专利名称：一株不动杆菌菌株及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用的制作方法玉米赤霉烯酮(zearalenone，ΖΕΑ, ZEN)是一种具有二羟基苯甲酸内酯结构的雌激素类真菌毒素，由玉米赤霉菌、禾谷镰刀菌、三线镰刀菌等菌产生，主要污染小麦、大麦、 燕麦、玉米等农作物。全世界每年约有25%的农作物粮食被霉菌毒素污染，我国食品和饲料工业平均每年因霉变所致损失总产量10%以上。从全国仓库和饲料厂中抽样检测，发现玉米等农作物和饲料中ZEN的检出率高达100%，检出浓度超标严重。^N会引起种猪或家禽早熟，生殖周期紊乱，给种猪等养殖业带来巨大的损失。而且，人摄入被ZEN污染的农、畜产品可引发多种中毒症、中枢神经受损，甚至死亡。因此，防止农作物和饲料的霉变与霉变后脱毒处理是食品储藏和食品加工过程中不可或缺的环节。目前对于霉变的处理，国内没有理想的脱毒剂。粮食厂、饲料厂等每年至少需购买2亿元进口霉菌吸附类解毒剂，但这类解毒剂并不能真正将毒素降解成无毒物，而且^N 残留时间长、难处理，已引起国内外科研工作者的极大关注。FAO和世界卫生组织已将解决 ZEN问题作为全世界的当务之急，各国对粮食中ZEN含量有严格限量标准，因此，研究具有自主知识产权、经济有效、不破坏农作物和饲料原有营养成分的ZEN脱毒技术具有重要深远的意义，符合国民经济和社会发展的趋势。生物降解是利用自然界存在的微生物分解物质，对环境不会造成负面影响。 目前报道的具有ZEN降解能力的菌株，包括有Fusarium oxysporum(Michihiko K， Makoto S, Chigusa S, et al. Lactonering-cleaving enzyme :Genetic analysis, novel RNA editing, and evolutionary imp lications. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1988,95 :12787-12792. ) > Agrobactgerium tumefaciens (Michihiko K, Junichi N, et al.Purification and characterization of a novel lactonohydrolase from agrobacteriumtumefaciens. Biosci. Biotechnol. Biochem. ,2000,64(6) 1255-1262.)、 Clonostachyssp. (Hideaki K, Naoko T A, Makoto K, et al. Biotransformation of the mycotoxin, zearalenone, to a non-estrogenic compound by a fubgal strain of clonostachys sp.Biosci.Biotechnol. Biochem. ,2002,66(12) :2723-2726.)、 Gliocladium roseum(Jan U, Petr K. Role of zearalenone lactonase in ρ rotection of gliocladium roseum from fungitoxic effects of the mycotoxin zearalenone. Applied and Environmental Microbiology,2007,73 (2) :637-642.)、 Eubacterium BBSH 797(Binder Μ. E, Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology,2007,133 :149-166)、 Trichosporon mycotoxinivorans(Orsolya Molnar, Gerd Schatzmayr, Elisabeth Fuchs, et al. Trichosporon mycotoxinivorans sp.nov., A new yeast species usefulin biological detoxification of various mycotoxins. Systematic and Applied Microbiology, 2004, 27 (6) :661-671.)等，但是它们降解速率很低，功能不强。而且，对已发现微生物代谢物进行分析后，发现大部分菌都是将^N转化成α或β型的^N或玉米赤霉烯醇，这些产物的雌激素毒性与ZEN相似或更甚，这种降解不能称为真正的脱毒。因此， 发掘可以高效、安全降解玉米赤霉烯酮的功能菌株具有重要意义。
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株不动杆菌菌株 Acinetobacter sp. SM04，该菌株能够高效、彻底地降解玉米赤霉烯酮。本发明的另一目的在于提供上述菌株在降解玉米赤霉烯酮中的应用。 本发明的目的通过下述技术方案实现一株不动杆菌菌株，良Acinetobacter sp. SM04,该菌株已于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No. 55M。Acinetobacter sp. SM04是从广东种植有玉米或小麦的耕种层土壤中分离、纯化得到的，其理化性质如下1、菌体的形态特性a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察dci/^to如ctersp. SM04菌株为革兰氏阴性菌，短杆状，菌体大小为(1-1. 5) X (1. 5-2. 5)Mm，无芽孢。
