专利名称：前药抗癌治疗的制作方法
本发明提供了用于抑制个体内癌细胞生长的组合物和方法。本发明特别适用于抑制具有组成型活化的Abl酪氨酸激酶活性的癌细胞的生长，例如携带 t(9;22)(q34;qll)易位的慢性髓细胞性白血病(CMIj)细胞。该染色体重排得到bcr-abl融合基因。bcr-abl融合基因表达了据信在白血病生成中具有重要作用的具有组成型活化的Abl酪氨酸激酶活性的嵌合Bcr-Abl蛋白。因此在一个实施方式中，本发明提供了一种抑制个体内癌细胞生长的方法，其中所述癌细胞具有组成型活化的Abl酪氨酸激酶活性。该方法包括对个体施用修饰的蛋白激酶C(PKC)，其具有Abl酪氨酸激酶靶基序。据信修饰的PKC被癌细胞表达的Bcr-Abl蛋白磷酸化，导致细胞生长受到抑制。修饰的PKC在一个实施方式中是人I3KC β II,其经修饰表达包含SEQ ID NO. 6序列的Abl酪氨酸激酶靶基序。修饰的HiC β II还可包含细胞转导域，例如HIV-TAT细胞转导域。在一个实施方式中，细胞转导域包含SEQ ID NO :7。本发明的方法特别适用于对诊断患有、怀疑患有、或有发生白血病风险的个体提供治疗益处。在一个实施方式中，所述白血病是CML。在另一个实施方式，白血病是急性淋巴细胞白血病(ALL)。本发明还包括一种含有修饰的蛋白激酶C(I3KC) β II的组合物，其中修饰的PCK β II包含Abl酪氨酸激酶靶基序。在一个实施方式中，Abl酪氨酸激酶靶基序包含SEQ ID NO :6的序列。和本发明的方法一致，所述组合物可包括含有细胞转导域的修饰I3KC β II。在一个实施方式中，细胞转导域包含SEQ ID NO :7。本发明还包括存在于癌细胞中的修饰的PKCii II，其具有组成型活化的Abl酪氨酸激酶活性，其中修饰的PKCi3 II在Abl酪氨酸激酶靶基序中存在的Tyr上磷酸化。附图简要说明图IA提供了 I3KC β II的示意图，显示假底物结构域中的Α25Υ突变。(Spitaler 和Cantrell，自然免疫学.2004)图IB提供了野生型I3KC bll和A25 O Y突变体的部分氨基酸序列。图 IB所示的序列为:WT (SEQ ID NO 1) ；A1_2(SEQ ID NO 2) ；A2-1 (SEQ ID NO: 3) ；A3-4(SEQ ID NO 5) ；A4-6(SEQ ID NO :5)。图2提供了共焦显微镜检分析，其中野生型(WT)或A25Y A1-2PKC β II-GFP克隆瞬时转染入Κ562 (Bcr-Abl+)或KGla (Bcr-Abl-)，24小时后不处理(培养基)或PMA处理 30分钟，用共焦显微镜观察GFP标记。图3提供的照片显示野生型和Α25Υ PKC β II-GFP蛋白在Κ562中表达的电泳分析。仅用6 卩、野生型冊(-0 11-6 卩、或突变的425￥构建物瞬时转染1(562细胞。用Amaxa 核转染进行转染，构建物转染效率为83-90%。在所示时间点，裂解细胞并用蛋白质印迹分析等量蛋白质的I3KC β II表达。图4提供的照片显示Α25Υ PKC β II-GFP克隆的酪氨酸磷酸化电泳分析。用GFP、 WT-PKC 0 11-6 或六25￥ PKC β II-GFP克隆转染Κ562细胞，M小时后用抗I3KC β II抗体免疫沉淀(IP)细胞提取物，然后用抗-磷酸-酪氨酸(上栏)免疫印迹(IB)，清除印迹并用抗HiC β II重新检测以确认等量上样(下栏)。图5提供了细胞扩增分析获得的数据图示。仅用GFP、野生型II-GFP、或突变的Α25Υ构建物转染Κ562细胞。将三百万个细胞平铺培养，7天后对活细胞进行计数。图6提供了小鼠中肿瘤生长分析获得的数据图示。用IOxlO6个Κ562细胞皮下接种N0D/SCID小鼠，在所示时间点监测肿瘤生长。