专利名称：一种防治恶性杂草水花生的菌株、菌剂及应用的制作方法水花生，学名空心莲子草(Alternantliera philoxeroidesGriseb)，又名喜旱莲子草，是苋科(Amaranthaecae)莲子草属(Alternamthera)多年生宿根草本植物。水花生于20世纪30年代末引种至我国，由于水花生生命力强，适应于水生和陆生环境，生长繁殖迅速，而且有人为的引种扩散，因此水花生在我国的的滋生蔓延速度很快，目前在我国以长江中下游为主的广大地区的分布非常广泛，成为该地区的主要恶性杂草，也是外来危险生物对我国入侵的重要代表性生物。水花生的营养生长非常旺盛，根系发达，地上部分繁茂，主要在农田(包括水田和旱田)、空地、鱼塘、沟渠、河道等环境中生长为害。水花生在农田中生长与作物争光、水、肥以及空间，造成作物减产和品质下降；在田埂和田间水花生成片生长还会影响农事操作；在鱼塘等水生环境中生长繁殖会影响沉水植物的光合作用，导致水中溶解氧含量降低；腐烂后污染水质，水体中生物耗氧量升高，使鱼虾等水产生物窒息；腐烂后水中有机质含量的增加会促使微生物的滋生，对水产生物产生毒害；水花生在鱼塘中的层积还会影响水产捕捞；在河道和沟渠中的生长会堵塞水道、限制水流、增加沉积，对水上运输和农田灌溉造成极为不利影响；水花生在路边、公用绿地、居民区等地生长蔓延，严重影响了环境的美观和卫生。因此分布广泛，危害严重的水花生已成为当前亟待研究和解决的问题。水花生的根系非常发达，根系属不定根系，不定根可进一步发育为肉质贮藏性根，即宿根。根直径1cm左右。茎长可达1m以上，茎杆呈蛛网状纵横交错。茎上生节，节能生根。水花生的花一般不能结实，而靠营养器官进行无性繁殖，夏季将1-2节无根无叶的茎杆泡入水中，3-4天后即可产生侧枝。春季温度适宜时，旱地肉质贮藏根上可生长10余个不定芽。水花生抗逆性强。当冬季温度降至0℃时，其水面或地上部分已冻死，但水中和地下的根茎仍保持活力，春季温度回升至10℃时，越冬的水下或地下根茎即可萌发；在贫瘠的土壤中经30天35℃以上的高温和伏旱能照常生长；机械翻耕后茎的切段在土中能继续生长繁殖；茎段曝晒1-2天仍能存活；未经腐熟或未被家畜消化的茎段进入农田后会造成再次侵染。水花生的环境适应能力很强，适应于水生和陆生的环境。旱生条件下叶片较水生条件下叶片的长宽度略小，厚度略厚，叶色较深，叶片与茎之间的夹角较小，叶片较挺立。旱生条件下水花生叶片角质层增厚，气孔下陷，栅栏组织分层且细胞排列紧密，水生条件下叶片角质层薄，栅栏组织仅有一层细胞且细胞较大，排列疏松。水花生靠地下(水下)根茎越冬，利用营养体进行无性繁殖，并且具有与环境条件相适应的生长发育特点和形态结构，这些是水花生能迅速生长蔓延的主要原因，同时也为水花生的防除增加了难度。由于水花生的严重危害，各国的科学家对水花生的防除进行了大量研究。目前的防除方法主要可以分成物理除草、化学除草和生物防治三种方法。物理方法由于费时费力，成本太高，效果不理想；60年代后，美国、澳大利亚等许多国家一直在探索水花生的化学防除技术，筛选出适合于不同环境、效果好、对目标作物安全的除草剂，如草甘瞵、敌草腈、百垄通、甲黄隆、施它隆等。但是目前的化学药剂只在短时间内对地上部分有效，无法除根，而且大量除草剂的使用对环境的污染非常严重，导致很多的经济和社会问题。生物防治的出现给人们提供了新的希望。目前的生物防治包括采用水花生的天敌昆虫和病原菌进行防除。迄今为止，主要用于水花生防除的天敌昆虫是曲纹叶甲，但是该昆虫只对地上部分有一定的效果，而且在我国广大地区不能越冬，因此效果非常有限；应用水花生的病原菌为水花生的生物防治提供了一个非常有潜力的防除途径。