专利名称：动脉粥样硬化和冠心病的诊断和治疗的制作方法图1显示hHSP60的剂量依赖性的补体激活。人HSP60和正常人血清(NHS；实心方块)或和热灭活人血清(HIHS；实心圆)一起保温。与hHSP60结合的C4b的量用抗C4b抗体测定。未涂覆的对照平板和NHS(空心圆)或和HIHS(空心三角)一起保温。该图显示四个平行测定的平均OD值和标准偏差。来自于全部三个重复试验的一个代表试验的结果被列出。发现指示(**)的情况与未涂覆的对照平板相比，C4b的结合有显著性的增加(斯氏t检验，p＜0.01)；图2显示无丙种球蛋白血清(AGS)中hHSP60的经典途径激活的缺乏。人HSP60(0.1μg/ml)和NHS或两种不同的AGS一起保温。与平板结合的C4b的量用抗C4b抗体测定。未涂覆的孔被用作对照。AGS+IgG代表和抗体(5％热灭活血清)重组的AGS。来自于全部两个重复试验的一个代表试验的结果被列出。发现指示(***，p＜0.0001；*，p＜0.05)的情况与未涂覆的对照平板相比，C4b的结合有显著性的增加(斯氏t检验)；图3显示了(图A)抗hHSP60抗体水平和与hHSP60结合的C4b的量之间的相关。在抗hHSP60抗体水平和与hHSP60结合的C4b之间观察到高显著性(r＝0.459，p＜0.0001)正相关。图B显示在抗牛分枝杆菌HSP65抗体水平和与hHSP60结合的C4b的量之间相关性的缺乏(r＝0.1068，p＝0.554)。通过使用在各平板上测试的8个单独血清的结果作为标准，实现了在不同平板获得的结果的归一化。图4显示通过竞争性ELISA获得的抗hHSP60和抗牛分枝杆菌HSP65抗体之间的差异。用hHSP60(左图)或用牛分枝杆菌HSP65(右图)涂覆ELISA平板，并和患者血清的系列稀释保温。IgG型的抗体和平板的结合被进入保温混合物中(缓冲液被加入到对照样品中，实心方块)的5μg/mlhHSP60(空心圆)或HSP65(虚线)阻断。来自于全部三个重复试验的一个代表试验的结果被列出。数值代表三个平行试验的平均值和SEM OD值；图5显示对因为家族史原因而危险的儿童冠心病易感性预测的研究的结果。Y轴显示了补体激活指数。X轴显示了两套中值数据，包括对照儿童的数据(中值0.58，四分位间范围(interquartile range)0.33-1.07)(左边的数据)以及危险儿童的数据(中值＝1.27，四分位间范围0.53-2.33)(右边的数据)。用Mann-Whitney检验的结果p＝0.0002。试验试验如下面详细描述进行且结果显示i) hHSP60能够通过抗HSP60抗体诱导补体级联的激活；ii) 在hHSP60诱导的补体激活和抗HSP60抗体之间存在相关；以及iii)在抗HSP抗体系列中，不和其它HSP60蛋白交叉反应的是hHSP60特异性抗体，其通过与hHSP60相互作用引起补体级联的激活。该结果表明患者血清中的抗hHSP60抗体(即不和其它HSP60蛋白交叉反应的)的水平和因为动脉粥样硬化引起的冠心病的正相关。另外的独立进行的研究表明本发明的试验给出在补体激活抗hHSP60抗体和冠心病事件中的强烈相关，第二和第三三分位数(tertile)的让步比(odds ratio)为5.24和6.37。同时用来自其父母或祖父母在45岁前患有心肌梗塞的健康儿童的样品进行研究。结果表明产生高水平补体激活抗hHSP60抗体的能力是与成年时冠心病发病的高易感性有关的遗传性状，因此是特别有用的幼年诊断。定义术语“抗体”在本文中被用于指免疫球蛋白分子和免疫蛋球白分子的免疫活性部分，即含有抗体结合部位或抗原互补位的分子。这样的分子也被称为免疫球蛋白分子的“抗原结合片段”。抗体分子的实例是完整免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的那些含有抗原互补位的部分，包括本领域已知为Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)的那些部分。“治疗”是被设计用来治愈、缓解、消除或减轻人或动物体的症状，或者预防或降低人或动物体感染任何疾病或功能障碍的可能性的治疗。实施本发明的形式此外，固相重组hHSP60能够激活合并的正常人血清以及冠心病患者血清中的补体系统。由于第一补体成分被Mg2+EGTA阻断的C4激活和结合抑制，以及具有纯合C2缺乏患者的血清中没有出现C3与hHSP60的结合，因此可以推断hHSP60通过CP激活人血清中的补体。