图7提供了 Bcr-Abl+K562细胞中核转染的pTAT cDNA克隆的荧光显微镜检分析。 M小时后，单独在培养基中，或加入PCT激动剂PMAl小时后，通过荧光显微镜显像细胞。图8提供的照片显示了转化表达本发明重组蛋白的细菌(BL21)的细菌裂解物分析。在8%凝胶上分析未诱导(-)或IPTG诱导的(+)细胞的蛋白质，并进行蛋白质染色。 箭头指向预期大小的诱导蛋白。图9提供的照片显示转导入K652细胞(20小时)的含TAT-A25Y-PKC β II-GFP 的细菌蛋白裂解物的荧光镜检。图 10 的照片显示了 WT 和 A1-2PKCBII-GFP 克隆转染入 Κ562 (Bcr/Abl+)禾口 KGla(Bcr/Abl-)细胞M小时后的共焦显微镜图像。不处理(培养基)或PMA处理30分钟后显像细胞。图IlA和IlB提供了在WT和A25Y转染的K562细胞上进行的流式细胞仪分析获得的图像。对转染细胞进行计数，在标出的时间点收集，用膜联蛋白V-PE染色30分钟，然后用流式细胞仪测定GFP(A)和膜联蛋白V(B)的表达。在GFP+群上门控膜联蛋白V+细胞。图12提供的照片显示了 WT和用A1-2TAT-A25Y-PKCBII Amaxa转染并加入细菌裂解物的K562细胞的显微图像。纯化细菌裂解物中的TAT-A25Y蛋白，然后加到K562细胞上 20小时。中具有组成型活性，且据信是其原因。注意到正常(或野生型)PKC不是酪氨酸激酶底物，或不直接被酪氨酸激酶活化。 然而，我们在本发明中证明将Abl激酶靶基序工程改造成HiC β II分子能使得Bcr-Abl的催化活性交叉激活HiC β II信号途径，从而直接诱导PCK-介导的细胞反应(分化/生长阻滞/凋亡)。我们的结果表明，我们修饰的I3KC β II分子在Bcr-Abl+CML系Κ562中活化，但在 Bcr-AbFAML细胞系KGla中未活化。我们修饰的蛋白也经历了酪氨酸磷酸化，并抑制CML 母细胞数扩增。因此，预期本发明对治疗例如CML等对酪氨酸激酶抑制剂的抗性是(部分) 由于放大的信号的恶性肿瘤，或对于癌基因信号转导途径打开但封闭其并没有效果(即表皮细胞生长因子受体信号转导)的恶性肿瘤特别有用。另外，与信号转导抑制剂相反，本发明使用的策略利用了异常癌基因信号转导活化前药效应分子，从而促进从途径开端的低水平活化到大规模下游效应的级联效应。而且与激酶抑制剂相反，放大靶信号转导途径的抗性机制会确实增强重排信号传递分子的效力。最后，本发明的方法不依赖于靶信号传递途径对于恶性细胞的存活重要与否(与小分子抑制剂不同)，而仅在于其是否打开。我们还证明了当与细胞转导域融合时，使用含有Abl磷酸化位点的重组PKC蛋白能够进入细胞，从而支持蛋白质在治疗应用中的用途。在一个中，前药是蛋白激酶C (H(C)。人PKC的氨基酸序列是本领域熟知的。虽然预期任何PKC都适用于本发明，在一个实施方式中PKC是H(C βΙΙ同种型。SEQ ID NO :8提供了一种示范性野生型人I3KC β II同种型序列。根据本发明修饰野生型H(C，使其含有Abl激酶靶基序(Ala-X-X-Ile- Tyr -X-X-Phe/Pro (SEQ ID NO :6)。不希望受理论限制，据信修饰的PKC，例如修饰的人I3KC β II 能够利用例如人CML细胞中的Bcr-Abl催化活性以磷酸化，从而激活HiC β II信号转导途径，诱导细胞中PKC介导的细胞反应(其可诱导但不必需限于细胞的分化/生长阻滞/凋亡)。因此，本发明在一个实施方式中提供了一种抑制个体内CML细胞生长的方法，包括对个体施用修饰的I3KC β II蛋白，其中所述蛋白含有Abl酪氨酸激酶靶基序。在一个实施方式中，本发明提供了一种包含前药的组合物，其中前药是包含Abl 酪氨酸激酶靶基序的经修饰I3KC β II蛋白。