专利名称：治疗眼纤维化的方法和组合物的制作方法青光眼是一类特征为眼内压(IOP)增高和视神经损伤的神经性眼病。青光眼可导致视力下降或丧失，是导致失明的第二大原因。目前对青光眼的治疗涉及通过化学或机械手段降低眼内压。例如，治疗青光眼最常见和有效的方法是小梁切除术，此手术过程中眼的部分小梁网被除去以使房水排出眼并进入结膜，从而降低眼内压。然而，小梁切除术一般后随有炎症和纤维化。1/3到1/2的小梁切除术最终由于结膜内纤维化而失败。
发明人发现了平行于小梁切除术后可能发生的纤维化损伤的一些赖氨酰氧化酶型酶表达的改变。因此，对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的调节有助于降低和/或逆转这种纤维化损伤。例如，在治疗青光眼的小梁切除术后，对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的调节可减少伴随纤维化损伤，从而改善结果。调节一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的组合物可包含蛋白质(例如抗体或小肽)，核酸(例如形成三链体的寡核苷酸、siRNA、shRNA、微小RNA、核酶)或有机小分子(例如分子量小于IkD)，例如可通过组合化学方法合成。因此，本发明包括但不限于以下实施方式I. 一种在生物体内治疗眼纤维化的方法，其中，该方法包括抑制生物体的一个或多个细胞中的一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性。 2.如实施方式I所述的方法，其中，一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性被抑制。3.如实施方式2所述的方法，其中，所述赖氨酰氧化酶型酶是赖氨酰氧化酶(LOX)。4.如实施方式2所述的方法，其中，所述赖氨酰氧化酶型酶是赖氨酰氧化酶相关蛋白 2 (L0X2)。5.如实施方式3所述的方法，其中，所述LOX活性通过给予生物体抗LOX抗体来抑制。6.如实施方式4所述的方法，其中，所述L0XL2活性通过给予生物体抗L0XL2抗体来抑制。7.如实施方式I所述的方法，其中，所述眼纤维化发生在青光眼治疗中。8.如实施方式7所述的方法，其中，所述青光眼治疗涉及眼部手术，例如小梁切除术。9.如实施方式5所述的方法，其中，所述抗LOX抗体被引入生物体眼内。10.如实施方式6所述的方法，其中，所述抗L0X2抗体被引入生物体眼内。11.如实施方式5所述的方法，其中，所述编码抗LOX抗体的多核苷酸给予生物体。12.如实施方式6所述的方法，其中，所述编码抗L0XL2抗体的多核苷酸给予生物体。 13.如实施方式11或12所述的方法，其中，所述多核苷酸被引入生物体眼内。14.如实施方式11-13中任一项所述的方法,其中,所述一种或多种多核苷酸被包封在病毒载体中，所述病毒载体选自腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。15.如实施方式14所述的方法，其中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)。16.如实施方式15所述的方法，其中，所述病毒载体是AAV 2型或AAV 4型。17.如实施方式I所述的方法，其中，所述生物体是哺乳动物。18.如实施方式17所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。附图简要说明图1(A图和B图)显示了双眼都经历小梁切除术的家兔左眼(A图，上图)和右眼(B图，下图)的眼内压(IOP)的测量值。用Tono-Pen 眼压计测量Ι0Ρ。数据表示成各时间点相对于手术前IOP值的IOP变化(平均值土SEM)。对于星号标出的点，P < O. 05。图2 (A图和B图)显示了双眼都经历小梁切除术的家兔左眼(A图，上图)和右眼(B图，下图)的滤过泡面积的测量值。数据表示成各个时间点的滤过泡面积(_2)。对于星号标出的点，P < O. 05。图3 (A-H图)显示了纤维化滤过泡(A、B、C和D图)和未纤维化结膜(E、F、G和H图)在小梁切除术后3天(A和E图)、8天(B和F图)、14天(C和G图)、以及30天(D和H图)的⑶45免疫染色切片。图4显示了手术后不同时间采得的滤过泡(标记成“纤维化”)和结膜(标记为“未纤维化”)样品中的白细胞密度，如所标示。通过测量切片中CD45阳性细胞数量并除以切片面积来计算白细胞密度(平均值土SEM)。