专利名称：用于治疗内毒素血症的乳酸菌和双歧杆菌的制作方法内毒素血症被定义为在体内存在升高水平的脂多糖(也称为内毒素)。脂多糖 (LPS)，也称为脂聚糖，为由至少一个脂基团和至少一个多糖基团通过共价键连接而构成的大分子。LPS存在于革兰氏阴性菌的外膜中，在动物中起内毒素的作用并引发强免疫应答。Cani等，Diabetes，2007，56，1761-1772描述了在饲喂高脂肪膳食的小鼠中增加内毒素血症的诱导。作者发现血浆LPS浓度在全天内变化，对于饲喂正常膳食的小鼠在黑暗饲喂周期结束时增加至最大，而高脂肪膳食引起的内毒素血症在全天内都高。作者将术语“代谢性内毒素血症”定义为由高脂肪膳食诱导的血浆脂多糖(LPQ浓度从基线水平慢性的、2至3倍的增加，且注意所达到的内毒素血症水平比在败血性休克期间获得的内毒素血症水平低10-50倍。细菌位移(bacterial translocation)被定义为活力细菌从肠道穿过上皮粘膜进入机体。细菌可以经由肠系膜淋巴结进入淋巴系统并由此可在全身循环。细菌还能够进入血液循环(菌血症)并还可以位于组织中。细菌位移可在许多医学条件下发生，所述医学条件包括肠道细菌过度生长，肠道损伤和休克。任何伴随有增加的肠道通透性的医学条件都可能潜在地导致细菌位移。由于LPS来源于肠道中的细菌，因此细菌从肠道进入机体的位移可潜在作为内毒素血症(包括代谢性内毒素血症)的可能机理。如果革兰氏阴性菌位移至机体中，则它们作为LPS源。然而，目前还不知道在代谢性内毒素血症中LPS进入机体中的确切路线。细菌位移被认为是一种可能的解释，但来自肠道的游离LPS也可以在正常脂质吸收过程中进入机体。还可能是几种机理同时发生。Schiffrin 等，Br. J. Nutr.，2009，101，961-966 描述了在具有小肠细菌过度生长 (SIBO)的成年患者中使用益生菌酸奶补充剂。评估了肠道定殖、肠道通透性、内毒素位移和先天免疫功能改变的效果。然而，在本文中描述的患者中的内毒素血症为败血性休克内毒素血症，其由病原体(如病原性细菌)感染而导致，且在所述败血性休克内毒素血症中， 如在上述提及的“Cani等”的文章中所描述的，血浆LPS水平由正常水平提高许多倍。这不同于代谢性内毒素血症，如上所述，代谢性内毒素血症通常由膳食(尤其是高脂肪膳食)引起，其中血浆LPS水平的增加(表示为正常水平的倍数)是很低的。
一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备用于治疗哺乳动物代谢性内毒素血症(metabolic endotoxemia)的食品、膳食补充剂 (dietary supplement)或药物中的用途。另一方面，本发明提供选自以下种的细菌在制备用于治疗哺乳动物内毒素血症的食品、膳食补充剂或药物中的用途嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus ρ Iant arum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animal is)、乳双歧杆菌 (Bifidobacterium lactis)、或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)或它们的任何混合物。另一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备用于抑制哺乳动物细菌位移的食品、膳食补充剂或药物中的用途。再一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备用于治疗哺乳动物中由革兰氏阴性菌引起的感染、革兰氏阴性菌过度生长、或肠道和/或粘膜革兰氏阴性菌不平衡(尤其是胃肠道中)的食品、膳食补充剂或药物中的用途。又一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备用于治疗哺乳动物革兰氏阴性菌位移的食品、膳食补充剂或药物中的用途。又一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备用于减少革兰氏阴性菌或病原性细菌对哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着的食品、膳食补充剂或药物中的用途。又一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备通过减少革兰氏阴性菌或病原性细菌对哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着而治疗所述哺乳动物的内毒素血症的食品、膳食补充剂或药物中的用途。又一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备用于减少含脂多糖细菌对哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着的食品、膳食补充剂或药物中的用途。又一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备通过减少含脂多糖细菌对哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着而治疗所述哺乳动物的内毒素血症的食品、膳食补充剂或药物中的用途。另一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备用于调节哺乳动物中脂质吸收的食品、膳食补充剂或药物中的用途。又一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备通过在调节哺乳动物中脂质吸收而治疗所述哺乳动物内毒素血症的食品、膳食补充剂或药物中的用途。又一方面，本发明提供选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌在制备用于治疗哺乳动物菌血症的食品、膳食补充剂或药物中的用途。再一方面，本发明提供以下组合在制备用于治疗哺乳动物内毒素血症的食品、膳食补充剂或药物中的用途(a)乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物；和(b)益生元。又一方面，本发明提供用于治疗哺乳动物代谢性内毒素血症的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供用于治疗哺乳动物内毒素血症的选自嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌、或两歧双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供用于抑制哺乳动物细菌位移的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。再一方面，本发明提供用于治疗哺乳动物中由革兰氏阴性菌引起的感染、革兰氏阴性菌过度生长或肠道和/或粘膜革兰氏阴性菌不平衡(尤其是胃肠道中)的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供用于治疗哺乳动物革兰氏阴性菌位移的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。