还提供了编码修饰的HiC β II蛋白的多核苷酸。本领域技术人员应理解本发明的组合物不仅用于本发明方法描述中列出的治疗目的， 还用于研究癌细胞的代谢和其它特征，特别是表达Abl酪氨酸激酶的白血病细胞，其中该表达至少部分将癌细胞与其它非恶性细胞相区分。除了 Abl激酶靶基序，还对本发明提供的PKC进行了各种其它修饰。在一个实施方式中，本发明提供了作为重组蛋白质的前药，其中该蛋白含有蛋白转导域。转导域可以是增强蛋白质进入细胞的能力的结构域。在一个实施方式中，转导域是 HIV-TAT结构域。本领域技术人员将认识到“ΤΑΤ”代表“转录的反式激活蛋白”，HIV-TAT蛋白一般长86-101个氨基酸，视编码所讨论的特定TAT蛋白的HIV亚型而定。然而，TAT蛋白通常具有共同的细胞转导域，其具有序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO :7)。因此在一个实施方式中，本发明的修饰的蛋白质包含细胞转导域，其包含或由SEQ ID N0:7组成。可包含TAT 结构域的序列的非限制性例子如SEQ ID NO 15、16、17和18所示，其中TAT结构域存在于各序列的氨基酸位点39-50，但位点1-38的氨基酸也可包括TAT蛋白序列，或其它序列，例如用于分离和/或纯化蛋白质的序列。因此，本发明包括但不限于组合物和方法，其包括含有如SEQ ID NO: 15、16、17和18所述氨基酸序列的蛋白，条件是这些序列上1-38位的氨基酸序列包含与否是可任选的。例如，在每条序列的5-10位所示的HIS标签序列，例如His 是可任选的(对于整条氨基酸序列来说，可以在每条序列的1-38位的任意位置)。因此，本发明提供了组合物和方法，其涉及N-末端可从SEQ ID NO 15、16、17和18的39位开始的蛋白。本发明提供的蛋白质还可任选包含组成报告蛋白的氨基酸序列。许多编码报告蛋白的报告基因是本领域技术人员已知的，且适用于本发明。在一个实施方式中，本发明的蛋白质包含绿色荧光蛋白(GFP)序列。例如，在SEQ ID N0:15、16、17和18中，757位到C末端的氨基酸包含GFP序列。因此，其代表可存在或不存在于本发明提供的蛋白质中的任选氨基酸序列。因此，在各种实施方式中，本发明的蛋白质包含如SEQ ID N0:15、16、17和18 所示的氨基酸序列，条件是氨基酸1-38和757到C末端是任选的，且可存在或不存在于蛋白质中。因此，本发明的蛋白质可包含N端位于SEQ ID N0:15、16、17或18的39位氨基酸的氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列还可在所述序列中包含从SEQ ID N0:15、16、17或 18的39-756位的连续氨基酸。另外，这些蛋白质可包含N端从SEQ ID NO 15、16、17或18 的氨基酸1-39位开始并包含在其中的氨基酸序列或由其组成，这些蛋白的C-末端可以是所述蛋白的氨基酸756，或可包含由SEQ ID NO :15、16、17或18所示的完整氨基酸序列或由其组成。
应认识到，本发明如上所述的修饰的蛋白质还包含Abl激酶靶基
序(Ala-X-X-Ile-Tyr-X-X-Phe/Pro (SEQ ID NO :6)。在各种实施方式中，Abl 激酶靶基序可从I3KC β II蛋白的12位开始存在，如SEQ ID NO 10-13和14-18中所示，虽然本领域技术人员理解Abl激酶靶基序的位置可以在蛋白质中的其它位置，只要蛋白质仍然能够在被 Abl激酶磷酸化时活化。在各种实施方式中，Abl激酶靶基序可以是SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 5 之一。