b.在LB固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，光滑不透明，呈现淡乳色，菌落直径约为1.5-2.0毫米。
2,Acinetobactersp. SM04 主要的理化特性
Acinetobacter sp. SM04的适宜生长温度为20_40°C、pH范围6_9，好氧生长，氧化酶阳性，过氧化物酶阳性。
？Acinetobacter sp. SM04 主要的遗传特征
%Acinetobacter sp. SM04 的 16S rRNA 测序，BLAST 比对发现，Acinetobacter sp. SM04的16S rRNA基因序列与力acter sp.已有菌株具有较高的相似性，其中与不动杆菌属的序列相似性为99. 5%。
综合以上的生理生化特性、16S rRNA序列比对结果，本发明的力acter sp. SM04应归属不动杆菌属，命名为力acier sp. SM04。 Acinetobacter sp. SM04可应用于降解玉米赤霉烯酮。 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果
本发明的li/^iohcter sp. SM04对真菌毒素ZEN有较强的降解能力，可在36个小时内将98%以上的玉米赤霉烯酮降解成低雌激素活性产物，不生成玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇等高雌激素活性类似物，具有真正的脱毒能力。可以将该菌应用于玉米谷物、玉米酒精残渣或其他真菌毒素污染饲料的处理，使其成为安全的食物和动物饲料，从而为谷物和饲料的绿色加工处理提供一种低成本、高效率不发生二次污染的玉米赤霉烯酮降解菌。




图1是Acinetobacter sp. SM04降解ZEN产物的雌激素活性检测结果图。

(1)菌体的形态特性a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，Acinetobacter sp. SM04菌株为革兰氏阴性菌，短杆状，菌体大小为(1-1. 5) X (1. 5-2. 5) μ m，无芽孢。b.在LB固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，光滑不透明，呈现淡乳色，菌落直径1.5-2. O毫米。(2) Acinetobacter sp. SM04 主要的理化特性菌株Acinetobacter sp. SM04的适应生长温度为20_40°C、pH值6-9，好氧生长， 氧化酶阳性，过氧化物酶阳性。(3) Acinetobacter sp. SM04 主要的遗传特征具体操作方法参考分子克隆实验指南(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。本发明的Acinetobacter sp. SM04分子分类地位采用DNA小量提取方法提取Acinetobacter sp. SM04细菌总DNA，采用 16SrDNA通用引物对来扩增菌株的16SrDNA基因序列，通用引物对的序列分别为 (27F) 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和(1495 5，-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3，。将 PCR 产物直接测序，其序列如SEQ ID NO. 1所示，将获得的16S rRNA基因序列输入GenBank，通过 BLAST程序对数据库中所有序列进行比较分析，结果发现本发明Acinetobacter sp. SM04 的16S rRNA基因序列与Acinetobacter sp.已有菌株具有较高的相似性，其中与不动杆菌属的序列相似性为99. 5%。综合以上的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明的AcinetcAacter sp. SM04应归属不动杆菌属，命名为Acinetobacter sp. SM04。实施例2Acinetobacter sp. SMO4 对 ZEN 的降解试验(1)配制含^N 25mg/L的降解实验培养基将定量的^N甲醇储备液加入灭菌的塑料离心管中，在N2蒸发仪下除去甲醇后，加入灭菌后的Ml培养基，使ZEN终浓度为25mg/ L0(2)将实施例1的Acinetobacter sp. SM04纯菌划Ml板培养，然后从固体Ml平板上挑取单菌落接种到30mL降解实验培养基中，在30°C的水浴摇床中培养(200r/min)。培养1 后，用等体积的甲醇超声萃取培养物中残留的^N，离心上清液采用HPLC-PAD来定量分析^N的残留量，实验做三个平行样品，以未接种的降解实验培养基作为对照样。(3) Acinetobacter sp. SM04降解^N的测定从三个平行样品中分别取3mL经过 24h上述培养的培养液，用等体积的甲醇超声萃取lOmin，甲醇萃取物在12000Xg下离心 5min，取30 μ L上清液用HPLC检测超声萃取培养物中残留的ZEN含量。高效液相色谱(HPLC)检测^N的条件色谱柱采用Waters XTerraEMS C18柱 6Χ150_，5μπι)。流动相为乙腈水甲醇=46 46 8。柱温30°C，流量为Iml/
