水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用制作方法_李俊林专利（离子通道,OsAK,整流）-早鸽网

水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用制作方法

专利名称

水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用制作方法
发明者

李俊林, 李虹颖, 苏彦华, 高南
公开日

2012年6月13日
申请日期

2011年11月29日
优先权日

2011年11月29日
申请人

中国科学院南京土壤研究所
文档编号

C12N15/79GK102492028SQ201110387618
关键字

离子通道 OsAK 整流双向水稻
权利要求

1.一种水稻双向整流型钾离子通道0SAKT2/3分子，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示2.编码权利要求1所述水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子的基因3.编码权利要求1所述水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子的基因，其特征在于序列如SEQ ID No. 1所示4.含权利要求2所述水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子基因的真核表达载体5.根据权利要求4所述的真核表达载体，其特征在于所述真核表达载体为将水稻0sAKT2/3构建到pCI或pTracer-CMV3载体，所得到的重组质粒pCI_0sAKT2/3或 pTracer-CMV3-0sAKT2/36.权利要求1所述水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子在控制植物双向整流和提高钾营养利用方面的应用7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物为番茄8.控制植物双向整流和提高钾营养利用的方法，其特征在于该方法包括将权利要求3 所述水稻钾离子通道0sAKT2/3分子基因导入植物中表达的步骤
技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3 分子及应用技术背景钾是植物细胞中最主要的渗透物质，它一方面控制细胞的体积和膨压，对细胞/ 组织的伸长和韧性有重要的调控作用，与作物体内水分的保持和抗旱性密切相关；另一方面，K+控制细胞的膜电位，对作物吸收和运输营养离子具有非常重要的影响(印莉萍等， 2006)在植株内部，由Siaker类型的钾离子通道所介导的高通量K+流动，是实现膜电位快速调控的基础拟南芥的Siaker类型通道家族由9类成员组成KAT1、KAT2、AKTU AKT5、 AKT6、AKT2/3、AtKCl、SKOR和GORK，分为内向整流型、双向整流型和外向整流型(V6ry and Sentenac,2003 ；Szczerba et al.，2009)到目前为止，AKT2/3 是 Shaker 类型通道中唯一的既主导K+内流又允许在去极化情况下K+的渗漏性外流的通道，其电生理特征表现为弱向整流、能够感应K+水平并受钙离子和质子调控其独有的渗漏型电流，是该类通道与众不同的特征，可能在生理上代表了在过量K+迅速吸收进入细胞而导致膜电位去极化情况下，通过胞内K+的渗漏从而实现对膜电位的精确微调作用，进而增加钾的体内循环利用水稻是一年生禾本科作物，世界上近一半的人口以稻米为食水稻缺钾症状表现为老叶叶尖及前端叶缘褐变或焦枯，同时出现褐色斑点；植株伸长受抑制而萎缩；叶色加深，呈暗绿色且无光泽；根系细弱，多褐根，老化早衰；抽穗不整齐，秕谷率增加，正常受精的谷粒也不饱满，产量和品质下降除了合理施肥外，从水稻本身的钾营养分子基础研究入手，增加作物吸收钾和体内循环利用的效率从水稻基因组的数据分析，水稻存在已知的所有类型的植物钾离子通道，至少有 11个编码aiaker型家族的钾离子通道的基因水稻的Siaker型钾离子通道目前有4个结果=OsAKTl是电压依赖的内向整流钾离子通道，对盐胁迫敏感(Golldack et al.，2003 ； Fuchs et al. ,2005) ；OsKATl能增加水稻细胞钾的含量，增加对盐胁迫的抗性(Obata et al.，2007 ；李等，2011)如果能克隆到水稻中既主导K+内流又允许K+的渗漏性外流的双向整流型钾离子通道并验证其功能，进而筛选出可以利用的基因资源，为进一步通过转基因等技术应用于农作物来提高其对钾的有效利用能力奠定基础发明内容解决的技术问题本发明的目的是提供一种水稻钾双向整流型离子通道 0sAKT2/3分子，通过其提高植物对钾的有效利用能力本发明的另一目的是提供上述水稻钾双向整流型离子通道0sAKT2/3分子在控制植物双向整流和提高钾营养利用方面的应用技术方案一种水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示3编码上述水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子的基因编码上述水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子的基因，序列如SEQ ID No. 1 所示含上述水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子基因的真核表达载体真核表达载体，所述真核表达载体为将水稻0sAKT2/3构建到pCI或pTraCer-CMV3 载体，所得的到重组质粒 pCI-0sAKT2/3 或 PiTracer-CMVS-OsAKTZ/^本发明提供了所述水稻双向整流型钾离子通道0sAKT2/3分子在控制植物中既主导K+内流又允许K+的渗漏性外流的双向整流方面的应用从而，本发明也提供了一种控制植物双向整流的方法，所述方法将所述水稻双向整流型钾离子通道0SAKT2/3分子基因导入植物中并表达的步骤有益效果本发明首先从粳稻(Oryza sativa L)中克隆得到了 0sAKT2/3基因，验证了该水稻0sAKT2/3基因具有高效转运K+的功能，还有双向整流型的特性通过0sAKT2/3 可转运钾的能力，获得了其它barker型家族基因不可比拟的既主导K+内流又允许K+的渗漏性外流的双向整流特征并成功利用这一基因，提高植物对钾的有效利用能力