在一个实施方式中，本发明提供了修饰的PKCβ II，其中修饰的PKCβ II存在于白血病细胞，例如CML细胞中，其中修饰的PKC β II在Abl酪氨酸激酶靶基序中存在的一个酪氨酸上被磷酸化。在一个实施方式中，磷酸化Tyr是Abl酪氨酸激酶靶基序中的第5个氨基酸。可将前药与任何合适的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合，来制备包含前药的组合物。可在下列文献中找到一些适合与前药混合的组合物的例子 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (《雷明登药物科学与实践》)(2005)， 第 21 版，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia, PA.)Lippincott Williams & Wilkins0预期可用任何适合前药递送的可行方法将前药递送给需要治疗的个体，包括口月艮、胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下给药。本领域技术人员考虑本公开的益处，能够根据个体年龄、性别和大小以及疾病状态等因素来确定给予个体的修饰蛋白质的有效量。在一个实施方式中，将包含前药的组合物给予诊断为、怀疑患有、或有发生白血病风险的个体。在一个实施方式中，所述白血病是慢性髓细胞性白血病(CML)。前药的给药可与治疗活化Abl激酶相关疾病或病况的常规治疗联合使用。例如， 前药可在常规抗癌治疗之前、同时或之后给予。这些治疗包括但不限于化疗、手术干预和放疗。以下实施例意在说明而非限制本发明。实施例1本实施例说明了本发明的一个实施方式，其中CML细胞的生长通过对细胞施用前药而被抑制，该前药的形式是含有Abl激酶靶基序(Ala-X-X-Ile-Tyr-X-X-Phe/Pro)的遗传修饰I3KC β II，，其中CML特异性酶Bcr-Abl磷酸化I3KC β II前药，将其转化成活化药物形式，从而导致CML细胞生长受到PKC介导的抑制。Α25Υ PKC β II突变物的构建用拟磷酸化残基Glu取代Ala25得到组成型活化的 PKC0我们测试了 HiC β II的自身抑制假底物域中的Alf5变为Abl靶基序中的可磷酸化酪氨酸(Α25Υ)的突变是否能够在直接Bcr-Abl磷酸化后引入一个负电荷，导致假底物域从催化位点上脱离，从而活化I3KC 0 11(图1幻。该Bcr-Abl活化的PKCi3 II信号转导接着会引起细胞反应，可能包括母细胞分化/生长阻滞/凋亡。Kharfan-Dabaja，Μ. Α.， Ayala, Ε. , Guller, I. , Cejas, P. J. , Bahlis, N. J. , Kolonias, D. , Carlson, L. Μ.,禾口 Lee, K. P. , (Differentiation of acute and chronic myeloid leukemia into functional dendritic cells: a comparative analysis of different signaling mechanisms (((^1 和慢性髓细胞性白血病分化成功能性树突细胞不同信号转导机制的比较分析》).Cancer Immunol Immunother 2005，54(1)第 25-36 页；Lindner I，Kharfan-Dabaja MAiAyala E，Kolonias D, Carlson LM, Beazer-Barclay Y, Scherf U, Hnatyszyn JH, Lee KP, Induced dendritic cell differentiation of chronic myeloid leukemia blasts is associated with down-regulation of BCR-ABL(《慢性髓细胞性白血病母细胞诱导的树突细胞分化与 BCR-ABL 下调有关》)· J. Immunol 20038 月 15 日；171 (4) 1780-91 天然PKCβ II 核心假底物序别县 Arg-Pha-Ala-Arg-Lvs-Glv-Ala-Lvs-Arg-Gln