CP可以被不同的物质直接激活或用特异性抗体的贡献，即通过免疫复合物的形成被激活。在hHSP60的情况中，由于在无丙种球蛋白的血清样品没有观察到补体激活，CP的引发看起来是通过免疫复合物的形成而发生的。
本发明的发现表明抗hHSP60的特异性抗体引发，并且剂量依赖性地促进通过hHSP60进行的补体激活。
此外，抗IgG抗体(类风湿因子)同样可能影响这种激活。并且，分枝杆菌HSP65同样被发现激活CP，但这种激活的程度与抗HSP60或抗HSP65抗体的水平不相关。由于抗HSP65和抗幽门螺杆菌抗体彼此相关(Birnie，D.H.等，1998年，如前所述)，进行了试验以确定是否抗H.pylori抗体的量和HSP65诱导的补体激活程度相关。发现与HSP65结合的C4b的量和在CHD患者血清中抗H.pylori抗体水平间有强烈的正相关。另一种对HSP65诱导的CP激活和抗HSP65抗体水平之间缺乏相关性的可能的解释有可能是抗HSP65抗体的不同的(补体非激活)亚型。
这些发现表明当暴露于hHSP60与特异性抗体的复合体时，补体系统可能被有效激活。不同的病理症状和紧张状况都可能明显地增加内皮细胞中hHSP60的表达(Wick，G.等，1995年，Immunol.Today，第16卷第27页；Xu，Q.和Wick，G.，1996年，Mol.Med.Today，第2卷(9)第372页)。例如，非毒性的局部缺血再灌注被发现产生能够激活人血清中补体系统的人体脐静脉内皮细胞(Collard，C.D.等，1997年，Circulation，第96卷第326页)。这一过程的机理还没有完全被了解。然而，本结果表明在内皮细胞表面hHSP60的过度表达可能是提高培养的内皮细胞补体激活能力的因素之一，特别是在抗HSP65抗体的高滴定度存在时。由于补体激活在动脉粥样硬化形成的早期和晚期都具有重要的作用，本发现具有重要的病理学意义。
假定的抗HSP65抗体在冠心病的发展中的作用被最近的几个发现所支持。Xu等(1993年，如前所述)发现高水平的抗分枝杆菌HSP65抗体与颈动脉粥样硬化有关。更近地，Hopplicher等(1996年，如前所述)测得114个患有冠心病的患者具有与76个年龄和性别相当的健康对照相比明显升高的抗HSP65滴定度。类似地，Birnie等(1998年，如前所述)验证了在冠状动脉粥样硬化的程度和抗HSP65抗体的滴定度之间的正相关。
抗hHSP60和抗HSP65抗体在它们的抗原识别和补体激活能力之间的差异的验证非常重要，并且在以前没有被提出。与健康的受检者相比，60kDa族的热激蛋白的抗体在患有几种疾病的患者体内升高。如果抗卡普拉黄素族不同成员的抗体被平行测量，通常(但不总是(Handley，H.H.等，1996年，Clin.Exp.Immunol.，第103卷第429页))在它们的量之间发现强烈的相关。已经发现在HIV患者的血清中抗HSP60和抗HSP65抗体水平之间存在显著性的相关。
全部256个柠檬酸盐血浆样品如下面详细介绍地进行分析。对每一个取自某病例的样品，即患有冠心病的患者，从没有心脏问题迹象的患者中选择两个样品。
·56个样品与110个对照取自事件发生前的病例。
·33个样品与66个对照取自事件发生后的病例。
所有的样品均取自中年男性，并且病例和两个对照样品是年龄匹配的。取样后，样品立即进行离心并在-45℃冷冻，然后在用干冰运输到MRC单元。血浆然后在-80℃存贮并且仅在用于此评价时解冻。本试验的实际测试为盲试，直到测试全部完成才开始分析。1.试验原理将纯化的人重组HSP60蛋白涂覆在微滴孔表面。然后施加样品。抗hHSP60抗体和孔中的抗原复合。未结合的物质被洗去，加入过氧化物酶缀合的抗C4b。如果抗体已经结合并激活补体级联，C4b缀合物将与共价结合在抗原上的C4b片段结合。未结合的物质再次被洗去。加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)后，仅在酶存在的那些孔中有颜色出现，表明人C4b的存在。然后通过加入硫酸终止酶促反应并在450nm测量吸光度。2.材料
