能提高病毒特异抗体滴度；能明显增加淋巴细胞转化率和皮肤迟发超敏反应，显示免疫促进作用。柴胡另一成分皂苷对小鼠TPA引起的皮肤慢性炎症和二甲苯引起的耳壳炎症有一定程度的抑制作用。以上研究均未涉及柴胡多糖，及其多糖对急性肺损伤的作用。综观国内外的研究，均未见报道柴胡总多糖的治疗急性肺损伤药效及其药物。
本发明的目的是提供柴胡总多糖在治疗急性肺损伤药物中新的药用用途及柴胡总多糖的制备方法。本发明所述的中药柴胡包括北柴胡(Bupleurum chinense DC)和小叶黑柴胡 (Bupleurum smithii var. parvifolium)。本发明从上述中药柴胡中分离提取得到总多糖提取物。整体动物模型试验证实其具有较强的治疗实验性急性肺损伤作用。本发明进行了柴胡总多糖对急性肺损伤小鼠的治疗作用实验研究，实验结果揭示，小叶黑柴胡和北柴胡总多糖对急性肺损伤有治疗作用。所述的柴胡总多糖可显著降低肺组织湿重/干重比值、明显抑制肺灌洗液中蛋白渗出、减少肺中性粒细胞聚集数量、降低髓过氧化物酶(MPO)活性，抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)水平升高，血清一氧化氮(NO)升高也受到抑制。本发明的目的通过下述技术方案实现1、制备柴胡总多糖中药柴胡包括北柴胡(Bupleurum chinense DC)和小叶黑柴胡(Bupleurum smithii var. parvifolium)。柴胡药材以95%乙醇冷浸提取，滤过，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩，离心，上清液以三氯醋酸去游离蛋白，离心，上清液用水透析3天，透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80%，离心，沉淀冷冻干燥即得总多糖提取物，收率达3%以上，多糖含量超过65%。所述的中药柴胡包括北柴胡(Bupleurum chinense DC)和小叶黑柴胡(Bupleurum smithii var. parvifolium)。2、柴胡总多糖用于治疗急性肺损伤试验1)单个核细胞计数肺灌洗液离心，200μ 1 NS收集下层细胞沉积，打勻。0.05%龙胆紫染液稀释后，光学显微镜下计数单个核细胞数。结果显示，与模型组相比，小叶黑柴胡和北柴胡总多糖均可显著降低小鼠单个核细胞数的增多(P < 0.001)。2)肺湿重/干重比测定右肺下叶置于滤纸，待滤纸吸干表面水分后称重，以此为湿重；之后放置在37°C 培养箱烘干(> 7 )，直到两次称重，重量不再变化，称得干重；计算肺组织湿重/干重比 (即W/D)。干湿比=湿重/干重。结果显示，与模型组相比，小叶黑柴胡和北柴胡总多糖可显著抑制小鼠肺湿重/干重比值的增高(P < 0. 01，P < 0. 05)。3)肺总蛋白测定考马斯亮蓝法检测蛋白含量。牛血清白蛋白作为标准蛋白溶液，制作标准曲线。 小鼠肺灌洗液离心。上清用生理盐水稀释。考马斯染液中加入待测样品后，于自动酶标仪 (Labsystems Dragon) 540nm处读取吸收度(A)值。结果显示，与模型组相比，小叶黑柴胡和北柴胡总多糖可显著抑制小鼠肺总蛋白水平的升高(P < 0. 001，P < 0. 01)。4)肺灌洗液MPO测定小鼠肺灌洗液离心。上清按MPO试剂盒说明书测定。结果显示，与模型组相比，小叶黑柴胡和北柴胡总多糖可显著降低小鼠肺灌洗液MPO的增高(P < 0. 05，P < 0. 01) ；20 和40mg/kg北柴胡总多糖也有一定的药效，但没有显著性差异(P = 0. 07)。5)灌洗液TNF-α测定小鼠肺灌洗液离心。上清按TNF-Ci试剂盒说明书测定。结果显示，与模型组相比， 小叶黑柴胡和北柴胡总多糖均可显著降低小鼠肺灌洗液TNF-Ci水平的升高(Ρ<0. 001)。6)血清NO测定取小鼠血，离心得血清。血清NO按Griss试剂法测定。结果显示，与模型组相比， 小叶黑柴胡总多糖和北柴胡总多糖均可显著降低小鼠血清NO水平的增高(P < 0. 001)。表1是急性肺损伤小鼠各指标测定结果(X士SD)表 本发明属中药领域，涉及柴胡总多糖在制备防治急性肺损伤药物中的用途。本发明从中药柴胡中分离提取得到总多糖提取物，平均产物收率3.32％，多糖含量超过65％。所述柴胡总多糖提取物经整体实验证实，对小鼠急性肺损伤有明显的治疗作用。所述柴胡总多糖能通过其抗炎机制，降低肺的毛细血管通透性、减轻肺水肿、抑制全身和肺部局部炎症反应，从而减少急性肺损伤。可用于制备防治细菌感染或非细菌感染等多种刺激因素引发的急性肺损伤药物。