-Lys-Asn-Val (WT,图1Β;序列表示如图IB所示)。我们用寡核苷酸引物/PCR将下划线序列转化成下列Bcr-Abl靶基序(天然序列的改变以黑体显示，酪氨酸是磷酸化的残基)克隆 Al-2 (Ala-Arg-Lys- Ile-Tyr -Lys-Arg- Pro )，克隆 A2-I (Ala-Arg-Lys- Ile-Tyr -Lys-Arg- Phe (Phe 比 Pro 更类似其取代的 Gin))，克隆 A3-4 (Ala-Arg-Lys- Ile-Tyr -Lys-Arg- Thr (Thr 像其取代的 Gln —样是极性 / 不带电残基)) 和克隆A4-6 (Ala-Arg-Lys- Ser-Tyr -Lys-Arg- Phe (Ser 像其取代的 Gly —样是极性 / 不带电残基)。我们在I3KC- β II-GFP (PKC β II与GFP基因融合，但不影响其PKC活性)中制造了这些Α25 —Υ(Α25Υ)突变体。GFP标签能够呈现膜转位引起的酶活化，而且比蛋白质印迹确定的内源性酶大。在Bcr-Abl-阳性 CML 细胞系 Κ562 中选择性活化 Α25Υ PKC β II-GFP0 PKC β II 的活化导致酶从胞质易位到质膜上，这能够用GFP标签的共焦显微镜显影在野生型(WT)或 Α25Υ PKC β II-GFP突变体中追踪。这些构建物被核转染(Amaxa)入Bcr-Abl阳性的CML 细胞系Κ562或Bcr-Abl-阴性的AML细胞系KGla，转染子不处理(培养基)或用PMA处理。 如图2所示，亲本I3KC β II-GFP不在K562或KGla中易位，除非用PKC激动剂PMA刺激。这表明如果Bcr-Abl在未处理的Κ562中对I3KC β II有任何间接活化，其水平会太低以致不能用这种方法检测。相反，Α2-1Α25Υ PKC β II-GFP突变体在仅培养基的条件下在Κ562细胞中易位到质膜上，通过加入PMA进一步活化(表明突变的PKC仍然响应PKC活化刺激)。 然而，它在Bcr-Abl阴性的KGla细胞中不被激活，除非加入ΡΜΑ。通过共焦显影，我们发现了三种构建物在Κ562中被激活而KGla中未激活(两种很明显(克隆Al_2，Α-3-4)，一种强度较弱(Α2-1))，而第四种(Α4-6)似乎是组成型活化的。这些发现表明，3种Α25Υ PKC β II-GFP构建物能被Bcr-Abl活化。活化诱导H(C降解的证据我们检测了 HiC β II-GFP蛋白的活化是否导致其在单独培养基的转染Κ562中降解和损失，这是PKC家族的一个普遍特征。预期A25YPKC β II-GFP的持续Bcr-Abl活化能够使这些蛋白质相对WIPKC β II-GFP损失更迅速。应注意，Amaxa核转染Κ562细胞的转染效率对于所有构建物都一致较高(83-90% )。用蛋白质印迹评估野生型PKC β II-GFP和Α25Υ PKC β 11-GFP (比内源性PKC β II大)在Κ562 细胞中的随时间表达(图3)。转染后M小时WT PKC-β II-GFP与Α25Υ PKC β II-GFP突变体具有相等的蛋白质水平(见图4，底栏)。而且，在16小时的时间点，WT和突变Α25Υ PKCβ II转染子之间仍然有相似的GFP表达量(数据未显示)。