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说明书
法律状态

专利名称：水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用的制作方法图1水稻0sAKT2/3基因克隆；其中图IA :lanel、2为水稻总RNA ；图IB :M为 Maker, lane 1 为 0sAKT2/3 的 PCR 结果；图 IC :M 为 Maker，lane 1 为 TA_0sAKT2/3 的 PCR 鉴定结果；图2水稻0sAKT2/3基因表达的组织特异性和对环境的响应；其中图2A :0sAKT2/3 基因在水稻地上部和根部的分布；图3B 地上部0sAKT2/3基因对钾离子浓度变化的响应；图2C 地上部0sAKT2/3基因对PEG和ABA的响应；图 3 重组质粒 pCI-0sAKT2/3 和 pTracer-CMV3_0sAKT2/3 的酶切和 PCR 鉴定。其中图 3A :M 为 Maker，lane 1 为 pCI_0sAKT2/3 的 Smal/NotI 双酶切结果；图 3B :M 为 Maker，Ianel 为 pCI_0sAKT2/3 的 PCR 鉴定结果；图 3C :M 为 Maker, lane 1 为 pTracer-CMV3_0sAKT2/3 的 KpnI 酶切结果；图 3D :M 为 Maker，lane 1 为 pTracer-CMV3-0sAKT2/3 的 PCR 鉴定结果；图4水稻0sAKT2/3钾离子转运活性验证；其中图4A 注射0sAKT2/3或注射水时蛙卵转运钾离子特征电流曲线；图4B 注射0sAKT2/3或注射水时蛙卵转运钾离子的电流与膜电位的关系曲线；图5水稻0sAKT2/3对细胞外钾离子浓度的依赖性；其中图5A 水稻0sAKT2/3转运不同浓度钾离子特征电流曲线；图5B 水稻0sAKT2/3转运不同浓度钾离子的电流与膜电位的关系曲线。实施例1 水稻0sAKT2/3基因的克隆
提取水培生长15天的水稻叶(Oryza sativa L)的总RNA (图1A)并以其为模板，以Oligo (dT) 18为引物反转录，得到反转录产物CDNA。以此CDNA为模板，以特异引物F2N 和R2进行PCR扩增。
上游引物 F2NHindIII CCAAGCTTATGGATGTGGCGTCGACTATCC(加入 HindIII 酶切位点，for pTracer-CMV3)
上游引物 F2NSmaI GGCCCGGGATGAAGACCTCGAGCTTC (加入 SmaI 酶切位点，for pCI)
下游引物R2 TCCGCGGCCGCCTATGATCCAGACACCGAGTCCA (加入 NotI 酶切位点)
基因全长PCR反应体系

水稻钾双向整流型离子通道OsAKT2/3分子及应用，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。编码上述水稻双向整流型钾离子通道OsAKT2/3分子的基因，序列如SEQIDNo.1所示。本发明首先从粳稻(OryzasativaL)中克隆得到了OsAKT2/3基因，验证了该水稻OsAKT2/3基因具有高效转运K+的功能，还有双向整流型的特性。通过OsAKT2/3可转运钾的能力，获得了其它Sharker型家族基因不可比拟的既主导K+内流又允许K+的渗漏性外流的双向整流特征。并成功利用这一基因，提高植物对钾的有效利用能力。

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