专利名称：新型水溶性Pt(Ⅱ)抗癌配合物及其制备方法 卡铂是继顺铂后的第二代铂抗癌药，它的化学名为cis-1，1-环丁烷二羧酸根·二氨合铂(II)。卡铂的结构中保留了抗癌的活性部分(NH3)2Pt2+，并引入亲水性的1，1-环丁烷二羧酸根作离去基团，溶解度大大改善，水溶性达到17mg/ml，比顺铂的溶解度(1mg/ml)高17倍，因此卡铂的毒性，特别是肾毒性和消化道副作用，明显低于顺铂，使卡铂成为目前全世界公认的最有效的抗癌药物之一，已被WHO列为世界基本药物，收入包括我国在内的世界上大部分国家的药典中，在临床治疗癌症中得到广泛的应用[李以欣译，癌症化学治疗的首选药物，.国外医药-合成药，生化药制剂分册，1998，19(2)89-101]。但是卡铂的抗癌活性仍不高，同时还存在较大的毒副作用如骨髓抑制等。因此设计和合成新型的铂类抗癌药物是目前抗癌药研究的热点[刘伟平，高文桂.治疗癌症的铂类金属配合物，药学进展，2001，25(1)27-31]。尽管近年来也推出了一些新的铂类抗癌药，如奈达铂(Nadaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、舒铂(Eptaplatin)，乐铂(Loplatin)，但它们的水溶性均低于卡铂，综合疗效也不如卡铂并且毒副作用比卡铂大[尤启冬，苟少华，抗肿瘤铂类配合物的研究进展，药物化学进展，2003，2161-187]，所以研制水溶性好、活性高、毒性低的铂类抗肿瘤配合物是铂类抗癌药物的发展方向之一[Ernest Wong，Christen M G，Current Status of Platinum-based AntitumorDrugs，Chem.Rev.，1999，992451-2466]。
通过对前人的研究结果的分析和总结以及对卡铂化学结构的深入认识，我们认为卡铂之所以有较好的临床疗效是因为卡铂具有阻断癌细胞DNA复制较理想的化学构造。为此，本发明以卡铂为先导化合物，通过对卡铂的离去基团1，1-环丁烷二羧酸根和载体基团进行化学修饰，设计和合成一类以3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸根为离去基团、以2-取代基-(4R，5R)-4，5-双(氨甲基)-1，3-二氧环戊烷为载体基团的新型抗癌铂(II)配合物，这类配合物水溶性好、抗癌活性高、毒副作用低，具有重大的开发应用前景。本发明的铂(II)配合物，化学名为cis-[2-取代基-(4R，5R)-4，5-双(氨甲基)-1，3-二氧环戊烷·3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸根·合铂(II)]，其化学结构如下 R＝CH3，C2H5，CH(CH3)2本发明铂化合物的制备方法是以K2PtCl4为起始原料，加入KI，转化成K2PtI4，与载体基团A2(A2＝2-取代基-(4R，5R)-4，5-双(氨甲基)-1，3-二氧环戊烷)反应，制备出相应的cis-[Pt(II)A2I2]中间体，再在水中与3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸银等摩尔定量反应，反应完全后过滤分离AgI，母液浓缩和冷冻干燥得到粗品；或cis-[Pt(II)A2I2]先与Ag2SO4在水中等摩尔定量反应，反应完全后过滤分离AgI，母液与等摩尔3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸钡定量反应，过滤分离BaSO4，母液浓缩和冷冻干燥得到粗品。粗品经水∶乙醇＝1∶1的体系中重结晶得到本发明的配合物纯品。本发明的制备方法具有产率高、产品纯、操作简单的特点，制备所涉及的化学反应为 本发明的化合物其特征在于它的溶解度大于卡铂、抗癌活性明显高于卡铂、毒副作用比卡铂小，可以用于临床治疗癌症。本发明的化合物可以制成两种常规的制剂—冻干粉和注射液在临床中使用。对于发明的配合物的抗癌作用将发明的配合物溶于水中，以卡铂作对照采用SRB方法测定不同浓度(μg/ml)的配合物对NCI-H460(人非小细胞肺癌细胞)，HT-29(人结肠癌细胞)Ls174t(人结肠癌细胞)增殖的抑制程度，计算抑制率，根据抑制率采用Logit方法计算IC50(μg/ml)，结果表明所发明的配合物LLC-0601的抗癌活性明显高于卡铂。各浓度下配合物对Ls-174t细胞生长的抑制率(％)
各浓度下配合物对H46O细胞生长的抑制率(％)

各浓度下配合物对HT29细胞生长的抑制率(％)

对于发明的配合物的急性毒性昆明种小鼠，体重20-22克，雌、雄各半，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司，许可证号SCXK(沪)2004-0005。LLC-0601用5％葡萄糖溶液配制。小鼠单次静脉注射不同剂量的LLC-0601。给药后观察死亡率及毒性情况，共观察14天，根据死亡率应用Bliss方法计算LD10，LD50，LD90。