在未纤维化结膜样品中没有观察到CD45染色。所有纤维化样品的P <0.05。图5 (A-H图)显示了滤过泡(A、B、C和D图)和结膜(E、F、G和H图)在小梁切除术后3天(A和E图)、8天(B和F图)、14天(C和G图)、以及30天(D和H图)的三色染色的薄切片。图6 (A-H图)显示了滤过泡(A、B、C和D图)和结膜(E、F、G和H部分)在小梁切除术后3天(A和E图)、8天(B和F图)、14天(C和G图)、以及30天(D和H图)的天狼星红染色的薄切片。图7 (A-H图)显示了滤过泡(A、B、C和D图)和结膜(E、F、G和H图)在小梁切除术后3天(A和E图)、8天(B和F图)、14天(C和G图)、以及30天(D和H图)的苏木精和伊红(H&E)染色的薄切片。图8(A_C图)显示了小梁切除术后3、8、14和30天时滤过泡(标记为“纤维化”)和未纤维化结膜(标记为“未纤维化”)的切片中胶原沉积的定量分析(平均值土SEM)。通过测定作为切片总面积百分数的胶原纤维(用三色染成蓝色，用天狼星红染成红色，用H&E染成紫色)占据的面积来定量胶原沉积。A图显示了三色染色切片的分析。B图显示了天狼星红染色切片的分析。C图显示了 H&E染色切片的分析。对于星号标出的点，P <0.05。图9显示了来自眼纤维化(标记为“优质”)和未纤维化(标记为“劣质”)部分组织的代表性薄切片，其对赖氨酰氧化酶(LOX)免疫染色。如所示在小梁切除术后3、8、14、和30天获得眼。图10显示了来自眼纤维化(标记为“优质”)和未纤维化(标记为“劣质”)部分组织的代表性薄切片，其对赖氨酰氧化酶样2(L0XL2)免疫染色。如所示在小梁切除术后3、 8、14、和30天获得眼。图11 (A和B图)显示了小梁切除术后第3、8、14和30天时纤维化和非纤维化眼组织中赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样_2(L0XL2)蛋白水平的定量。通过测定LOX或L0XL2免疫染色阳性的切片总面积百分数来定量蛋白水平。图11的A图显示了 LOX的结果；图11的B图显示了 L0XL2的结果。图12(A和B图)显示了小梁切除术后对照(PBS)和抗体处理的眼中眼内压(IOP)。A图显示抗LOX抗体的效力；B图显示抗L0XL2抗体的效力。图13(A和B图)显示了小梁切除术后对照(PBS)和抗体处理的眼中的滤过泡面积。图13的A图显示抗LOX抗体的效力；图13的B图显示抗L0XL2抗体的效力。图14(A和B图)显示了小梁切除术后对照(PBS)和抗体处理的眼中的滤过泡高度。图14的A图显示抗LOX抗体的效力；图14的B图显示抗L0XL2抗体的效力。图15(A和B图)显示了卡普兰-迈耶存活曲线代表的滤过泡存活测量值。图15的A图显示抗LOX抗体的效力；图15的B图显示抗L0XL2抗体的效力。图16显示了第30日的眼中滤过泡薄切片内⑶31、⑶45和胶原试验的代表性结果的显微照片。最左侧的栏显示了⑶31的免疫组织化学实验；中间栏显示了⑶45的免疫组织化学实验；而最右侧的栏显示胶原的天狼星红染色实验。最顶行显示了用抗LOX抗体治疗的动物眼的滤过泡切片；第二行显示了来自同一动物对照(用PBS治疗)眼的切片。第三行显示了用抗L0XL2抗体治疗的动物眼的滤过泡切片；最后一行显示了来自同一动物对照(用PBS治疗)眼的切片。图17(A和B图)显示了小梁切除术后第30日的滤过泡和非滤过泡组织中⑶31表达的定量分析。图17的A图显示了用抗LOX抗体的疗效。图17的B图显示了用抗L0XL2抗体的疗效。在两个图中，最左侧的一对柱显示了非滤过泡组织的结果，最右侧的一对柱显示了滤过泡的结果。对于每一对柱，最左侧的柱显示对照(PBS处理的)眼的结果，而最右侧的柱显示抗体治疗的眼的结果。图18(A和B图)显示了小梁切除术后第30日的滤过泡和非滤过泡组织中⑶45表达的定量分析。图18的A图显示了用抗LOX抗体的疗效。图18的B图显示了用抗L0XL2抗体的疗效。在两个图中，最左侧的一对柱显示了非滤过泡组织的结果，最右侧的一对柱显示了滤过泡的结果。对于每一对柱，最左侧的柱显示对照(PBS处理的)眼的结果，而最右侧的柱显示抗体治疗的眼的结果。图19 (A和B图)显示了小梁切除术后第30日的滤过泡和非滤过泡组织中胶原沉积的定量分析。图19的A图显示了用抗LOX抗体的疗效。图19的B图显示了用抗L0XL2抗体的疗效。在两个图中，最左侧的一对柱显示了非滤过泡组织的结果，最右侧的一对柱显示了滤过泡的结果。对于每一对柱，最左侧的柱显示对照(PBS处理的)眼的结果，而最右侧的柱显示抗体治疗的眼的结果。