再一方面，本发明提供用于减少革兰氏阴性菌或病原性细菌对哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供用于通过减少革兰氏阴性菌或病原性细菌对哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着而治疗所述哺乳动物的内毒素血症的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供用于减少含脂多糖细菌对哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供用于通过减少含脂多糖细菌对哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着而治疗所述哺乳动物的内毒素血症的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。另一方面，本发明提供用于调节动物中脂质吸收的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。再一方面，本发明提供用于通过调节哺乳动物中脂质吸收而治疗所述哺乳动物内毒素血症的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供用于治疗哺乳动物菌血症的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供用于治疗哺乳动物内毒素血症的以下组合(a)乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物；和(b)益生元。再一方面，本发明提供一种治疗具有相应需要的哺乳动物中的代谢性内毒素血症的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供一种治疗具有相应需要的哺乳动物中的内毒素血症的方法，该方法包括施用有效量的选自嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌或两歧双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供一种抑制具有相应需要的哺乳动物中的细菌位移的方法， 该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。再一方面，本发明提供一种治疗具有相应需要的哺乳动物中由革兰氏阴性菌引起的感染、革兰氏阴性菌过度生长或肠道和/或粘膜革兰氏阴性菌不平衡(尤其是胃肠道中) 的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供一种治疗具有相应需要的哺乳动物中的革兰氏阴性菌位移的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供一种减少具有相应需要的哺乳动物中革兰氏阴性菌或病原性细菌对胃肠道粘膜增加的附着的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供一种通过减少革兰氏阴性菌或病原性细菌对具有相应需要的哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着而治疗所述哺乳动物的内毒素血症的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。再一方面，本发明提供一种减少具有相应需要的哺乳动物中含脂多糖细菌对胃肠道粘膜增加的附着的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供一种通过减少具有相应需要的哺乳动物中含脂多糖细菌对所述哺乳动物胃肠道粘膜增加的附着而治疗内毒素血症的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。另一方面，本发明提供一种调节具有相应需要的哺乳动物中的脂质吸收的方法， 该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。又一方面，本发明提供一种通过调节具有相应需要的哺乳动物中的脂质吸收而治疗所述哺乳动物的内毒素血症的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。再一方面，本发明提供一种治疗具有相应需要的哺乳动物的菌血症的方法，该方法包括施用有效量的选自乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌。图1显示了施用正常膳食(NC)、高脂肪膳食(HFD)或补充有本发明细菌的高脂肪膳食的小鼠的血浆LPS(内毒素血症)水平，所述本发明细菌即嗜酸乳杆菌菌株 NCFM(NCFM)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animal is subsp. lactis)菌株 420 (B420)或两者的组合(NCFM+B420)。图2显示了在施用正常膳食、高脂肪膳食或补充有本发明细菌(NCFM、B420或 NCFM+B420)的高脂肪膳食的小鼠中的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌的平均组织水平(检出限之上水平)。图3显示了在施用正常饲料、高脂肪膳食或补充有本发明细菌(NCFM、B420或 NCFM+B420)的高脂肪膳食的小鼠中的肠球菌属(Enterococcus)细菌的平均组织水平(检出限之上水平)。图4显示了在施用正常膳食、高脂肪膳食或补充有本发明细菌(NCFM、B420或 NCFM+B420)的高脂肪膳食的小鼠中的乳杆菌属(Lactobacillus)细菌的平均组织水平(检出限之上水平)。图5显示了在施用正常膳食、高脂肪膳食或补充有本发明细菌(NCFM、B420或 NCFM+B420)的高脂肪膳食的小鼠中的拟杆菌纲(Bacteroidetes)细菌的平均组织水平(检出限之上水平)。图6显示了在施用正常膳食、高脂肪膳食或补充有本发明细菌(NCFM、B420或 NCFM+B420)的高脂肪膳食的小鼠中的总细菌域(Total Domain Bacterium)的平均组织水平(检出限之上水平)。
图7显示了在施用高脂肪膳食并用载体处理或施用补充有本发明细菌(B420)的高脂肪膳食的小鼠的肠腔粘膜中或肠腔不同区段中大肠杆菌(E.coli)的水平。图8显示了施用高脂肪膳食并用载体处理或施用补充有本发明细菌(B420)(单独或与益生元组合)的高脂肪膳食对小鼠盲肠粘膜中大肠杆菌(Escherichia coli)的附着的影响。图9显示了施用高脂肪膳食并用载体处理或者施用补充有本发明细菌(B420)(单独或与益生元组合)的高脂肪膳食对大肠杆菌位移至小鼠的宿主组织中的影响。图10显示了施用高脂肪膳食并用载体处理或者施用补充有本发明细菌(B420) (单独或与益生元组合)的高脂肪膳食对小鼠空腹胰岛素水平和进食状态下胰岛素分泌的影响。