试验测得所发明的配合物LLC-0601注射给药的LD50＝372.7mg/kg(95％的可信度305.2～454.9mg/kg)，相同的实验测得卡铂注射给药的LD50＝130mg/kg，因此LLC-0601急性毒性比卡铂明显低。
实施方式(1)3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸银的制备先按文献报道的方法[Inorganica Chimica Acta，2004，357，4452-4466]制备3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸(mp 151℃-152℃)。取3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸10g，溶于100ml的水中，用1mol/L NaOH调节PH＝6-7，加入130mmol、100mlAgNO3(过量5％)，得到3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸银沉淀，过滤收集，用水、乙醇洗涤后在60-70℃下真空干燥4小时，得到21.7g 3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸银，产率94.2％。
(2)cis-[Pt(II)A2I2]中间体的制备按文献报道的工艺路线[J.Med.Chem.，1994，37，1471-1485]合成载体基团A2[A2＝2-甲基-(4R，5R)-4，5-双(氨甲基)-1，3-二氧环戊烷；2-乙基-(4R，5R)-4，5-双(氨甲基)-1，3-二氧环戊烷；2-异丙基-(4R，5R)-4，5-双(氨甲基)-1，3-二氧环戊烷]。
称取5g K2PtCl4(12mmol)溶于50ml水中，过滤除去不溶物，在60℃下，缓慢加入含KI 12g(72mmol)的水溶液50ml，避光反应1小时后，滴加等摩尔的载体基团A2(12mmol)，得到黄色沉淀，过滤收集，用水、乙醇洗涤后在60-70℃下真空干燥4小时，分别得到cis-[Pt(II)A2I2]6.7g(R＝CH3)、7.1g(R＝C2H5)7.0g(R＝CH(CH3)2)，产率92-95％。
(3)cis-[2-异丙基-(4R，5R)-4，5-双(氨甲基)-1，3-二氧环戊烷·3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸根·合铂(II)](LLC-0601)的合成取5g的cis-[Pt(II)A2I2](R＝CH(CH3)2)，悬浮100ml水中，加入等摩尔量的1-环丁烷二羧酸银3g，在45℃下搅拌反应15小时，检查反应完全后过滤除去AgI沉淀，母液减压浓缩到20ml，冷冻干燥得白色晶体，在水∶乙醇＝1∶1的体系中重结晶提纯得到精品3.2克，产率76％，水溶性为40mg/ml(室温)。
特征结构参数为<1>元素分析C 31.7％，N 5.34％，H 4.61％，Pt 37.2％与理论值C 31.9％，N 5.31％，H 4.55％，Pt 37.0％一致。<2>FAB+-MS(m/e，RI)527(M+，100％)，368(M+-C6H6O5，20％)，368(A2+，60％)。<3>IR(cm-1，KBr压片)3225(s，vNH3)，2937(w，vCH2)，1623(ws vas(COO))，1392(s vs(COO))，1094(m，vC-OH)。这些参数符合所发明的配合物的化学结构。
(4)cis-[2-乙基-(4R，5R)-4，5-双(氨甲基)-1，3-二氧环戊烷·3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸根·合铂(II)](LLC-0602)的合成取3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸10g，溶于100ml的水中，用1mol/L NaOH调节PH＝6-7，加入65mmol、100ml BaCl2(过量5％)，得到3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸钡沉淀，过滤收集，用水、乙醇洗涤后在60-70℃下真空干燥4小时，得到16.9g 3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸钡，产率91.8％。
取5g的cis-[PtA2I2](R＝C2H5)，悬浮100ml水中，加入等摩尔量的硫酸银2.58g，在45℃下闭光搅拌反应8小时，检查反应完全后过滤除去AgI沉淀。在母液中再加入等摩尔量的3-羟基-1，1-环丁烷二羧酸钡2.44g，再在45℃下搅拌反应6小时，检查反应完全后过滤除去BaSO4沉淀，母液减压浓缩到15ml，冷冻干燥得白色晶体，在水∶乙醇＝1∶1的体系中重结晶提纯得到精品3.3克，产率80％，水溶性大于50mg/ml(室温)。
特征结构参数为<1>元素分析C 30.2％，N 5.41％，H 4.31％，Pt 37.8％与理论值C 30.4％，N 5.45％，H 4.29％，Pt 38.0％一致。<2>FAB+-MS(m/e，RI)514(M+，100％)，符合所发明的配合物的化学结构。


本发明涉及一种新型的水溶性铂(Ⅱ)抗癌配合物cis－[2－取代基－(4R，5R)－4，5－双(氨甲基)－l，3－二氧环戊烷·3－羟基－1，1－环丁烷二羧酸根·合铂(Ⅱ)]，取代基为甲基或乙基或异丙基。它的制备是以cis－[PtA