专利名称：6-ggpp合酶、8-倍半萜合酶、截短侧耳素高产菌株及菌株的应用的制作方法截短侧耳素是化学合成泰妙菌素(Tiamulin)的前体，分子式为C22H34O5，分子量为378. 51,属二職类化合物是高等真菌担子菌侧耳属Pleurotus mutilus或其它真菌的次级代谢产物，是一种天然的具有广泛抗菌活性的二萜类化合物。截短侧耳素的抗菌机理为抑制感受性细菌蛋白质的合成，即它作用于细菌体内的核糖体，主要表现为抑菌，高浓度时表现杀菌作用。截短侧耳素作为一种常用的兽用抗生素以及半合成前体物质，使用范围相当广泛。从最初的兽用抗生素，到现在结构改造成为人用抗生素，截短侧耳素类抗生素已经逐渐开始受到大量的重视。然而从截短侧耳素发现到现在，关于截断侧耳素发酵条件的研究相对较少，而文献报道的产物产量仅为2. 2mg / ml左右，产量偏低，不适宜工业化生产。从工业化来看，虽然我国截短侧耳素的产能大，但菌株的效价水平较低，增加了生产的成本。因此迫切需要选育高产截短侧耳素的菌株，优化其发酵条件，以获得大量的截短侧耳素，适于工业化应用。
本发明提供了两种对截短侧耳素的形成具有重要影响的6-GGPP合酶(即GGPP合酶、6-GGPP合酶、GGPP合成酶，下同)和8-倍半萜合酶(即倍半萜合成酶、倍半萜合酶、8-倍半萜合成酶，下同)，具有这两种酶的菌种产截短侧耳素的效价水平较高。本发明还提供了两种新的截短侧耳素高产菌株，这两种菌株生产发酵截短侧耳素的效价水平都较高，为截短侧耳素的生产提供了更好的选择。本发明还提供了该两种高产菌株的应用一即用它们发酵生产截短侧耳素，该菌株效价高、降低了成本，适于工业化大生产。本发明是通过以下措施实现的 本发明通过筛选和诱变得到了两种截短侧耳素的高产菌株一斜盖伞属菌株。其中，一种为斜盖伞(Clitopilus prunulus) TM110518，其保藏编号为CGMCC NO. 6093，保藏时间为2012年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。该TM110518菌株是从土壤中通过富集和划线分离的方法分离得到的，将所得菌种进行菌种鉴定，方法如下 ①形态学特征 固体培养特征观察菌种在PDA平板上的生长情况及菌落形态。菌丝在PDA中培养3天后以菌种为圆心向四周延伸，菌丝呈白色，生长浓密。细胞形态特征菌丝纤细，宽度均在2. 5-3 mm，有横隔，未发现锁状联合.菌丝培养至I个月未观察到孢子的形成.最长观察至3个月，观察不到子实体的形成。液体培养特征在无菌条件下，用接种环挑取一个菌落于液体培养基中，28°C，21Orpm摇床培养，该菌在培养基中生长缓慢而均匀，培养基变得更加粘稠，达到最大浑浊度后，菌体会部分沉淀，菌体呈乳白色。分子鉴定 菌种送至北京微生物研究所鉴定其rDNA及rRNA，利用近似物种的rDNA序列设计引物并进行PCR扩增，测序结果在Genbank中进行比对.证实该新菌株是——斜盖伞(Clitopilus prunulus)。
TM110518 菌种的 ITS 及 28SrDNA (D1/D2)序列如下
ITS序列
CCCGTAAACAGTAAGGACGTGAAGATCGGATCATTATTGATAACTTGGTCAAGCTGTTGC 60TGGTCCTTCGGGGCATGTGCACGCTTGCCACCAAATTTAACCACCTGTGCACCTTTTGTA 120GACTAGAAACGTTTCTCGAGGCAACTCGGATTGAGAATTGCTGCGCGAAAGCCAGCTGTT 180CTTGTGTTTCTCAGTCTATGTTTTTACATACCCCGAATGAATGTATTAGAATGTATTGCT 240GGGCCTTTGTGCCTTTAAATCAAATACAACTTTCAACAACGTGAATCATCGAATCTTTGA 300ACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCT 360CAACTATACAAGTTTTTATTAACCTGTATGGCTTGGATCATGGGGTTTGCGGGCTTCCTG 420AGTCGGCTATCCTTAAATGCATTAGCAGAGCTTTTGCCGCTAATCTATGGTGTGATAATT 480ATCTACGCCATTGAGAAGTGACATGTTGAGGCTTCGCTTCTAATCGTCTTCACAGACAAC 540ATTTGACAATCTGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAG 600GCGGAGG607
D1/D2序列
AGAAAATCAAAGGTATTCTACCTGATTTGAGGTCAGATTGTCAAATGTTGTCTGTGAAGA 60CGATTAGAAGCGAAGCCTCAACATGTCACTTCTCAATGGCGTAGATAATTATCACACCAT 120AGATTAGCGGCAAAAGCTCTGCTAATGCATTTAAGGATAGCCGACTCAGGAAGCCCGCAA 180ACCCCATGATCCAAGCCATACAGGTTAATAAAAACTTGTATAGTTGAGAATTTAATGACA 240CTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCATTCATCGATGCGAGAGCCAAGA 300GATCCGTTGTTGAAAGTTGTATTTGATTTAAAGGCACAAAGGCCCAGCAATACATTCTAA 360TACATTCATTCGGGGTATGTAAAAACATAGACTGAGAAACACAAGAACAGCTGGCTTTCG 420CGCAGCAATTCTCAATCCGAGTTGCCTCGAGAAACGTTTCTAGTCTACAAAAGGTGCACA 480GGTGGTTAAATTTGGTGGCAAGCGTGCACATGCCCCCAAGGACCAGCAACAGCTTGACCA 540AGTTTATTCAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTA 600ACTTCCAA608