Barreto(1999)首次对巴西5个洲应用的两种新的水花生致病真菌莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)和莲子草尾孢菌(Cercospora alternantherae)进行报道，以巴西和澳大利亚两种生物型的水花生作为防治目标，结果表明莲子草假隔链格孢表现出较好的除草效果，是一种有潜力的生防真菌；向梅梅等分离到对水花生有抑制作用的莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)；万佐玺等人发现链隔孢菌(Alternaria alternata(Fr.)Keissler)的毒素对水花生有很强的致病作用。但是由于病原菌对水花生的防治效果受环境、剂型以及病原本身寄主范围等因素的影响，目前还没有由于水花生生物防治的成熟的商品化产品。筛选寄生专化性强、致病力强、耐储藏运输、对环境适应力强的水花生病原菌，对控制恶性杂草水花生的危害具有重要的意义，也具有极大的市场前景。
技术方案一种防治恶性杂草水花生的菌株，其特征在于菌株WNJ01，属于一种镰刀菌，Fusarium spp.，病原菌无小型分生孢子，大型分生孢子3-5分隔，孢子大小为43.2×5.16(μm)，末端圆或尖，具有明显的足胞；在PDA/PSA上菌落粉红色，生长速率为0.475cm/d；25℃、PH值为11的PSA培养基为其最适的生长条件。保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏日期2003/4/18，保藏号CGMCC No.0922；该菌株寄生专化性强、环境安全、对水花生地上地下部分都有较好防除效果。生防菌剂的制备将分离的镰刀菌菌株WNJ01转移到PDA平板上，在25℃、黑暗中培养5天后，沿菌落边缘切取1×1mm菌丝块20块，转移到PDA液体培养基中，于25℃、黑暗中振荡(80rpm)培养10天后，测定培养液中分生孢子的浓度，将孢子浓度调整到107个孢子/ml，与室温下保存备用。上述防治恶性杂草水花生生防菌剂的应用将菌剂稀释100倍，至105个孢子/ml，加入2％(v/v)吐温80，在傍晚湿度比较大时，将菌液按照每10m2施用300mL的用量喷洒到水花生上。
有益效果本发明所提供的一种防治恶性杂草水花生的菌株、菌剂及其用法，与现有技术相比，具有如下优点和积极效果1、本发明中分离得到的镰刀菌菌株具有寄生专化性强、环境安全、对水花生地上地下部分都有较好防除效果的特点。
2、使用本发明中分离得到的镰刀菌为基础制备的水花生真菌除草剂对水花生的防治，约3-10天后，水花生植株地上部分完全腐烂，地下部分也腐烂，对农田环境恶性杂草水花生防除效果达到95％以上。
目前对恶性杂草水花生的防治主要方法是化学除草剂化学农药使它隆、苄黄隆、甲黄隆等；物理防除主要采用人工打捞的方法；以虫治草利用天敌昆虫曲纹叶甲；以上方法中化学除草有大量的农药残留，对生态环境污染严重，而且只能防除水花生的地上部分，而水花生防除中最大的问题就是地下部分生长量大，对环境污染严重；物理防除需要大量的人力和物理，效率很低，而且也不能除掉地下部分；用于以虫治草的曲纹叶甲也只能取食水花生的叶片，而且在我国广大地区，该昆虫无法越冬，并没有应用价值；而本发明中分离得到的镰刀菌为基础制备的水花生真菌除草剂对水花生的防治具有速度快、高度专化、环境安全、无污染，而且可以杀死水花生危害最严重的地下部分。因此与现有的防治方法相比，本研究所获得的除草剂具有更为广阔的应用前景。
3、对环境安全生防菌对不同植物具有生物安全性。试验证明对其他植物材料分别为小麦、水稻、棉花、黄瓜、萝卜、小青菜、马唐、牛筋草均具有生物安全性。图4。


图1生防菌株的产孢细胞；图2生防菌株的足细胞；图3不同浓度生防菌对水花生的致死效果(施用3天后)图4生防菌对不同植物的生物安全性，AII为水花生，其他植物材料分别为小麦、水稻、棉花、黄瓜、萝卜、小青菜、马唐、牛筋草