#双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、青 双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和角形双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)，以及它们的任何组合物。优选地，用于本发明的细菌选自乳杆菌属或双歧杆菌属以及它们的混合物。更优选，用于本发明的细菌选自以下种嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、动物双歧杆菌、 乳双歧杆菌或两歧双歧杆菌，以及它们的混合物。尤其优选嗜酸乳杆菌种的细菌和动物双歧杆菌种的细菌的组合。在特别优选的实施方式中，用于本发明的细菌为嗜酸乳杆菌菌株NCFM。嗜酸乳杆菌菌株NCFM可从Danisco A/S以名称HOWARU Dophilus商购获得。在另一特别优选的实施方式中，用于本发明的细菌为动物双歧杆菌乳亚种菌株 420 (B420)。该菌株可从Danisco A/S商购获得。在另一特别优选的实施方式中，用于本发明的细菌为唾液乳杆菌菌株33(Ls_33)。 该菌株可从Danisco A/S商购获得。在一种实施方式中，用于本发明的细菌为益生菌。在本说明书中，术语“益生菌”被定义为涵盖以合适量施用时赋予宿主健康益处的任何非病原性细菌。这些益生菌株通常具有经过上消化道而存活的能力。它们是非病原性、非毒性，并且一方面通过与消化道内的常居菌群的生态学相互作用和另一方面通过“GALT”(肠道淋巴组织)以积极方式影响免疫系统的能力而对健康施以有益作用。根据益生菌的定义，当以足够量施用时，这些细菌具有通过肠道继续存活的能力，然而，它们不能通过肠道屏障，因此其首效是在胃肠道的腔和/或壁中得以诱导。然后，它们在施用期间形成常居菌群的一部分。该定殖(或短暂定殖)使得益生菌施以有益作用，例如遏制存在于菌群中的潜在病原性微生物和与肠道免疫系统相互作用。
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在优选的实施方式中，用于本发明的所述细菌是益生性乳酸菌和/或益生性双歧杆菌。在一些实施方式中，用于本发明的双歧杆菌与乳杆菌属细菌一起使用。根据本发明，双歧杆菌和乳杆菌组合在某些应用中表现有协同效应(即，大于细菌分别使用时的累加作用的效应)。例如，所述组合除作为单一组分对于哺乳动物具有作用之外，还对于组合中的其他组分具有有益作用，例如通过产生之后被组合中的其他组分用作能量源的代谢物，或维持有助于其他组分的生理条件。通常，用于所述组合的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、开菲尔乳杆菌、双歧乳杆菌、短乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、弯曲乳杆菌、保加利亚乳杆菌、沙克乳杆菌、罗伊乳杆菌、发酵乳杆菌、香肠乳杆菌、乳酸乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌和詹氏乳杆菌，以及它们的任何组合。在优选的实施方式中，用于本发明的乳杆菌细菌为益生性乳杆菌。优选地，用于本发明的乳杆菌细菌是嗜酸乳杆菌种。在一种特别优选的实施方式中，用于本发明的细菌包括动物双歧杆菌乳亚种菌株 420 (B420)和嗜酸乳杆菌菌株NCFM的组合。剂量用于本发明的乳酸菌和/或双歧杆菌(例如乳杆菌属的菌株；例如嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和/或植物乳杆菌的菌株，如嗜酸乳杆菌或唾液乳杆菌的菌株，例如嗜酸乳杆菌菌株NCFM或唾液乳杆菌菌株33，和/或双歧杆菌属的菌株，例如动物双歧杆菌乳亚种菌株， 如动物双歧杆菌乳亚种菌株420(B420))，可以包含IO6-IO12CFU的细菌/克支持体，和更具体地IO8-IO12CFU的细菌/克支持体，对于冻干的形式优选IO9-IO12CFU/克。合适地，用于本发明的乳酸菌和/或双歧杆菌(例如乳杆菌属的菌株；例如嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和/或植物乳杆菌的菌株，如嗜酸乳杆菌或唾液乳杆菌的菌株，例如嗜酸乳杆菌菌株NCFM或唾液乳杆菌菌株33，和/或双歧杆菌属的菌株，例如动物双歧杆菌乳亚种菌株，如动物双歧杆菌乳亚种菌株420 (B420))，可以以约IO6至约IO12CFU微生物/剂，优选约IO8至约IO12CFU微生物/剂来施用。术语“每剂”是指每天或每次摄取(优选每天) 所提供给受试者的所述微生物量。例如，如果在食品中(例如在酸奶中)施用微生物——则酸奶将优选地包含约IO8至约IO12CFU的微生物。然而，可选地，所述微生物量可以分为多次施用，每次施用由较小量的微生物荷载组成，只要受试者在任意特定时间(例如每个M小时的时间段)内所接受的微生物总量是约IO6至约IO12CFU的微生物，优选IO8至约IO12CFU 的微生物。根据本发明，微生物的至少一种菌株的有效量可以是至少IO6CFU微生物/剂，优选约IO6至约IO12CFU微生物/剂，优选约IO8至约IO12CFU微生物/齐IJ。在一种实施方式中，优选地，用于本发明的乳酸菌和/或双歧杆菌(例如乳杆菌属的菌株；例如嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和/或植物乳杆菌的菌株，如嗜酸乳杆菌或唾液乳杆菌的菌株，例如嗜酸乳杆菌菌株NCFM或唾液乳杆菌菌株33，和/或双歧杆菌属的菌株，例如动物双歧杆菌乳亚种菌株，如动物双歧杆菌乳亚种菌株420Φ420))，可以以约IO6至约 IO12CFU微生物/天，优选约IO8至约IO12CFU微生物/天的剂量施用。因此，该实施方式中的有效量可以是约IO6至约IO12CFU微生物/天，优选约IO8至约IO12CFU微生物/天。CFU代表“菌落形成单位”。“支持体”指食品、膳食补充剂或可药用支持体。受试者/医学适应症本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌被施用于哺乳动物，包括例如牲畜(包括牛、马、猪、鸡和羊)和人。在本发明的一些方面中，所述哺乳动物是陪伴动物(companion animal)(包括宠物)，例如狗或猫。在本发明的一些方面中，合适地，所述受试者可以是人。发明人惊讶地发现本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌能够降低血浆脂多糖 (LPS)水平。此发现赋予细菌可用于治疗内毒素血症尤其是代谢性内毒素血症的潜能。LPS为革兰氏阴性菌的主要细胞壁组分，其在肠道中以革兰氏阴性微生物群的组分形式但也以游离LPS的形式存在。代谢性内毒素血症的减轻可以由以下产生减少革兰氏阴性菌位移至宿主、减少宿主对于游离LPS的吸收或增强宿主对LPS的清除。在本说明书中，单独使用时的术语“内毒素血症”表示当与基础脂多糖水平相比时体内(特别地，但非排除性地，血浆中)存在升高水平的脂多糖(也称为内毒素)。单独使用时的术语“内毒素血症”意欲包括代谢性内毒素血症(在下文详细定义)和其它病因的内毒素血症，如由病原性感染(尤其是细菌感染)引起的内毒素血症或由小肠细菌过度生长(SIBO)引起的内毒素血症。在一些实施方式中，将本发明涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌用于治疗代谢性内毒素血症。一方面，术语“代谢性内毒素血症”表示由高脂肪膳食诱导的内毒素血症(如以上所定义的)。术语“高脂肪膳食”在下文中更详细地定义。一方面，术语“代谢性内毒素血症”表示与基础(正常)哺乳动物脂多糖水平相比哺乳动物体内(特别地，但非排除性地，血浆中)的脂多糖水平增加了 1.5至20、优选2 至10、如2至4、优选2至3. 5范围内的倍数。脂多糖水平的增加通常由鲎变形细胞测定法 (Limulus amaebocyte assay)(本领域技术人员公知的测试)来检测。相比之下，在由病原性感染(如细菌感染(败血性休克内毒素血症))引起的内毒素血症的情况下，与基础(正常)哺乳动物脂多糖水平相比，哺乳动物(尤其是人)体内 (特别地，但非排除性地，血液中)的LPS水平通常以大于20的倍数增加，如大于30倍，优选大于50倍，如大于70倍，如大于100倍，如大于150倍，如大于200倍。