发明详沭除非另有说明，本文的实施采用细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域和相关领域中的标准方法和常规技术，所述方法和技术在本领域技术范围内。这些技术描述于文献中并因而本领域技术人员可用。见例如Alberts, B.等,“Molecular Biology of the Cell (《细胞分子生物学》)，”第5版,加兰出版公司(Garland Science),纽约州纽约,2008 ；Voet,D.等“Fundamentals of Biochemistry Life at the Molecular Level (《生物化学基础分子水平的生活》)”,第三版,约翰威利公司(John Wiley & Sons),新泽西州霍博肯，2008 ;Sambrook, J 等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆实验手册》)，”第三版,冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),2001 ；Ausubel, F.等，“Current Protocols inMolecular Biology (《新编分子生物学实验指南》)”约翰威利公司，纽约，1987,定期更新；Freshney, R. I. ,“Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique (《动物细胞培养基础技术手册》)”第四版；约翰威利公司，新泽西州萨摩赛特，2000 ;以及“Methodsin Enzymology (《酶学方法》)，”丛书,学术出版社(Academic Press),加利福尼亚州圣地亚哥。眼纤维化中赖氨酰氧化酶型酶的作用赖氨酰氧化酶(LOX)和赖氨酰氧化酶样(LOXL)蛋白质涉及胞外空间内胶原和弹性蛋白的交联。这些蛋白在纤维化过程中起到重要作用。因此在一个方面，如本文所述的调节赖氨酰氧化酶型酶活性的组合物用于治疗表征为眼纤维化的病症。在一些实施方式中，调节赖氨酰氧化酶(LOX)的活性(例如抑制)。在一些实施方式中，调节了赖氨酰氧化酶样2蛋白(L0XL2)的活性(例如抑制)。一种表征为眼纤维化的病症的非限制性例子是小梁切除术，其用于治疗青光眼。在某些实施方式中，赖氨酰氧化酶型酶的活性被抑制。赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂可以是抗体、小RNA分子、核酶、形成三链体的核酸、有机小分子(例如分子量小于Ikd)或抑制赖氨酰氧化酶型酶编码基因表达的转录因子。见例如US 2003/0114410 ；US 2006/0127402 ；US 2007/0021365 ；US2007/0225242 和共有的 US 2009/0053224 和 US2009/0104201 ;其通过引用纳入本文以公开各种类型的赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂。还参见美国专利号6，534，261，通过引用纳入本文以公开制备抑制赖氨酰氧化酶型酶编码基因表达的转录因子的方法。在一些实施方式中，赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂是结合赖氨酰氧化酶型酶并抑制其活性的抗体。在另一个实施方式中，抑制是非竞争性的。结合一种或多种赖氨酰氧化酶型酶并抑制其活性的示例性抗体公开于共有的美国专利申请公开号US2009/0053224和US2009/0104201中，其公开内容通过弓I用纳入本文以用于公开结合赖氨酰氧化酶型酶的抗体的制备、组成和用途。在一些实施方式中，用编码抗赖氨酰氧化酶抗体的核酸或功能性抗体片段作为赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂。可通过任何本领域已知方法给予这些核酸。例如，可将任选在缓冲液或药物载体溶液中的裸露核酸注入眼中，其配制成用作滴眼剂或系统性给药的溶液。赖氨酰氧化酶型酶本文所用的术语“赖氨酰氧化酶型酶”指催化赖氨酸和羟赖氨酸残基的ε-氨基氧化脱氨的蛋白家族成员，该氧化脱氨导致肽基赖氨酸转变成肽基-α-氨基己二酸-δ -半醛(醛赖氨酸)并释放化学计量量的氨和过氧化氢
本文公开了治疗例如在通过小梁切除术治疗青光眼过程中发生的眼纤维化的方法和组合物。组合物包含一种或赖氨酰氧化酶型酶(例如LOX、LOXL2)的活性调节剂，所述方法包括制备调节剂的方法和对需要的对象给予调节剂的方法。