专利名称：一种高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌及其应用的制作方法环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)是细胞内的第二信使，对糖代谢、脂肪代谢、核酸合成、蛋白质合成等发挥着重要的调节作用，具有多种生理功能，在临床上和畜禽业中有广泛应用。cAMP的生产方法有化学合成法、发酵法和酶法三种。 目前国内外产业化生产全部采用化学合成法，以AMP为原料，但生产成本偏高，并造成环境污染。利用液化短杆菌、小杆菌、棒状杆菌、节杆菌等以发酵法制备cAMP有一定的研究，但面临重复性差、产量不稳定等问题；直接采用腺苷酸环化酶酶催化生产cAMP虽然具有可行性，但存在许多限制，如腺苷酸环化酶含量低、纯化困难、稳定性差。全细胞催化能避免酶的分离和提纯等操作，易于大规模生产，且由于酶在天然的细胞环境中，可减少环境因素对酶的影响，有利于保持酶的稳定性；而大肠杆菌培养条件简单、周期短、背景清晰；因此，利用基因工程手段，克隆高活性的腺苷酸环化酶基因，构建高效表达腺苷酸环化酶的大肠杆菌工程菌株，以三磷酸腺苷(简称ATP)为原料全细胞催化生产cAMP，是一条简单、快速、高效的途径。此途径反应体系简单、条件温和、周期短、副产物少，而且清洁无污染，能实现cAMP生产过程的节能、降耗、减排，在低成本、高产率的前提下，同时也符合对环境友好的要求，具有良好的前景。
本发明所要解决的技术问题是提供一种高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌。本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—种高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No. 4706。该菌株已于2011年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。其中，所述的高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌是由来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)CGMCC No. 3584的腺苷酸环化酶基因构建到大肠杆菌中得到，所述的腺苷酸环化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌在生产环磷酸腺苷中的应用。具体来说，是将重组大肠杆菌利用全细胞催化法合成环磷酸腺苷。其中，所述的全细胞催化法为以重组大肠杆菌CGMCC No. 4706为催化剂，以ATP为前体物质，加入金属离子，利用表面活性剂增加细胞膜的通透性，全细胞催化生产cAMP。其中，所述的重组大肠杆菌CGMCC No. 4706的使用量为按湿菌体10_300g/L，优选310-50g/L。即对于总体积为IL的反应液，需加入10-300g湿菌体，优选加入10_50g湿菌体。其中，ATP的使用量为l-100g/L，优选5_50g/L。其中，所述的金属离子为镁离子、锰离子和亚铁离子中的一种或几种，优选镁离子。金属离子的使用量为终浓度2-100mM，优选5-100mM。其中，所述的表面活性剂为非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂或阴离子型表面活性剂；优选聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)或苯甲基磺酰氟(PMSF)。表面活性剂使用量为0. l_20g/L，优选0. Ι-lg/L，即表面活性剂处理生产菌株时，将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为IL的反应液，加入0. l_20g，优选加入0. 1-lg。其中，反应在pH7. 5-8. 5的Tris-HCl缓冲液中进行，25_45°C条件下反应2_24小时。优选在PH7. 5-8. 5的Tris-HCl缓冲液中进行，25_35°C条件下反应2_12小时。本发明针对大肠杆菌腺苷酸环化酶酶活低的缺陷，从环磷酸腺苷生产菌株中克隆高活性腺苷酸环化酶基因，构建大量表达腺苷酸环化酶的重组大肠杆菌菌株，并进行全细胞催化。由于腺苷酸环化酶能特异性催化ATP生成cAMP，转化率高，且副产物少。而大肠杆菌培养条件简单、周期短，可大大降低培养成本。采用全细胞催化可以省去酶的分离和提纯等操作，并能保持酶在原有生活细胞中所处的状态和特定位置，提高其稳定性。本发明的有益效果如下1.从cAMP生产菌株中克隆得到的腺苷酸环化酶基因，在重组菌全细胞催化过程中表现出良好的催化活性和稳定性，对底物ATP的转化率达到90%以上。2.本发明与酶催化相比，省去了酶的分离纯化步骤，操作简便，利于大规模生产；酶的稳定性更好；底物抑制减弱，产量更高。下游引物asAC 5，-CCGGAATTCTTAGTCCAGCACAAGCCCCT-3，PCR反应条件如下94°C变性5min ；按如下参数循环30次94°C变性lmin，53°C退火30s，72°C延伸 80s ；最后 72°C延伸 IOmin0凝胶电泳分离纯化约IlOObp的PCR产物，进行胶回收。