人类中脂多糖的基础水平通常在每毫升1-2内毒素单位(EU)的范围内，如由通过鲎变形细胞测定法所测定，其实例是使用Kinetic-QCL试验(Bio ffhittaker, Cambrex Bioscience)的鲎变形细胞提取物测定法(Limulus amaebocyte extract assay)。因此，另一方面，术语“代谢性内毒素血症”表示由鲎变形细胞提取物测定法测定的体内(特别地，但非排除性地，血浆中)的脂多糖水平在1.5至40，优选2至20，如2至 8，优选2至7内毒素单位(EU)/ml的范围内。相比之下，在由病原性感染(如细菌感染(败血性休克内毒素血症))引起的内毒素血症的情况下，如通过鲎变形细胞提取物测定法所测定的，哺乳动物(尤其是人)体内 (特别地，但非排除性地，血液中)的LPS水平通常大于40EU/ml，如大于60EU/ml，优选大于 100EU/ml，如大于 140EU/ml，如大于 200EU/ml，如大于 300EU/ml，如大于 400EU/ml。本发明人惊讶地发现本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌能够在代谢非常重要的组织、肠系膜脂肪组织(mesenteric adipose tissue)、皮下脂肪组织(subcutaneousadipose tissue)、肠系膜神经节(mesenteric ganglion)禾口皮下神经节(subcutaneous ganglion)、以及肝和脾中降低细菌的水平。这赋予本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌可用于防止或治疗细菌位移至组织以及防止或治疗代谢性内毒素血症的潜能。在特别优选的实施方式中，可将本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌用于降低肠系膜脂肪组织中的肠杆菌科以及肝组织中的拟杆菌纲的细菌水平。这两个主要的细菌群含有LPS作为细菌细胞壁的成分，因此充当升高的血浆LPS (其伴随代谢性内毒素血症)的潜在来源。这些组织在代谢性内毒素血症和其它代谢疾病中起非常重要的作用，由于LPS 在这些组织中引起炎症，可能导致不良事件(包括糖代谢异常和胰岛素敏感性降低)的级联。发明人还惊讶地发现本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌能够调节脂质吸收。不希望被理论所束缚，认为由于LPS主要由脂质运载，因此调节脂质吸收可减少细菌的量并由此减少通过肠屏障的LPS量。这赋予本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌可用于防止 LPS进入组织并由此防止或治疗代谢性内毒素血症的潜能。另外，本发明人惊讶地发现本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌能够减少胃肠道中增加的革兰氏阴性菌附着。不希望被理论所束缚，认为减少革兰氏阴性菌附着可减少细菌的量并由此减少通过肠屏障的LPS量。这赋予本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌可用于防止LPS进入组织并由此防止或治疗代谢性内毒素血症的潜能。本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌适于施用于患糖尿病和肥胖的哺乳动物。 它们还可适用于患糖尿病而无肥胖的哺乳动物，以及有患糖尿病危险因素但还没有处于患糖尿病状态的肥胖哺乳动物。这一点在下文中详细讨论。在优选的实施方式中，待治疗或预防的病症为膳食诱导和/或膳食相关的。如本文所详细描述的，本发明人已惊讶地发现能够将乳酸菌和/或双歧杆菌用于本发明来治疗多种膳食诱导和/或膳食相关的病症。特别地，使用本发明的乳酸菌和/或双歧杆菌适于治疗摄入高脂肪膳食的哺乳动物。这一点在下文中详细讨论。所述组合物适用于肥胖和糖尿病患者。在本说明书中，术语“糖尿病，，包括所有形式的糖尿病，如上所述，其特征为由于胰岛素激素水平不足而导致的代谢紊乱和异常高血糖(血糖过高)。该术语由此包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病以及糖耐量异常。1 型糖尿病特征在于胰腺中缺少产生胰岛素的胰岛(islets of Langerhans)的β细胞，导致胰岛素缺乏陷。2型糖尿病特征在于胰岛素抵抗或胰岛素的敏感性降低，以及胰岛素分泌降低。妊娠糖尿病形式上被定义为“在妊娠过程中发病或首次识别的任何程度的葡萄糖不耐受”。糖耐量异常(IGT)是与胰岛素抵抗和心血管疾病危险增加有关的血糖代谢障碍的糖尿病前期状态。根据世界卫生组织和美国糖尿病学会的标准，糖耐量异常被定义为关于 75-g 口服葡萄糖耐量试验140-199mg/dL的两小时葡萄糖水平(7. 8至11. Ommol)。当患者 2小时后具有立即升高的葡萄糖水平，但低于2型糖尿病标准时，则被认为处于IGT状态。 空腹血糖可为正常或轻度升高。在2型糖尿病之前IGT可以存在许多年。IGT还是死亡的危险因素。在本说明书中，术语“肥胖”与体重指数(BMI)相关。体重指数(BMI)(用以千克为单位的体重除以以米为单位的身高的平方来计算)是最普遍接受的用于超重和/或肥胖的量度。认为BMI超过25是超重。将肥胖定义为具有30或更高的BMI，将具有35或更高的BMI认为是严重同病性(comorbidity)肥胖，并将具有40或更高的BMI认为是病态肥胖。如上所述，本文所使用的术语“肥胖”包括肥胖、同病性肥胖和病态肥胖。因此，本文所使用的术语“肥胖”可以定义为受试者具有大于或等于30的BMI。在一些实施方式中， 合适地，肥胖受试者可具有大于或等于30、合适地35、合适地40的BMI。本发明的组合物特别适用于同时患有糖尿病和肥胖的患者，同时，本发明的组合物还适于患有糖尿病但无肥胖的患者。其还适用于具有糖尿病危险因素、但尚未处于糖尿病状态的肥胖患者，可以预期，肥胖的人(但非糖尿病)能够限制其肥胖的代谢后果，即，发生糖尿病或至少胰岛素抵抗。在本文中，术语“治疗(treatment或treating)是指根据本发明对于乳酸菌和/ 或双歧杆菌的任何施用，包括(1)预防动物发生特定疾病，所述动物可以易患该疾病，但尚未经历或表现该疾病的病理或症状，包括预防与该疾病相关的一种或多种危险因素；O) 抑制动物的疾病，所述动物正经历或表现该疾病的病理或症状，即，遏制所述病理和/或症状的进一步发展；或C3)缓解动物的疾病，所述动物正经历或表现该疾病的病理或症状， 艮口，逆转所述病理和/或症状。膳食如上所述，根据本发明使用细菌治疗的糖尿病和/或肥胖哺乳动物可持续摄取高脂肪膳食，同时减轻其病症的代谢性后果。在本说明书中，术语“高脂肪膳食”是指通常含有至少20%、优选至少25%、例如至少30%、例如至少35%、例如至少40%、例如至少45%、 例如至少50%、例如至少55%、例如至少60%、例如至少65%、例如至少70%、例如至少 75%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%的来自脂肪的卡路里。在一些实施方式中，根据本发明使用细菌治疗的糖尿病和/或肥胖哺乳动物可摄取高碳水化合物膳食，同时减轻其病症的代谢性后果。在本说明书中，术语“高碳水化合物膳食”是指通常含有至少50%、例如至少55%、例如至少60%、例如至少65%、例如至少 70 %、例如至少75 %、例如至少80 %、例如至少85 %、例如至少90 %的来自碳水化合物的卡路里。组合物尽管可根据本发明单独施用乳酸菌和/或双歧杆菌，但通常和优选地在作为产品一部分、特别是作为食品、膳食补充剂或药用制剂的组分的支持体上或于其中施用乳酸菌和/或双歧杆菌。这些产品通常含有本领域技术人员公知的另外的组分。任何可获益于所述组合物的产品可用于本发明。