专利名称：耐多药结核分枝杆菌非荧光dna微阵列检测方法及试剂盒的制作方法结核病是当今全球范围内对人类最具威胁的传染性疾病之一，20世纪80年代中期以来在全球出现回升趋势。据世界卫生组织报道，我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44. 5%，全国约 5.5亿人受到了结核菌感染，感染率高于全球人口 1/3感染率的水平。同时，近年来，由于抗结核药物的不规范治疗,患者体内的结核菌对多种抗结核药物发生耐药，从而形成耐多药结核病，耐药结核病问题日趋严重成为结核病控制的难题之一。世界卫生组织2008年I月的调查报告显示，全球范围耐多药(NDR-TB)结核病的发病率已达到创纪录水平，全球114个国家和地区的结核病新发病例耐药率达到17. 0%，多重耐药率达到2. 9%。全年新发结核病例940万，死亡病例180万。同年估计有44万耐多药结核病例，15万例耐多药结核病死亡。中国是俄罗斯以外结核病耐药最严重的国家，卫生部2007 2008年全国结核病耐药基线调查显示，中国肺结核患者耐多药率为8. 32%，广泛耐药率为O. 68%。因此，结核病的快速诊断和最佳个体化治疗方案的建立仍然是结核控制中的重要挑战之一。由于结核分枝杆菌生长缓慢，如今广泛应用的耐药测定方法均是建立在菌株的基础上，虽然使用了新的液体培养基，但仍然耗时较长，推迟了获得菌株敏感型的时间。在现阶段，我国各医院广泛采用痰培养加药物敏感性实验来检测结核杆菌的耐药性，即先培养出结核杆菌，再给予抗结核药物，并观察药物抑菌效果。该法的检测结果可靠，但最大不足之处是培养条件要求高,结核杆菌生长缓慢,往往需要6-8周；同时痰培养检出率低，仅为30%，故药敏试验的检出率也仅有30%左右，不能满足临床检测需要。随着基因诊断技术的不断发展，DNA序列测定(DNA sequenc ing )、PCR-单链构象多态性分析(PCR- SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性分析(RFLP)、RNA /RNA错配试验(RNA /RNA )、异源双链构象(HDF)、多重连接依赖的探针扩增(M LPA)等分子生物学方法引入结核分支杆菌耐药性的诊断，相对于传统的检测方法检测时间短，但这些方法仍存在诸如仪器与成本上的局限性，不适合推广应用。于是，开发一种操作简单，成本低廉的快速准确诊断耐多要结核病的检测方法，对于早期发现、阻断耐药结核病的传播，规范指导用药，提高耐药结核病的治愈率具有非常重要的意义。临床诊断要求检测方法具有简单、快速、重复性好、高通量和低成本的特点。目前已有的以纤维膜为固相支持物的反向斑点膜杂交技术途径通常采用人工点样、肉眼检测杂交结果的操作方式,不利于检测试验的均质控制。DNA微阵列(DNA microarray)又称DNA阵列或DNA芯片，是一块带有DNA微阵列(micorarray)涂层的特殊玻璃片。在经过特殊处理的玻璃基片上通过点样、原位合成等方法有序固定多条DNA序列，经由一次测验，即可提供大量序列信息，具有操作简单、快速、精确、低成本的特点，在临床诊断中已被广泛应用于人类基因SNP、等位基因及多种微生物病原体DNA的检测。根据基因突变、SNP等位点特异性，针对目的基因片段设计带有特殊标记的探针序列，在待检测位点存在一个碱基的差异。在芯片杂交过程中一个碱基的不同即可引起Tm值的大幅降低，从而使正常碱基配对探针显示阳性结果，而错配探针既成为阴性结果。基于以上技术背景，本发明将基于PCR的DNA微阵列杂交技术成功引入到结核分枝杆菌耐药基因检测的领域中。 利福平是抗结核联合化疗中主要的一线药物。正常情况下，利福平(RFP)与RNA聚合酶β亚基(rpoB )特异性结合，阻断RNA的合成而起到抑制细菌生长的作用。rpoB基因在利福平的药物选择压力下发生突变而改变所编码的rpoB亚基构象，从而降低与利福平的亲和力。突变一般集中在rpoB基因的507 533位的27个氨基酸密码子，长度81bp的利福平耐药决定区(RRDR)内。异烟肼是结核病临床治疗方案中5种一线药物中关键的一种，也是最容易出现耐药性的抗结核药物。研究表明，异烟肼耐药主要与编码过氧化氢酶-过氧化物酶的katG基因以及编码还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性烯酰基载体蛋白还原酶的inhA基因的启动子基因突变相关。其中突变频率最高的是katG 315位点以及inhA -15位点。
本发明的目的是提供一种基于PCR扩增的结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变的DNA微阵列检测方法及检测试剂盒。本发明提出的基于PCR扩增的快速检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药相关基因突变的非荧光DNA微阵列检测方法，扩增3个结核耐药相关基因相应DNA序列的PCR体系和同时检测所述耐药相关基因相应点突变的DNA微阵列杂交体系； 所述的3个结核分枝杆菌耐药相关基因是rpoB、inhA和katG基因，所述基因区域中的突变包括rpoB基因511、516、526、531、533位点，katG基因315位点和inhA基因-15位点；具体步骤如下 (1)设计针对3个基因的3对特异性扩增引物，应用dUTP-UNG酶系统，采用PCR扩增体系进行扩增，得到相应3个基因目的DNA ； (2)采用DNA微阵列杂交体系检测结核分枝杆菌rpoB、inhA和katG基因突变情况； 其中，反向扩增引物5 ‘端作生物素标记，引物序列及其扩增产物包含的突变位点如表
I所示
表I引物序列及扩增产物信息


本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种耐多药结核分枝杆菌检测方法及试剂盒。本发明的试剂盒包括针对结核分枝杆菌利福平和异烟肼主要耐药基因核酸片段的PCR正反向扩增引物(正向扩增引物5’端有生物素标记)和寡核苷酸探针序列(5’端有氨基标记)，可在一个反应单位中同时检测rpoB基因511、516、526、531和533位、katG基因315位和inhA基因-15位的突变情况。本发明的试剂盒可快速检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼主要耐药基因突变情况，且对仪器和费用要求低廉，操作简单，可应用与结核分枝杆菌的耐药基因检测。