HSP60(www.stressneg.com)是从人早幼粒细胞白血病(HL-60)的cDNA文库克隆的重组hHSP60。平板涂覆将50μl在0.05M，pH为9.6的碳酸盐缓冲液中的1μg/mlhHSP60加入到每个孔中，并在4℃保温过夜。然后在将平板阻断之前用200μl的1％明胶、5％蔗糖、0.15MnaCl、0.05M的Tris以及0.1％吐温20洗涤，并在液体除去前在RT(室温)保温1小时，平板在37℃干燥过夜。阴性对照0.05Mtris、0.15MnaCl、5％明胶，pH7.5低阳性对照低阳性对照包括在0.05M Tris、0.15M NaCl、5％明胶，pH7.5中的约1/500的稀释兔抗hHSP60。缀合物在稳定酶缀合物稀释剂中的约1/500稀释的C4b蛋白的异双功能HRP缀合物。低阳性对照还含有约1/60000稀释的山羊抗兔HSP缀合物。洗涤缓冲液0.05M Tris、0.15M NaCl、0.1％吐温20，pH7.5。终止溶液0.2％硫酸。测定试剂盒
试剂制备洗涤缓冲液使用1份洗涤缓冲液浓缩物和19份蒸馏水稀释浓洗涤缓冲液。为每8个孔条(well strip)，通过加入4ml浓缓冲液到76ml蒸馏水中制备80ml稀洗涤缓冲液。3.测定步骤1.在开始测定前使所有的试剂盒成分和测试样品达到室温(20℃到25℃)。
2.试剂盒对照应与每批样品一起展开以检验试验性能。试剂盒对照应该平行两份展开。为包括试剂盒对照在内的要测试的样品数目选择足够的微孔条。将条放置在框上，并除去保护塑料密封膜。在提供的EIA数据记录纸上记录试剂盒对照和测试样品的位置。未使用的条应该被存贮在带有干燥剂的可重新密封的箔袋中，其在置于2℃到8℃存贮前被替换。
3.不稀释对照或测试样品，将50μl样品或对照血清(试剂2、3)分散到适当的孔中。对照应该最后加入以确保结果的精确解释。轻轻摇动5秒钟。用提供的平板盖盖上平板，然后在RT 20℃到30℃将其放在吸水纸上20分钟。
4.在保温周期结束时，移去平板，留下吸水纸，然后如下面描述洗涤平板。
5.如在试剂制备部分描述的那样稀释洗涤缓冲液(试剂5)。用稀洗涤缓冲液手动或用自动平板洗涤器洗涤平板三次。对于机器洗涤，确保每个孔分散300μl且将适当的消毒剂加入到废液收集瓶中。洗涤完毕，通过在吸水纸上轻敲倒置的平板除去过量液体。
对于手动洗涤，通过仔细地将内容物清空到含有适当的消毒剂的容器中洗涤孔，然后将孔置于废液容器中。再重复该过程两次。洗涤后，通过在吸水纸上轻敲倒置的平板除去过量液体。必须记住对试验用血清的潜在生物危害采取适当的预防措施。这些预防措施必须贴在实验室的公共区域。洗涤步骤很关键，因为不充分的洗涤会导致差的精确度和错误升高的吸光度。
6.在每个孔中分散100μl缀合物(试剂4)。在将盖放到平板上并放回保温器之前，轻轻地摇动平板5秒钟，确保平板被放置在吸水纸的顶部。在RT 20℃到30℃保温60分钟。
7.在保温周期结束时，重复步骤4以及步骤5中描述的洗涤步骤。
8.在每个孔中分散100μl稳定化的TMB底物(试剂7)。在将盖放回到平板并在室温(20℃到30℃)置于黑暗中15分钟之前，轻轻地晃动平板5秒钟。
9.通过加入100μl终止液(试剂8)到每个孔中终止反应。这将导致在含有酶的孔中颜色从蓝到黄的变化，该现象表明补体激活的存在在。在空气将平板读数器清除。在终止反应后立即测定每个孔在450nm的吸光度。4.结果的计算和解释对每一个试验和对照，测定孔中获得的OD。试验有效性对有效的试验结果，低阳性对照的平均OD值应该大于0.3。
显示阳性结果的OD水平，即补体激活抗hHSP60抗体的显著水平，可以预期在样品群之间变化，例如在成年和幼年群体之间。例如，在一个群体中被认为是阳性的结果可能在另一群体中并不重要。因此，对被研究的群体建立了标准曲线，该曲线将OD与实际危险相关并定义了结果被认为是阳性的截断值。