将胶回收产物连接到 PMD18T-simple,构建 PMD18T_cya 重组质粒。采用 NdeI 和 EcoRI 双酶切 PMD18T_cya 重组质粒和几种不同的质粒(包括pET28a质粒、pET15b质粒、pET22b质粒等)，并连接酶切产物，获得相应的重组质粒。结果显示质粒pET28a明显优于其他质粒。采用该重组质粒pET28a-Cya转化不同的宿主(包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母等)，结果显示大肠杆菌明显优于其他宿主。采用该重组质粒pET28a-Cya转化大肠杆菌DH5a，挑取单菌落，接种到装有5mLLB 液体培养基的50mL离心管中，37°C，220rpm下培养8-12小时。将获得的重组质粒通过热击转化大肠杆菌Rosetta，具体操作如下取1 μ L重组质粒，加入到100 μ L大肠杆菌Rosetta 感受态细胞液中，冰上放置30min后，42°C热击90s，立即取出放冰上2min，加入900 μ LLB 液体培养基，37°C，220rpm下培养1小时后，取150 μ L培养液涂布含有氯霉素和卡拉霉素的 LB固体培养基，37°C培养12小时后所得的单菌落即为重组菌。进行诱导表达之后，经过筛选得到一株产酶量最高的菌株Rosetta (pET28a-Cya)， 其保藏编号为CGMCC No. 4706。实施例3 重组大肠杆菌的培养。挑取实施例2中筛选出的重组菌大肠杆菌Rosetta (pET28a-Cya)至含50mg/L卡拉霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37°C，200rpm培养过夜。按3% (ν/ν)接种量分别接种到至含乳糖的LB液体培养基中，组成(g. Γ1)如下2g葡萄糖，3g乳糖，10gNaCl，15g 蛋白胨，25g酵母膏。37°C，200rpm培养至3h。然后30°C，200rpm，诱导表达12h。8000rpm, 4°C离心lOmin，收集菌泥，_20°C保存备用。实施例4 利用重组大肠杆菌催化生成cAMP。取250mL 三角烧瓶，配制由 30g/L ATP、50mM MgCl2、30g/L 大肠杆菌 CGMCCNo. 4706 和 0. 25g/L Triton X-100 和 0. 05mol/L Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液组成的反应液 30mL，待 ATP完全溶解后，用氢氧化钠调节pH至8. 0，于35 °C，200rpm搅拌反应6h。反应结束后，用 3. 5%三氯乙酸沉淀。采用HPLC对cAMP进行定量分析，转化液中含有cAMP 15. 5g/L，转化率达到95. 1%。实施例5 利用重组大肠杆菌催化生成cAMP。取250mL三角烧瓶，配制总体积为50mL的如下反应液45g/L ATP、2OmMMgCl2、 50g/L 大肠杆菌 CGMCC No. 4706 和 lg/L Triton X-100 和 0. 05mol/L Tris-HCl (pH 8.2)， 待ATP完全溶解后，用氢氧化钠调节pH至8. 2，于25°C，200rpm搅拌反应。反应过程中每隔2h用氢氧化钠调节pH至8.2，反应持续121!。反应结束后，用3. 5%三氯乙酸沉淀。采用 HPLC对cAMP进行定量分析，转化液中含有cAMP 22. 8g/L，转化率达到93. 1 %。实施例6 利用重组大肠杆菌催化生成cAMP。取250mL三角烧瓶，配制总体积为20mL的如下反应液5g/L ATP、5mMMgCl2、10g/L 大肠杆菌 CGMCC No. 4706 和 0. lg/L PMSF 和 0. 05mol/L Tris-HCl (pH7. 5)，待 ATP 完全溶解后，用氢氧化钠调节pH至7. 5，于40°C，200rpm搅拌反应2h。反应结束后，用3. 5%三氯乙酸沉淀。采用HPLC对cAMP进行定量分析，转化液中含有cAMP 2. 6g/L，转化率达到95. 6%.实施例7 利用重组大肠杆菌催化生成cAMP。取250mL三角烧瓶，配制总体积为30mL的如下反应液25g/L ATP、IOOmMMgCl2、 40g/L大肠杆菌CGMCC No. 4706和 0. 5g/L Triton X-100和 0. 05mol/L Tris-HCl (pH 7.8)， 待ATP完全溶解后，用氢氧化钠调节pH至7. 8，于30°C，200rpm搅拌反应。反应4h后，添加25g/LATP，待ATP完全溶解后，用氢氧化钠调节pH至7. 8，于30°C，200rpm继续搅拌反应 6h。待总时长为IOh的反应完全结束后，用3. 5%三氯乙酸沉淀。采用HPLC对cAMP进行定量分析，转化液中含有cAMP24. 5g/L，转化率达到90. 1%。
本发明公开了一种高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.4706。本发明还公开了上述高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌在生产环磷酸腺苷中的应用。本发明从cAMP生产菌株中克隆得到的腺苷酸环化酶基因，在重组菌全细胞催化过程中表现出良好的催化活性和稳定性，对底物ATP的转化率达到90％以上，反应体系简单、条件温和、周期短、副产物少，而且清洁无污染，是一条简单、快速、高效的生产途径。