这些包括但不限于食物，特别是水果蜜饯和奶类食物和源于奶类食物的产品以及药剂产品。本文中乳酸菌可被称为“本发明的组合物”或“组合物”。食物在一种实施方式中，根据本发明，将乳酸菌和/或双歧杆菌应用于食品中，例如食物补充剂、饮料或奶粉。本文中，术语“食物”以其广泛意义来使用——包括人的食物以及动物的食物(即饲料)。在一个优选的方面，食物用于人消耗。食物可以是溶液或固体剂型——这取决于用途和/或应用方式和/或施用方式。当本发明的组合物用作诸如功能性食物的食物或用于其制备中时，所述组合物可与一种或多种以下物质组合使用营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养上可接受的活性成分。作为实例，本发明的组合物可以用作下述产品的成分软性饮料、果汁或包含乳清蛋白的饮料、保健茶、可可饮料、乳饮料和乳酸菌饮料、酸奶和饮用酸奶、干酪、冰淇淋、水冰和甜品、糖果、饼干蛋糕(biscuits cakes)和制蛋糕用混合料、点心、平衡食物和饮料、水果馅、保健釉、巧克力焙烤馅、干酪蛋糕调味馅、果味蛋糕馅、蛋糕和炸面圈糖衣、即食型焙烤用夹心稀奶油、曲奇饼干用的馅、即用型焙烤馅、低热量馅、成人营养饮料、酸化的大豆/果汁饮料、无菌的/杀菌的巧克力饮料、吧用混合物、饮料粉、钙强化大豆/普通乳和巧克力乳、钙强化咖啡饮料。所述组合物可以进一步用作食品中的成分，例如美式干酪酱、用于干酪碎和干酪丝的抗结块剂、薄片食物蘸料、奶油干酪、干式混合搅打发泡的糕点表面装饰用无脂肪酸性稀奶油、冻融乳制品搅打发泡稀奶油、冻融稳定性搅打发泡顶端附加物、低脂清淡天然切达干酪、低脂瑞士风格酸奶、充气冷冻甜品、硬包装冰淇淋、标签友好、经济性改进和嗜好的硬包装冰淇淋、低脂冰淇淋软性食物(soft serve)、烤肉酱、干酪浸渍酱、生干酪调味料、干混合Alfredo酱、混合干酪酱、干混合番茄酱等等。本文所用的术语“乳制品”意在包括包含动物和/或植物来源的乳的介质。作为动物来源的乳可以提及的有奶牛的、绵羊的、山羊的或水牛的乳。作为植物来源的乳可以提及的有能够用于本发明的植物来源的任意可发酵物质，特别是来源于大豆、稻或谷类。还更优选地，用于本发明的食品是发酵乳或母乳化乳。对于某些方面来说，优选地本发明可以与酸奶产品组合使用，所述酸奶产品例如发酵型酸奶饮料、酸奶、饮用酸奶、干酪、发酵型奶油、基于乳的甜品等等。合适地，所述组合物可以进一步用作一种或多种下述应用中的成分干酪应用、肉应用，或包含保护性培养物的应用。本发明还提供制备食物或食物成分的方法，该方法包括将本发明的组合物与另外的食物成分混合。有利地，本发明涉及已经与本发明的组合物(和任选地与其他组分/成分)接触的产品，其中以能够改进所述产品的营养和/或健康益处的量使用所述组合物。本文使用的术语“接触”是指将本发明的组合物间接或直接应用于产品。可以使用的应用方法的实例，包括但不限于，在包含所述组合物的材料中处理产品，通过将所述组合物与产品混合而直接应用，喷涂所述组合物到产品表面上或将产品浸渍于所述组合物的制备物中。当本发明的产品是食品时，优选将本发明的组合物与所述产品混合。可选择地，可将所述组合物包括在所述食品的乳剂或原料中。在进一步的选择中，所述组合物可以作为调味品、釉料、着色剂混合物等应用。对于一些应用，重要的是使所述组合物在要受影响/处理的产品表面上是可用的或使其对于要受影响/处理的产品表面是可用的。这使得所述组合物能够赋予下述有利特征中的一个或多个营养和/或健康益处。本发明的组合物可以应用于以受控量的活微生物散布、涂覆和/或浸渍产品。优选地，将所述组合物用于发酵乳或蔗糖强化乳或具有蔗糖和/或麦芽糖的乳介质，其中可以将包含所述组合物全部组分——即本发明的所述微生物——的所得介质作为成分以合适浓度——例如以在终产品中提供IO6-IOiciCfu的每日剂量的浓度添加到酸奶中。 可以在酸奶的发酵之前或之后使用本发明的微生物。在一些方面，将本发明的微生物用作动物饲料，或在动物饲料的制备中使用，所述动物饲料例如牲畜饲料，特别是家禽(例如鸡)饲料，或宠物食物。有利地，当所述产品是食品时，乳酸菌应在由零售商公开销售的正常“最迟销售” 日期或“产品有效”日期内应该保持有效。优选地，有效期应该延长至这些日期之后，直到正常的质量保证期结束食物腐败开始变得明显时。期望的时间长度和正常的储藏期限随食品不同而不同，并且本领域普通技术人员将会认识到储藏期限将依据食品类型、食品大小、 储藏温度、加工条件、包装材料和包装设备而不同。食物成分本发明的组合物可以用作食物成分和/或饲料成分。本文所用的术语“食物成分”或“饲料成分”包括作为营养补充剂添加到功能性食物或食品的制剂或能够作为营养补充剂添加到功能性食物或食品的制剂。所述食物成分可以是以溶液剂型或作为固体——取决于用途和/或应用方式和/ 或施用方式。食物补充剂本发明的组合物可以是食物补充剂——或可以添加到——食品补充剂(本文也称为膳食补充剂)中。功能性食物本发明的组合物可以是功能性食物——或可以添加到——功能性食物。本文所使用的术语“功能性食物”是指不但能够提供营养效果，而且能够为消费者递送进一步的有益效果的食物。因此，功能性食物是具有某些组分或成分(例如本文所描述的那些)掺入其中的普通食物，这些组分或成分赋予食品特定功能——例如医学或生理学益处——而不只是纯营养效果。尽管没有功能性食物的法定定义，对本领域感兴趣的大多数参与者认为功能性食物是作为除基本的营养效果外还具有特定健康效果的市售食物。一些功能性食物是营养制品。这里，术语“营养制品”意指不但能够提供营养效果和/或味觉满足，而且能够向消费者提供治疗(或其他有益的)效果的食物。营养制品超越了食物和药物之间的传统界线。药物(Medicament)本文使用的术语“药物”包含在人类医学和兽医学中使用的用于人和动物的药物。 此外，本文使用的术语“药物”意指提供治疗效果和/或有益效果的任何物质。本文使用的术语“药物”并不一定限于需要市场准入的物质，还可以包括能够用于化妆品、营养制品、食物(包括例如饲料和饮料)、益生菌培养物和天然药物的物质。此外，本文所使用的术语“药物”包括被设计用于掺入动物饲料的产品，例如掺入牲畜饲料和/或宠物食物的产品。药剂(Pharmaceutical)本发明的组合物可以用作药剂或用于药剂的制备。本文的术语“药剂”以广义使用——而且包含用于人的药剂以及用于动物的药剂(即兽医应用)。在优选的方面中，所述药剂是用于人用和/或用于畜牧业。所述药剂可以用于治疗目的——其本质上可以是治愈性或姑息性或预防性的。所述药剂甚至可以用于诊断目的。可药用的支持体可以是例如以压制片剂、片剂、胶囊、软膏剂、栓剂或可饮用溶液剂型的支持体。其他合适的剂型将在下文提供。当用作药剂或用于药剂的制备时，本发明的组合物可以与下述一种或多种物质组合使用可药用载体、可药用稀释剂、可药用赋形剂、可药用辅剂、药用活性成分。所述药剂可以是以溶液剂型或作为固体——这取决于用途和/或应用方式和/或施用方式。本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌可以用作药剂成分。本发明中，所述组合物可以是单一的活性组分或者所述组合物可以是多种(两种或更多种)活性组分中的至少一种。所述药剂成分可以是溶液剂型或作为固体——这取决于用途和/或应用方式和/ 或施用方式。本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌可以以任何合适的剂型来使用一不管是单独使用时还是与其他组分或成分组合存在时。本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌在本文中可被称为“组合物”。同样地，包含本发明组合物和其他组分和/或成分(即诸如食物成分、功能性食物成分或药剂成分的成分)的组合可以以任何合适的剂型来使用。