病原菌的分离从自然发病的水花生植株茎基部，采用70％(质量比，下文同)酒精进行表面消毒后，从病健交界处切取2mm×2mm的水花生组织，置于PDA培养基上，在25℃、黑暗中培养2天后，从组织边缘有真菌菌丝长出，按照柯赫氏法则，将纯培养的菌丝体重新回接到健康的水花生上，确定该分离物就是水花生的病原菌。经室内培养鉴定，本研究所分离的病原菌为一种镰刀菌，Fusarium spp.，(图1，图2)命名为WNJ01，保藏地址中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)CGMCC，保藏日期2003/4/18，保藏号CGMCC No.0922；该菌株寄生专化性强、环境安全、对水花生地上地下部分都有较好防除效果；生防菌剂的制备将分离的镰刀菌菌株WNJ01转移到PDA平板上，在25℃、黑暗中培养5天后，沿菌落边缘切取1×1mm菌丝块20块，转移到PDA液体培养基中，于25℃、黑暗中振荡(80rpm)培养10天后，测定培养液中分生孢子的浓度，将孢子浓度调整到107个孢子/ml，与室温下保存备用。
施用方法将以上菌剂稀释100倍，至105个孢子/ml，加入2％吐温-80溶液，在傍晚湿度比较大时，将菌液按照每10m2施用300mL的用量喷洒到水花生上，约3天后，水花生植株地上部分完全腐烂，7天后，地下根部完全腐烂。图3。
实施例1 陆地水花生的防除水花生的生存环境包括陆地和水域两种环境。将本发明所提供的菌剂稀释100倍，至105个孢子/ml，加入2％吐温80，在傍晚湿度比较大时，将菌液按照每10m2施用300mL的用量喷洒到水花生上，1天后，水花生嫩叶上出现明显的褐色坏死斑，约5天后，水花生植株地上部分完全腐烂，10天后，地下根部完全腐烂，对农田环境恶性杂草水花生防除效果达到95％以上。
实例2 水域河道中水花生的防除将本发明所提供的菌剂稀释100倍，至105个孢子/ml，加入2％吐温80，在傍晚或清晨，按照每10m2施用300mL的用量喷洒到水花生上，1天后，水花生嫩叶上出现明显的褐色坏死斑，约4天后，水花生植株地上部分完全腐烂，约10天后，水中根部完全腐烂，对农田环境恶性杂草水花生防除效果达到95％以上。
实施例3 幼苗期水花生的防除由于成株期水花生的生物量非常大，防除后容易造成水体富营养化，因此在幼苗期进行防除对环境保护更有利。在春天，4月份，水花生出苗后30天内，株高10cm左右的水花生植株，将本专利所提供的菌剂稀释100倍，至105个孢子/ml，加入2％吐温80，在傍晚，按照每10m2施用300mL的用量喷洒到水花生上，1天后，水花生嫩叶上出现明显的褐色坏死斑，约3天后，水花生植株地上部分完全腐烂，约7天后，地下部分也腐烂，对农田环境恶性杂草水花生防除效果达到95％以上。
实施例4 环境安全性试验将本生防菌分别接种不同农作物和其他植物，5天后观察该菌剂对不同植物的生物安全性，结果是，接种5天后，除了水花生被完全杀死外，其他植物材料小麦、水稻、棉花、黄瓜、萝卜、小青菜、马唐、牛筋草等均不被本菌剂侵染。图4。


本发明是一株水花生生物防治菌株、菌剂及应用，它属于生物防治领域，专用于水花生的安全高效防除。菌株WNJ01，属于一种镰刀菌，Fusarium spp.，保藏号CGMCCNo.0922；该菌株具有寄生专化性强、环境安全、对水花生地上地下部分都有较好防除效果的特点；菌剂对所测试的作物均不致病。在农药污染严重的今天是一种很好的替代品。可进行喷雾使用，使用真菌孢子浓度为105个孢子/ml。使用5－10天杀死靶标恶性杂草水花生95％以上。图1为不同浓度水花生生防菌剂对水花生的防除效果。