然而，在第3日时，Α25Υ显著少于WT PKC^II-GFP。虽然随着时间WT PKC β II-GFP表达有些下降，但是A25Y PKC β II-GFP蛋白的表达损失更迅速——例如Α1-2第3日对第5日的表达相较于WT β II在第5日(与Α1-2在第3日的表达类似)对第7日的表达。这种差异效应使其不太可能是由于质粒的非特异性损失，因为Α25Υ PKC β II表达加速损失的两种非互斥可能性是PKC活化增加(由Bcr-Abl活化引起)和/或转染细胞的生长抑制/杀伤。
A25Y PKC β II-GFP突变体的酪氨酸磷酸化质膜易位和蛋白质表达的损失提示， Α25Υ PKC β II-GFP突变体在Κ562中活化，但没有显示是如何活化的。除了 Bcr-Abl介导的活化，形式上它们可能是组成型活化的(可能是由于任何假底物域的显著结构破坏所导致，例如我们对Α4-6构建体所怀疑的)，对于传统PKC 二级信使有较低的活化阈值，或者可以通过其它信号转导途径活化。如果Α25Υ PKC β II突变体是由Bcr-Abl活化的，工程改造的酪氨酸应被磷酸化。为了对此进行评估，用GFP、WT-PKCii II-GFP和克隆Al_2(共焦检测其在Κ562(在培养基中)清楚易位)以及A2-l(易位较差)转染了 Κ562细胞。对小时后，用抗I3KC β II抗体免疫沉淀细胞提取物，然后通过蛋白质印迹分析用磷酸-酪氨酸抗体评估磷酸化。如图4所示(顶部)，没有证据证明内源I3KC β II (例如在对照和GFP 转染泳道中)、WT PKCβ II-GFP(也表明GFP标签中的酪氨酸残基不被磷酸化)、或(有些出乎意料的)A2-1克隆中酪氨酸的磷酸化。A1-2克隆被明显酪氨酸磷酸化，由于该克隆与 WT PKC-β II-GFP的酪氨酸含量仅在工程改造的Abl靶基序中有所不同，可能是磷酸化的 Tyr25 0底部(图4)显示了所有3种PKC转染子中免疫沉淀类似量的H(C β II-GFP (18(^条带来自原始IP，用二抗在蛋白质印迹上标出)。A25Y PKC β II突变体的转染减少了 K562细胞的生长。为了评估Α25Υ PKC β II-GFP对细胞扩增的影响，将等量转染的Κ562铺在单独培养基中，7日后计数(图5)。 用WT PKC β II-GFP相较于仅用GFP转染的Κ562有一些对细胞扩增的抑制，而Α25Υ PKC β II-构建物的抑制显著更高。因此，该实施例证明癌细胞的生长抑制包括对细胞施用前药，其中前药是酶底物， 其中所述酶是癌细胞内源性的，其中相对于非癌细胞该酶由癌细胞完全表达，其中前药通过酶转化成药物，其中药物在前药转化成药物后抑制细胞生长。实施例2ΡΤΑΤ-Α25Υ PKC g II-GFP 构建物.该实施例显示了用于对细胞传递前药的pTAT-A25Y PKC β II-GFP构建物的开发。为了对细胞和在体内传递Α25Υ PKC β II-GFP蛋白，我们将cDNA构建物克隆入 pTAT-HA载体，其在A25Y PKC β II-GFP的N末端加入HIV TAT转导域(加上HA标签)。 已显示掺入的HIV TAT转导域能够让大蛋白容易地穿过细胞膜，并在体外和体内于细胞内扩散。该载体能够转化入细菌，通过添加IPTG诱导编码蛋白的生产。该构建物还在蛋白中引入了 6个组氨酸(His6)以在镍珠柱上纯化蛋白，以及HA标签以用蛋白质印迹分析该表位。用BioI消化pTAT载体，填充钝化3’克隆末端，用KpnI消化5’末端，用KpnI和NaeI 双消化A25Y PKC β II-EGFP cDNA插入物，连接入用KpnI消化并在BioI位点钝化的pTAT 载体。另外，将TAT-A25Y-PKC β II-GFP插入物亚克隆入真核表达载体pcDNA3，使我们能将构建物转染入细胞，并确定它是否在蛋白中加入TAT-HA元件的情况下仍然保持活性 (见下文)。