为了在各个试验间进行比较，必须计算补体激活指数(CAI)CAI＝样品的OD/低阳性对照的平均OD低阳性对照的平均OD的使用允许不同系列试验，例如使用不同的设备之间的结果的标准化。5.结果在采集原始数据后进行下列统计分析。在病例和对照中的补体激活指数结果如表3.1所示。将外露层(outlier)从对照中除去。条件对数回归分析优势比(OR)为在log CAI中的1 sd增加(0.94)。
这等价于CAI的2.6倍增长。
数据如表4所示。事件发生的时间56个病例在他们的事件发生前取样。在33个病例中，在事件发生后取样。
与事件发生的时间有明显的相互影响(p＝0.007)。在事件发生取样的病例中，CAI显著性地增加，而这种关系在事件发生后取样的病例中没有被发现。事件发生前的样品事件发生前所取样品的数据如表5所示。事件发生后的样品事件发生后所取样品的数据如表6所示。
在那些事件发生前取样的病例中，没有证据表明该关系根据事件的近似性而变化(p＝0.65)。6.等分分析通过等分进行的CAI分析表明该关系是非线性的，仅在最低等分中危险降低。CAI等分的截断点为0.27和0.6。同样存在与事件发生时间的显著性相互影响(p＝0.007)。
所有的等分分析中的结果如表7所示。事件发生前的样品的等分结果如表8所示，而事件发生后的样品的等分结果如表9所示。
在补体激活指数嵌套的(nested)病例-对照研究中的单变关系如表10所示。补体激活指数对事件发生前所取的样品，补体激活指数的等分和病例/对照状态之间的关系在对吸烟状况、心收缩压、胆固醇、甘油三酸酯、纤维蛋白原以及体重指数的调整后依然保持(P＝0.003)。
相对于等分1，等分2和等分3的让步比分别为5.24(1.50-18.26)和6.37(1.80-22.58)。
全部模型如表11所示。该分析使用155个观察-53个病例和102个匹配的对照。让步比在除吸烟和抗体指数的变量中提高了1 sd。甘油三酸酯和纤维蛋白原用对数变换。
在模型中单独使用补体激活指数的等分，ROC(接受器工作特征)曲线下的面积为0.65。7.结论数据表明由本发明的试验测定的补体激活指数(CAI)与患冠心病的危险强烈相关。这如表8所示。
表10表明胆固醇、吸烟、纤维蛋白原和心收缩压同样与这些男性的危险相关。
表11是对这些危险因素的独立关系的强度的多变量分析。从该表中的p值和95％置信区间可以看到仅该试验与危险独立相关。与具有分布中低部三分之一水平的男性相比，中部三分之一的男性的危险为5.2倍，而高部三分之一的男性的危险为6.4倍。
在本评价中，所使用的试验试剂盒因此被认为对冠心病危险具有高预测性。
分析了总共117个样品。
危险儿童-64个年龄在10到16岁之间的健康儿童，他们的父母或祖父母中至少有一个在45岁以前患有心肌梗塞。
对照-53个年龄匹配的健康儿童，他们在选择性外科手术前或受到外伤后被随机选择。这些对照并不完全充分，因为他们中仅有一部分被问及家族史，因此不能排除这组中同样含有危险儿童。因此预期当危险儿童与正确的对照，即那些被证明阴性冠心病家族史的儿童相比时，结果(下面)中显示的差异将更高。
血清样品在测试前在-70℃保存。1.试验原理—如前所详述的。2.材料—如前所详述的。3.试验过程—如前所详述的。4.结果的计算和解释—如前所详述的。5.结果在采集原始数据后，进行下列统计分析。
危险儿童的让步比(OR)通过使用在对照组中测定的两个单独的75％和95％的截断限计算。这给出分别使用补体激活指数(CAI)1.07和2.0的截断值。
数据在表12和13以及图5中给出。
该结果表明危险组的儿童与对照组的儿童相比给出显著性高的结果。7.结论数据表明在本评价中，产生高水平补体激活抗hHSP60抗体的能力是与在成年时冠心病发病的易感性升高相关的遗传性状。
这意味着在本发明的试验中的高水平结果对那些在其它方面完全健康的幼年患者患这种疾病的易感性是指示性的。


本发明涉及人HSP60(热激蛋白60)在人的治疗或诊断方法中的新用途,更特别地,本发明涉及诊断试验方法、诊断试剂的生产以及用于因动脉粥样硬化而患有血管疾病的患者的诊断试验试剂盒,这些患者倾向于热激蛋白诱导的补体激活,例如,患有心肌疾病如冠心病。