min。结果采用荧光检测器，激发波长274nm，发射波长450nm。采用外标法定量^N的浓度,可得 Mh 后 Acinetobacter sp. SM04 培养液中 ZEN 的浓度分别为 13. 85mg/L, 14. 02mg/ L，14. 37mg/L，平均值为14. 08mg/L。培养24h后的培养液的颜色也有略微差异，由透明无色变为淡黄色，而对照样没有明显变化。
实施例3Acinetobacter sp. SMO4 对 ZEN 的降解试验本实施例的步骤、方法和材料均同实施例2，所不同的是步骤(2)中的培养时间为 24h。试验结果24h后Acinetobacter sp. SM04培养液中^N的浓度分别为4. 82mg/ L，4. 97mg/L, 5. 26mg/L,平均值为5. 02mg/Lo培养24h后的培养液的颜色进一步呈现较明显的差异，由淡黄色变为深黄色，而对照样没有明显变化。实施例4Acinetobacter sp. SMO4 对 ZEN 的降解试验本实施例的步骤、方法和材料均同实施例2，所不同的是步骤(2)中的培养时间为 36h。试验结果3 !后Acinetobacter sp. SM04培养液中^N的浓度分别为0. 33mg/L, 0. 23mg/L, 0. 19mg/L,平均值为0. 25mg/L。培养7 后的培养液的颜色呈现为红褐色，而对照样没有明显变化。实施例2-4经多次重复试验证明数据重现性良好，本发明的AcinetcAacter sp. SM04对真菌毒素ZEN有较强的降解能力，可在36个小时内将98%以上的玉米赤霉烯酮降解。实施例5Acinetobacter sp. SM04降解^N产物的雌激素活性检测采用MCF-7细胞增殖测试实验测试Acinetobacter sp. SM04降解ZEN产物的雌激素活性效应的损失。^N是一种类雌激素，对胞内雌激素受体具有很高的亲和力，能加快雌激素受体阳性癌细胞的增殖。体外MTT细胞增殖测试(雌激素受体阳性的MCF-7人乳腺癌细胞)被认为是评估ZEN及其代谢物雌激素毒性最有效的方法之一。MCF-7人乳腺癌细胞购买自中国科学院细胞库。具体操作步骤见文献Cetin Y. ,Bullerman L. B. Cytotoxicity of Fusarium mycotoxins to mammalian cell cultures as determined by the MTT bioassay[J]. Food and Chemical Toxicology, 2005,43 :755_764。将0. 40mL 实施例 2 中 Acinetobacter sp. SM04 降解 ^N 的培养上清液、0. IOmL 0. 25mol/LTris-HCl (pH8. 5)缓冲液和 20 μ L 0. 5mol/L H2O2 溶液混合均勻，添加 10 μ L ZEN 甲醇储备液(lmg/mL)，置于40°C恒温水浴温育12h，添加0. 5mL甲醇中止反应。上述混合物被使用来进行MCF-7细胞增殖率测试。用不添加^N的处理组和ZEN溶液(10 μ L lmg/mL 的 ZEN 甲醇储备液用 0. HmL 0. 25mol/LTris-HCl (ρΗ8· 5)缓冲液和 20 μ L 0. 5mol/L H2O2 溶液混合均勻)作对照。结果见图1，Acinetobacter sp. SM04培养液降解ZEN 1 后的产物对MCF-7细胞增殖的百分增加量为3. 2士 1. 4%，不添加^N的处理组混合物对MCF-7细胞增殖的百分增加量为1. 2士0. 7%，均未表现出对MCF-7细胞增殖作用，而对照样中等量的ZEN对MCF-7 细胞增殖的百分增加量高达86士0. 8%。证明Acinetobacter sp. SM04可将^N降解为低雌激素代谢产物。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。


本发明公开了一株不动杆菌菌株及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。本发明的不动杆菌菌株是Acinetobacter sp.SM04，已于2011年12月5日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.5524。本发明的Acinetobacter sp.SM04对真菌毒素ZEN有较强的降解能力，可在36个小时内将98％以上的玉米赤霉烯酮降解成低雌激素活性产物，不生成玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇等高雌激素活性类似物，具有真正的脱毒能力。可以将该菌应用于玉米谷物、玉米酒精残渣或其他真菌毒素污染饲料的处理，使其成为安全的食物和动物饲料，从而为谷物和饲料的绿色加工处理提供一种低成本、高效率不发生二次污染的玉米赤霉烯酮降解菌。