本发明所涉及的乳酸菌和/或双歧杆菌可以以固体或液体剂型或其替代的剂型来使用。固体制剂的实例包括但不限于片剂、胶囊、粉剂(dust)、粒剂和散剂(powder)，其可以是可湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于，水溶液、有机溶液或含水有机溶液、悬浮液和乳剂。剂型的合适实例包括下述中的一种或多种片剂、丸剂、胶囊、胚珠制剂(ovule)、 溶液或悬浮液，其可以包含调味剂或着色剂，用于立即释放、迟延释放、改进释放、持续释放、脉冲释放或受控释放应用。作为实例，如果本发明的组合物以片剂的形式使用——例如用作功能性成分—— 所述片剂也可以包含下述中的一种或多种赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，如淀粉(优选玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；粒化粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶；也可以包括润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。用于制备所述剂型的营养上可接受的载体的实例包括，例如，水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、石油膏、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、石脂质肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。优选用于所述剂型的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或酏剂，本发明的组合物可以与各种甜味剂或调味剂、色素或染料组合，可以与乳化剂和/或悬浮剂组合，并且可以与稀释剂例如水、丙二醇和甘油组合，以及可以与它们的组合进行组合。所述剂型也可以包括明胶胶囊；纤维胶囊、纤维片剂等；或甚至纤维饮料。剂型的进一步实例包括乳膏。对于一些方面，可以将本发明中所使用的微生物用于例如药用乳膏和/或化妆用乳膏(例如防晒乳膏和/或晒后乳膏)中。一方面，根据本发明的组合物可以以气雾剂形式施用，例如经由鼻喷雾的方式，例如用于施用于呼吸道。益生元本发明的组合物可另外含有一种或多种益生元。益生元是一系列功能性食品，被定义为不可消化的食品组分，其通过选择性刺激一种或有限种类细菌(特别地，但非排他性地，益生菌、双歧杆菌和/或乳酸菌)在结肠中的生长和/或活性而对宿主产生有益影响，并由此改善宿主健康。通常，益生元是碳水化合物(例如寡糖)，但该定义不排除非碳水化合物。最常见的益生元形式在营养上分类为可溶性纤维。在某种程度上，许多形式的膳食纤维表现出一定水平的益生性效果。在一种实施方式中，益生元是一种选择性发酵成分，其使得对宿主健康和幸福赋予益处的胃肠道微生物群的组成和/活性具有特定改变。合适地，根据本发明可以以0.01至IOOg/天、优选0. 1至50g/天、更优选0.5至 20g/天的量使用所述益生元。在一种实施方式中，根据本发明可以以1至IOOg/天、优选2 至9g/天、更优选3至Sg/天的量使用所述益生元。在另一种实施方式中，根据本发明可以以5至50g/天、优选10至25g/天的量使用益生元。益生元的膳食来源的实例包括大豆、胰岛素源(例如菊芋、豆薯以及菊苣根)、生燕麦、未精制的小麦、未精制的大麦和雪莲果(yacon)。合适的益生元的实例包括藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊粉 (inulin)、古尔胶(guar gum)、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide，G0S)、低聚果糖 (fructo-oligosaccharide, F0S)、聚葡萄糖(polydextrose,即 Litesse )、乳糖醇、乳蔗糖(lactosucrose)、大豆寡糖、异麦芽酮糖O^latinose )、异麦芽寡糖、葡糖寡糖和木糖寡糖、甘露寡糖、β -葡聚糖、纤维二糖、棉子糖、龙胆二糖、蜜二糖、木二糖、环糊精、异麦芽糖、海藻糖、水苏四糖、潘糖、芽霉菌糖(pullulan)、毛蕊糖、半乳甘露聚糖、以及所有形式的抗性淀粉。益生元的特别优选的实例是聚葡萄糖。再一方面，本发明提供以下组合在制备用于降低哺乳动物的空腹胰岛素水平的食品、膳食补充剂或药物中的用途(a)乳酸菌、双歧杆菌或他们的任何混合物；和(b)益生元。再一方面，本发明提供以下组合在制备用于增加哺乳动物的进食状态胰岛素分泌的食品、膳食补充剂或药物中的用途(a)乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物；和(b)益生元。认为在本发明的范围内能够将本发明的实施方式进行组合，使得本文描述的任何特征的组合包括在本发明的范围内。特别地，认为在本发明的范围内细菌的任何治疗效果均可附随地表现。
实施例实施例1材料和方法动物模型和益生菌处理给一批50只10周龄的C57B1/6雄性小鼠饲喂正常膳食(NC) (A03，SAFE，Augy，法国)或高脂肪膳食(HFD)(包含72%脂肪(玉米油和猪油)、观％蛋白质以及< 碳水化合物)(SAFE，Augy，法国)持续4周。该膳食特别有利于在发生肥胖之前诱导糖尿病(见， 例如，Cani 等，2008 “Role of gut microflora in the development of obesity and insulin resistance following high-fat diet feeding". Pathol Biol(Paris) ；Cani 等，Diabetes 2008，57，1470-81 ；Knauf 等，Endocrinology 2008，149，4768-77 ；Cani 等， Diabetologia 2007，50，2374-83 ；Cani 等，Diabetes 2007，56，1761-1772 以及 Turini 等， Swiss Med Wkly 2007，137，700-4)。在饲喂高脂肪膳食之后(在饲喂益生菌之前)，给小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验。 计算曲线下面积，并根据不同试验组或每组10只小鼠(10只小鼠/组)均勻分配小鼠。数据显示在饲喂益生菌之前所有小鼠都处于糖尿病状态。使用正常膳食(η = 10)或高脂肪膳食(HFD)(n = 40)饲喂小鼠4周。用下述之一每天处理HFD小鼠，持续4周1.载体处理；2.动物双歧杆菌乳亚种菌株420 (B420)(每只小鼠IO9个细菌)；3.嗜酸乳杆菌NCFM(NCFM)(每只小鼠IO9个细菌)；4. NCFM+B420 (每只小鼠 5 X 108B420+5 X IO8NCFM)。将小鼠圈养在受控环境中(颠倒的12小时日光循环，上午10:00时闭光)。内毒素血症和血浆⑶14在益生菌或对照处理结束时收集来自小鼠的血液样品。将基于使用Kinetic-QCL 试验(Bio ffhittaker, Cambrex BioScience)的鲎变形细胞提取物的内毒素测定法用于定量血浆LPS(内毒素血症)——这是用于测定革兰氏阴性菌内毒素的定量、动力学分析。将血清稀释为1/20至1/100并在循环(rounds)期间在70°C加热10分钟。LPS的检测下限为0. 001内毒素单位/毫升。血浆s⑶14 (LPS受体)使用免疫酶法(IBL, GmbH, Hamburg, 德国)来测定。