TAT-A25Y PKC g II-GFP 的功能性评估由于在A25Y-PKC β II-GFP蛋白的N端添加TAT-HA结构域能够破坏与假底物域相邻的蛋白结构，可能该添加引起组成型活化的蛋白质，其不再需要PKC激动剂(在我们的试验中是PMA)或Bcr-Abl的活化。相反，这些修饰可以共同阻止活化。为了对此测试，我们将pcDNA3载体中的TAT-A25Y-PKC β II-GFP构建物转染入Bcr_Abl+CML细胞系K562。转染前 20-24小时，使K562细胞分裂至0. 5X106细胞/ml。以850rpm旋转沉淀hlO6细胞/样品 10分钟。然后将细胞重悬浮于100 μ 1 Amaxa试剂V+补充剂/样品，与5_10 μ gDNA混合。 然后用Amaxa方案T-16转染细胞，然后转移到含有2ml预热到37°C的培养基的6孔板中。 37°C孵育3-4小时后，每孔加入3ml培养基，继续保温小时。PKC β II酶从胞质易位到细胞质膜上表明酶被活化，我们的TAT-A25Y-PKC β II-GFP蛋白可根据荧光GFP标签用荧光显微镜确定亚细胞定位。如图7所示，与对照亲本PKCi3 II-GFP相比，在培养基条件下似乎没有TAT-PKCii II-GFP的组成型活化，表明加入TAT-HA不破坏调节性假底物域。两个TAT-A25Y-PKCβ II-GFP克隆(Α 1-2-2和 Α1-2-8)在Κ562 中显示一些活化， 据信是由于Bcr-Abl-介导的活化。对于所有构建物，用PKC激动剂PMA有显著活化，表示 TAT-PKC β II-GFP克隆仍然响应合适的活化信号。综上所述，这些数据表明加入TAT-HA结构域不影响原始I3KC β II-GFP构建物的表现。细菌合成的TAT-A25Y-PKC β II-GFP 蛋白为了合成用于给药的TAT-A25Y-PKC β II-GFP蛋白，将pTAT构建物转化到感受态 BL21(DES)细胞中，铺在LB琼脂糖+羧苄青霉素(carb)平板上，37°C过夜培养。每5ml培养物(LB+羧苄青霉素)接种一个BL21(DEQ转化细胞的单集落，37°C过夜培养。用过夜培养物接种50ml的LB+carb。细菌长到吸光度0. 6，然后用ImM的IPTG诱导，过夜37°C振荡培养。细胞分成15ml的等份，3500rpm离心15分钟沉淀。细胞沉淀_80°C冷冻或直接裂解。用3ml裂解缓冲液(加入lmg/ml的溶菌酶)裂解细菌沉淀，冰上保温30分钟。然后 10秒钟超声裂解物，在冰上放置10秒，进行共6轮。用Viva自旋柱(30，OOOMW截留值)离心蛋白，用PBS洗涤3次。然后在考马斯凝胶上分析蛋白裂解物图8T，显示了蛋白质的细菌合成。为了测定是否蛋白质能被转导入活细胞，将1. OxlO6个K562细胞铺在M孔板上的0.5ml 10%血清培养基中。在各孔中对于每个构建物加入约500 μ g总浓缩细菌诱导蛋白(此时未额外纯化)。然后细胞过夜37°C保温。然后用荧光显微镜检测GFP标签，测定细菌合成的TAT-A25Y-PKC β II-GFP蛋白的转导。如图9所示，这些蛋白能被转导入细胞， 即使粗裂解物不进一步纯化。这些数据表明我们能合成重组的TAT-A25Y-PKC β II-GFP蛋白，其保留亲本A25Y-PKC β II-GFP分子的特征，并能通过TAT转导传递给细胞。实施例3该实施例证明了突变的PKC β II在Bcr/Abl+K562而不是Bcr/Abl-KGla细胞中易位到质膜。活化后，PKCBII从胞质易位到质膜。为了确定HiC BII通过易位到质膜的活化状态，用 Amaxa 核转染 WT 和 A25Y PKCB11-GFP 突变体到 K562 (Bcr/Abl+)和 KGla (Bcr/Abl_) 中，然后用共焦显微镜在培养基中不处理，或用I3KCBII激动剂PMA处理30分钟后观察。