将菌种TMl 10518进行培养，测定其产截短侧耳素的效价
I、所用培养基
PDA培养基(g/L) :土豆200，葡萄糖20，琼脂20，水余量，pH 6.5。种子培养基(g/L):葡萄糖50，酵母提取物 15，MgSO4 O. 5，Ca(NO3)2 O. 05，KH2PO4I，水余量，pH 6.5。
发酵基本培养基(g/L):葡萄糖50，玉米浆粉20，MgSO4 O. 4，CaCO3 1，豆油4，水余量，pH 6. 5。2、培养条件
将菌株接种于PDA斜面活化，25°C培养7d，将活化的TM110518菌种接种到种子培养基中，25°C、200 r/min条件下振摇培养7d，得一级种子液，将一级种子液以10%的接种量转入种子培养基中，按相同条件培养3 d，得二级种子液，将二级种子液按10%的接种量转入发酵培养基中，25°C、200 r/min条件下振摇培养9 d，得发酵液，取发酵菌液10mL，加入10mL甲醇混匀，25°C振荡提取24 h，4°C离心，上清液供HPLC检测。3、产物检测
检测仪器岛津LC-20AT高效液相色谱仪.固定相ODS C18反相柱(5ktm，4.6 lnrnX250 lnrn),流动相为磷酸甲醇=45 :55,检测波长205 nm,流速1 mL / min,进样量20 L (发酵产物在此条件下保留时间17. 314).根据截短侧耳素标准曲线(Y=4. 310856e-007X，R=0. 9994)计算发酵液中产物含量为13mg/ml。从初步检测可以看出，本发明筛选菌种产截短侧耳素的效价比现有技术中报道的要高的多，适于工业化大生产。进一步的,发明人采用亚硝基胍和紫外线对菌种斜盖伞(Clitopilus prunulus)TM110518进行复合诱变获得菌种斜盖伞(Clitopilus prunulus) TM110519。该斜盖伞(Clitopilus prunulus) TM110519菌种也进行了保藏，保藏号为CGMCC NO. 6094，保藏日期为2012年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。采用上述评价菌种TM110518的方法对菌种TM110519的产截短侧耳素能力进行检测，HPLC检测发酵液中产物含量为17mg/ml。从此可以看出，诱变后的新菌种TM110519的产截短侧耳素的能力更高，截短侧耳素产量提高20%以上，更加适合工业化大生产。菌种发酵产截短侧耳素与其内部的代谢途径有很重要的联系，发明人经分析，得斜盖伞(Clitopilus prunulus)属菌株的代谢途径如图I所示。从代谢途径中可以看出，
6-GGPP合酶和8-倍半萜合酶是截短侧耳素产生的关键酶，他们的变化对截短侧耳素的产量有很重要的影响。发明人对这两种酶的基因进行了提取、分析，进一步的研究确定其对截短侧耳素的影响。基因提取方法为
①RNA抽提用QIAGEN公司的真菌RNA抽提试剂盒分别提取生长于固体平板上的TM110518菌株和TM110519菌株，将干燥后的RNA溶解于DEPC (焦碳酸二乙酯)处理水中。将总RNA作适当稀释后，分光光度计测0D260/0D280的比值，并定量。定量公式RNA浓度(μ g/ml)=0D260值X 40 X稀释倍数(本实验为400倍)。②逆转录
按下列顺序在I. 5ml离心管中加入下列反应物(体积为12. 5ul)
DEPC 水(8-χ)μ1
RNA 酶抑制剂(50U/ul，Invitrogen)0. 5 μ I
随机引物(50pM/ul, Invitrogen Co. )2 μ I
RNAX μ I (2ug)
注总RNA体积与DEPC水的总体积是8 μ 1，其中RNA的量是2 μ g ;在65 °C水浴处理5min ；
室温放置lOmin，高速(高于5000g)离心5秒；
按下列顺序加在I. 5ml离心管加入下列反应物(加入之后总体积为20ul)
RNA 酶抑制剂(50U/ul)O. 5μ I
5 X buffer(invitrogen)4 μ I
dNTP MIX(10mM/each，宝生物工程(大连)有限公司)2μ I
DTT (二硫苏糖醇)2 μ I
AMV (逆转录酶，200U/ul)I μ I 水浴40°C下反应I小时；
90°C 处理 5-10min ；
冰浴5min ；
闻速(闻于5OOOg)尚心5秒。③PCR扩增目的条带
序列与引物设计序列参照Gene Bank数据库中各目的基因的序列，引物由ABI公司的 Primer Express Software v2. 0 设计，由 invitrigen 公司合成。


本发明公开了6-GGPP合酶、8-倍半萜合酶、截短侧耳素高产菌株及菌株的应用，本发明通过筛选和诱变得到了2株截短侧耳素高产菌株，并提供了对截短侧耳素产量有重大影响的GGPP合成酶和倍半萜合成酶的基因序列，明确了菌种产截短侧耳素升高的原因，为进一步提高截短侧耳素的产量提供了新途径。这两种菌株生产截短侧耳素的能力均比现有技术中公开的菌种强，且通过对发酵条件的进一步选择和优化，使截短侧耳素的产量明显增加，符合工业化大生产的需要，降低成本。