小鼠组织中微生物DNA的定量处死之后，无菌收集以下小鼠组织肠系膜脂肪组织，皮下脂肪组织和肝。将这些组织速冻并保持冷冻直至分析。在DNA提取前，将组织使用ft~ecellyS M自动化生物样品粉碎机(Bertin Technologies，Tarnos，法国)来勻化。将样品称重并用1. ^il ASL 缓冲液Oliagen，Hilden，德国)在含陶瓷珠(Bertin)的CK14管中稀释。将样品用陶瓷珠在6，SOOrpm下研磨3X30秒且在运行过程保持在冰上。收集上清液并转移入含玻璃粉 (Bertin)的VKOl管中，重复研磨过程。再次收集上清液并转移入^il Eppendorf管中。使用QIAmp DNA Stool Mini试剂盒^jiagen)根据制备商的说明分离并纯化细菌DNA。细菌DNA通过实时定量PCR使用群或属特异引物来测定。目标细菌群(以及所用的引物和条件)为总细菌域(未公布)，肠杆菌科(Matsuda等，App. Env. Microbiol.， 2007，73，32-39)，双歧杆菌属(Makivuokko等，Nutrition and Cancer 2005,52(1),93-103)，乳杆菌属(Walter 等，Appl. Environ. Microbiol. 2001，67，2578-2585，Heilig 等， Appl. Environ. Microbiol. 2002，68，114-123)，拟杆菌纲和肠球菌属(RinttilS等，J. Appl. Microbiol.，2004，97，1166-1177)。用于定量 PCR 分析的设备为 Applied Biosystems 7500 FAST Real-time PCR System 或 ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特市)。将结果表示为在各个组织中各细菌群的检测限之上每克组织的细胞数的对数。对于各个组织类型中的各个细菌群分别确定检测限。MM内毒素血症和血浆⑶14与饲喂正常膳食(NC)的小鼠的基础内毒素(血浆LPS的基础水平)相比，高脂肪膳食(HFD)小鼠的基础内毒素伴随有2至3倍的平均增加(图1)。将这种与高脂肪膳食相关的血浆LPS的增加定义为代谢性内毒素血症。在小鼠中所有益生菌处理都能够显著地减轻代谢性内毒素血症并逆转高脂肪膳食的副作用。用益生菌和高脂肪膳食处理的小鼠的血浆sCD14(LPS的主要受体)的平均水平比仅接受高脂肪膳食的小鼠要低4倍以上。综合考虑，这些结果证明益生菌处理减轻了代谢性内毒素血症，此外减少了 LPS 的循环受体(其也随着高脂肪膳食增加)。LPS为革兰氏阴性菌的主要细胞壁组分，其在肠中以革兰氏阴性微生物群的组分形式但也以游离LPS的形式存在。代谢性内毒素血症的减轻可以由以下产生减少革兰氏阴性菌位移至宿主、减少宿主对游离LPS的吸收或增强宿主对LPS的清除。由此，益生菌可以用作用于预防和治疗代谢性内毒素血症的新方法。减少细菌位移至组织与正常膳食相比，高脂肪膳食与组织中细菌DNA水平升高有关。该影响在肠系膜脂肪组织中尤其显著，其中肠杆菌科(图2)、肠球菌属(图3)、乳杆菌属(图4)和总细菌域(图6)的水平升高与高脂肪膳食相关。在皮下脂肪组织中，在饲喂高脂肪膳食的小鼠中检测到拟杆菌纲的水平升高(图幻。在任何组织中未检测到显著量的双歧杆菌属。益生菌处理显著地降低了组织中的细菌DNA水平。在肠系膜脂肪组织中，B420处理显著降低肠杆菌科(图2)的水平，NCFM处理显示肠杆菌科(图2)和乳杆菌属(图4) 水平降低的趋势。在肝中，NCFM和B420的组合趋于降低乳杆菌属(图4)的水平，而单独 NCFM处理趋于降低拟杆菌纲(图5)和细菌域(图6)的水平，B420处理趋于降低拟杆菌纲 (图5)的水平。对于其它细菌和组织也观察到统计学上非显著性下降的趋势。这些结果证明益生菌处理能够在代谢上非常重要的组织中、在肠系膜脂肪组织和肝中降低细菌水平。由此，可将益生菌用作用于预防或治疗与高脂肪膳食和代谢性内毒素血症相关的细菌位移至组织中的新方法。生理上尤其重要的是肠系膜脂肪组织中的肠杆菌科和肝组织中的拟杆菌纲降低。这两个主要的细菌群含有LPS作为细菌细胞壁的成分，因此充当升高的血浆LPS(其与代谢性内毒素血症有关)的潜在来源。这些组织在代谢性内毒素血症和其它代谢疾病中起非常重要的作用，由于LPS在这些组织中引起炎症，可能导致不良事件(包括糖代谢异常和胰岛素敏感性降低)的级联。实施例2诱导此研究的目的是确定在小鼠中高脂肪饲喂对肠道菌群、细菌位移和血糖的影响，以及嗜酸乳杆菌NCFMtm(NCFMtm)对这些参数潜在的保护作用。材料和方法通过高动物脂肪膳食(60%脂肪，HFD)对C57BL/6雄性小鼠诱导肥胖和糖尿病。对照小鼠接受标准膳食脂肪，LFD)。从19周龄开始，使这些小鼠在3周内接受IO9CFU/ 天的嗜酸乳杆菌NCFM 。在用NCFM 处理前后测量空腹血糖。在处死前一天进行腹腔胰岛素敏感性试验。通过以下方法进行结肠附着菌群和细菌位移分析。细菌分析在解剖后收集结肠和回肠。将回肠和结肠壁用于定性和定量附着菌群。将样品在厌氧条件下在林格氏溶液(Ringer)/吐温80培养基中保存达2小时。勻化后，将样品在脑心浸出液肉汤(Brain Heart Broth)中温育以富集和鉴定最高量的厌氧细菌和需氧兼厌氧细菌。在林格氏溶液半胱氨酸培养基中进行1比10和1比100的稀释。将这些稀释液涂布在富集有5%去纤维蛋白马血(CS)的哥伦比亚琼脂(Columbia agar)上，在37°C下在需氧或厌氧气氛下培养。在涂布2天和7天后计数和鉴定菌落。使用3种培养基。非选择性琼脂、用于分离肠杆菌的DCL琼脂(脱氧胆酸盐、柠檬酸盐以及乳糖)，乳杆菌属特异性MRS琼脂(Man，Rogosa，Sharpe)。细菌的鉴定通过确定呼吸型、革兰氏染色和代谢特征来进行。细菌位移解剖后，收集肠系膜淋巴结(MLN)和肠系膜脂肪组织(MAT)。在MLN和MAT中对细菌位移进行定量。将样品在厌氧条件下在林格氏溶液/吐温80培养基中保存2小时。勻化后，将 ImL的初始样品在脑心浸出液富集肉汤(brain heart enrichment broth)中培养，以减少低细菌水平样品的检测阈值。将富集培养物通过石蜡层覆盖以允许厌氧菌生长，培养4天， 每天检测生长。在改良哥伦比亚血琼脂板上于厌氧条件下培养48小时来分离阳性培养物。将不同类型的菌落传代培养并鉴定。所有的培养均在37°C下进行。确定细菌计数并以log CFU/ g组织来表示。结果在18周时，高脂肪膳食小鼠(HFD)比对照膳食小鼠(LFD)重39% (39. 2士3. 3对 28. 1 士 1. Ig,ρ < 0. 01) ο 空腹高血糖增加 77% (174士31 对 98士6mg/dl，p < 0. 01)，与 LFD 相比，在HFD组中发现胰岛素敏感性降低(注射胰岛素后60分钟，2%对48%的血糖降低)。施用嗜酸乳杆菌NCFM 未改变LFD小鼠的空腹血糖(95 士 5mg/dl对92 士 6mg/ dl)。然而，HFD小鼠的血糖显著降低，其趋于正常化对125士 10mg/dl，ρ < 0. 02)。用NCFM 处理的HFD小鼠保持对胰岛素的抵抗。HFD小鼠显示结肠附着菌群显著地更丰富(6. 5 士 0. 71ogCFU/g对 4. 6士0. 41ogCFU/g，ρ < 0. 01)，包括更多的乳杆菌(6. 0士0. 5 对 4. 5士0. 2，ρ < 0. 01) 和肠球菌(5.4士0.41ogCFU/g 对 4.4士0.21ogCFU/g，ρ < 0.01)。此过量通过 NCFM 处理抵消(对于总菌群返回至5. 4士0. 61ogCFU/g,对于乳杆菌返回至4. 3士0. 21ogCFU/g,对于肠球菌返回至4. 6士0. 41ogCFU/g)。