如图10所示，WT PKCB11-GFP构建物在培养基处理的Bcr/Abl+，K562细胞中定位在胞质内； 而在加入PMA后酶易位，主要定位在质膜中。在Bcr/Abl-KGla细胞中观察到类似趋势，在加入PMA前WT HiCBII-GFP定位在胞质中，而仅在PMA处理后易位到质膜上。相反，发现 Al-2 A25YPKCBII-GFP突变体在培养基处理的K562细胞中主要位于质膜中，而加入PMA后进一步活化，表明A25Y PKCB11-GFP突变体仍然响应传统PKC刺激。然而在Bcr/Abl-KGla 细胞中，A1-2A25Y PKCBII-GFP突变体不在单独培养基中活化，而仅在加入PMA后易位到质膜上。对其它3种A25Y突变体(Α2-1、Α3-4、和A4-6)的分析揭示，虽然A2-1和A3-4也在 K562细胞中而不是KGla细胞中被活化，A4-6可能是组成型活化的，因为发现它在两种细胞中都定位在质膜上。这些数据提示至少三种A25Y突变体构建物以Bcr/Abl依赖性方式活化。实施例4该实施例显示A25Y PKCBII突变体的转染诱导凋亡，且减少K562细胞的生长。我们已证明PMA对I3KCBII的活化诱导细胞阻滞并提高K562细胞的凋亡。为了测定A25Y-PKCBII突变体的活化是否和内源HiCBII活化有相当的效果，将四种A25Y-PKCBII 突变体以及WT PKCB11-GFP核转染(Amaxa)入K562细胞，并分析其GFP表达的水平。 如图IlA所示，用WT-PKCBII稳定转染的GFP+K562细胞数随着实验过程而增加，而用 A25Y-PKCBII突变体构建物转染的GFP+K562细胞数在其细胞扩增中受到抑制。为了确定 A25Y-PKCBII的活化是否对凋亡诱导有任何影响，用WT和A25Y-PKCBII转染K562细胞，并用膜联蛋白V-PE抗体测定凋亡。在GFP+群上门控膜联蛋白V+细胞。如图IlB所示，全部 GFP+转染的细胞在转染后18- 小时显示凋亡水平上升，而A3-4转染的细胞显示凋亡水平最高。WT-PKCBII转染的细胞也在转染后18- 小时显示凋亡增加，该水平随着时间而稳定下降。相反，Α3-4、Α1-2和A4-6转染的细胞显示随着实验进程维持更高的凋亡水平。这些数据提示，在Bcr/Abl活化后，A25Y-PKCBII诱导细胞阻滞和凋亡，A3-4转染的细胞中有最大影响。实施例5该实施例证明了 TAT-A25Y-PKCBII蛋白在K562细胞中的有效产生和传递。为了测定在我们的A25Y-PKCBII突变体上加入HIV TAT蛋白转导域(PTD)是否能转导入细胞，将PTD序列加到A25Y突变体的5’端并克隆入大肠杆菌(E. coli)。然后将纯化的TAT-A25Y-PKCBII蛋白加到Bcr/Abl+K562细胞培养物中，20小时后用显微镜观察GFP 表达。如图12所示，Amaxa转染细胞和加入纯化TAT-PKCBII的细胞的GFP表达水平相等。 这些数据表明TAT-A25Y-PKCBII被Bcr/Abl+K562细胞摄入，而其可能以类似于Amaxa转染细胞的方式被活化。虽然通过具体实施例描述了上述发明，但本领域技术人员了解如何加以常规改变，这些改变应属于本发明范围。


提供了抑制癌细胞生长的组合物和方法。生长受到抑制的癌细胞由于t(9；22)(q34;q11)易位具有组成型活化的酪氨酸激酶活性，导致表达具有组成型活化的Abl酪氨酸激酶活性的嵌合Bcr-Abl蛋白，据信该蛋白在白血病生成中有重要作用。所述组合物包括修饰的蛋白激酶C(PKC)，其具有Abl酪氨酸激酶靶基序。所述方法涉及对个体施用修饰PCK以抑制具有Abl酪氨酸激酶活性的癌细胞生长。