在HFD小鼠肠系膜脂肪中检测到的细菌的增加 (3. 8 士 1. 51ogCFU/g 对 2. 2 士 0. 91ogCFU/g)通过 NCFM 处理轻微地改进(4. 0 士 1. 21ogCFU/ g)。在HFD小鼠结肠和回肠中，菌落随革兰氏阴性菌的外观而多样化，所述革兰氏阴性菌未被NCFM 清除。在肠系膜淋巴结中，革兰氏阳性菌出现于高脂肪膳食小鼠，并在NCFM 处理后消失。结论益生菌菌株嗜酸乳杆菌NCFM 趋于使肥胖和糖尿病小鼠的空腹高血糖正常化。后者显示附着肠道菌群比对照小鼠更丰富和更多样化。用嗜酸乳杆菌NCFM 处理导致结肠中粘膜附着细菌水平降低，并导致回肠、结肠和肠系膜淋巴结中潜在的致病性革兰氏阳性菌的清除。实施例3口·汁隨麵■丨隱麵·通过培养确定益生菌处理对大肠杆菌粘膜附着和细菌位移的影响。所用的小鼠模型和益生菌处理与在上述实施例1中描述的相同。另外，包括接受益生菌和益生元组分(每天每只动物0. 2克低聚果糖)的组合的组。给空腹小鼠管饲IO9菌落形成单位的氨苄西林耐药大肠杆菌，所述大肠杆菌从小鼠分离并在原核启动子的调控下通过表达内酰胺酶基因的质粒赋予氨苄西林耐药性。 两小时后将小鼠处死，分别从十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠收集粘膜或肠腔、进行稀释并涂布在含氨苄西林的琼脂糖上并在37°C下培养过夜。计数菌落的数量。类似地，从收获的组织(包括肝，脾，肠系膜脂肪组织，皮下脂肪组织，肠系膜神经节和皮下神经节)培养氨苄西林耐药性荧光大肠杆菌。检测空腹状态以及进食状态血浆的胰岛素浓度。结果为了研究在此过程中粘膜附着的作用，定量了附着进入小鼠肠粘液的抗生素耐药共生大肠杆菌。来源于粘膜中或肠腔不同区段中的抗生素耐药菌落在琼脂糖平板上的定量显示HFD膳食增加粘膜相关大肠杆菌的水平，但用益生菌菌株B420处理减少HFD诱导的大肠杆菌向空肠和回肠的粘膜附着(图7)。虽然初始实验显示在盲肠或结肠中没有变化，但进一步的实验显示益生菌菌株B420减少HFD诱导的大肠杆菌向盲肠的粘膜附着(图8)。单独B420或与益生元组合处理也减少大肠杆菌位移至小鼠组织(包括肝、脾、肠系膜脂肪组织、皮下脂肪组织、肠系膜神经节和皮下神经节)(图9)。大肠杆菌粘膜附着和位移的减少伴随着胰岛素水平改进，即，空腹胰岛素水平降低和进食后胰岛素分泌提高 (图 10)。实施例4基因表达的降低材料和方法如 Putaala H 等("Effect of four probiotic strains and Escherichia coli 0157:H7 on tight junction integrity and cyclo-oxygenase expression，，， Research in Microbiology 2008)和 Makivuokko H 等(Nutr. Cancer，2005，52，94-104)所述将 Caco-2细胞(ECACC，Salisbury, UK)用作人肠上皮细胞(IECs)的模型，在如下标准体外培养条件下培养所述Caco-2细胞包括湿润气氛，37°C和5% C02，以及Caco-2细胞培养基
22(Invitrogen, Carlsbad, CA, US and BD Biosciences, San Jose, CA, US),。为了暴露Caco-2细胞，将动物双歧杆菌乳亚种菌株420在MRS (Man，Rogosa and Sharpe)肉汤中增殖过夜，用流式细胞仪(FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, US)测定细胞密度，进行沉淀(25°C，5分钟，3000g)，用Caco-2培养基洗涤一次，以20至100 细菌细胞比1个Caco-2细胞的比例稀释至Caco-2培养基中。之后，在标准体外条件下处理Caco-2细胞8小时。作为对照，将用不添加动物双歧杆菌乳亚种菌株420的Caco-2培养基处理的Caco-2细胞用作对照。为了暴露Caco-2细胞与聚葡萄糖，如Makivuokko等(参考上文)所述，将在结肠模拟介质中的(ν/ν)和2% (ν/ν)聚葡萄糖(Litesse )首先在体外结肠模拟器中进行发酵。在此研究中，使用由四个阶段和四个平行单元构成的体外结肠模拟试验。单个单元包括4个具有被调节成代表人结肠不同部分的条件的顺序连接的容器 (V1、V2、V3和V4)，所述容器依次代表结肠的不同部分近端、升部、降部和远端结肠。模拟之后，对聚葡萄糖发酵上清液进行沉淀(25°C，5min，10，OOOg)，于Caco-2培养基中稀释为 10% (ν/ν)。在标准体外条件下处理细胞M小时。将用不添加聚葡萄糖的发酵结肠模拟介质类似地处理的Caco-2细胞用作对照。暴露后，使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从Caco-2细胞分离总细胞 RNA。使用 Affymetrix U133+2. OGeneChips (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA, US) 来研究人细胞转录组。根据制备商的标准建议在微阵列处理期间进行所有RNA处理、标记、 杂交、洗涤、染色和扫描。用GC-RMA预处理微阵列数据，并使用程序语言R(version 2. 5. 0) (R Development Core Team ；"R :A language and environment for statistical computing，，，Vienna, Austria :R Foundation for Statistical Computing ；2006)禾口 Bioconductor(version 2. 0) (Gentleman RC等,“Bioconductor :open software development for computational biology and bioinformatics”Genome Biol. 2004,5, R80)进行统计学分析。对于用动物双歧杆菌乳亚种菌株420处理的样品，差异表达的基因基于以下来选择与对照相比，基因表达在信号强度上具有超过1. 6的对数比(log-ratio)差异。对于聚葡萄糖处理的Caco-2 样品，差异表达的基因基于以下来选择使用来自模拟试验的后三个容器(V2、V3、V4)的基因的基准来计算它们的总行为。大多数基因沿着类似的方式通过四个容器在下调或上调图谱中，表达朝着最后的容器减弱或加强。而且，如果基因图谱在对照(0%聚葡萄糖)中是上调的，其在聚葡萄糖处理中轻微进一步上调且在2%聚葡萄糖处理中上调更多。类似地，在下调图谱中，2% 聚葡萄糖处理比聚葡萄糖处理进一步下调，而聚葡萄糖处理比对照进一步下调。由此，基于后三个容器将基因定义为上调的或者下调的。无处理样品和两种聚葡萄糖浓度处理样品间的差异使用配对样品t检验进行计算，临界ρ值ρ < 0. 01。结果肠道胆固醇吸收相关基因的表达在Caco-2细胞中通过动物双歧杆菌乳亚种菌株 420(表1)或通过聚葡萄糖发酵上清液(表幻来调控。对于APOB、AP0C2、AP0C3、APOAIV和MTTP的下调作用具有减少胆固醇和甘油三酯从肠道吸收的效应(Iqbal J和Hussain MM, American Journal ofPhysiology-Endocrinology and Metabolism 2009,296, E1183-E1194)，而对于 NPCl 的上调作用增加 HDL 在肠道中的形成(Brunham LR 等，J Clin Invest 2006，116，1052-62)。 NR2F2和HNF4A是调控载脂蛋白基因表达的转录因子参见Antes