一种有效抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药复方及其提取方法[0002]猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，是由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)引起猪的以繁殖障碍和呼吸道症状为主要特征的一种高度传染性疾病。该病既能垂直传染又能水平传播，能够引起妊娠母猪发热、厌食、流产、早产、木乃伊胎、弱仔及诱发仔猪和育成猪的多种呼吸系统疾病。1996年郭宝清等人确定了其在我国的存在，PRRS具有传播迅速、流行广泛和毒株变异能力强的特点，该病对养猪业造成严重威胁和巨大经济损失，防治主要靠疫苗预防，目前尚无有效药物，其综合防制有很大难度。近年来，中草药的扶正培本、调整机体阴阳失衡、增强免疫力方面越来越得到医学界的关注和重视，研究表明，中草药能够直接或通过调节机体免疫力影响病毒的复制，对病毒性疾病的预防和治疗有较好的作用，而且具有毒副作用少、残留低、资源丰富等优势。本发明主要针对猪繁殖与呼吸系统综合征防治问题，选取具有清热解毒、活血化瘀或固本解表等功效的16种中药，如:鱼腥草、菊花、山银花、知母、桂枝、麻黄、赤芍、柴胡、贯众、大青叶、桅子、薄荷叶、牡丹皮、水牛角、千里光、地胆草等，研究它们在体外抗PRRSV的作用。在此基础上筛选、确定本发明所述的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药复方。
[0003]本发明的目的是提供一种有效抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药复方及其提取方法。[0004]一种用于抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药复方，其特征在于，包含如下药物及其重量份:夏枯草3重量份、鱼腥草2重量份、柴胡2重量份、芦根I重量份。[0005]具体实施中，一种用于抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药复方，按照配制8克中药复方为标准，包含如下药物及其重量份:夏枯草3/8重量份、鱼腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和芦根1/8重量份。[0006]所述的复方是指所含的中药种类及其中药在复方中药中的比重。[0007]所述的重量份是指复方中各种药物占整个复方的重量比例。
[0008]作为本发明的另一目的，还包括一种用于抗抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药复方的提取方法，采用水煎煮方法进行粗提，具体步骤是:
(1)按夏枯草3/8重量份、鱼腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和芦根1/8重量份称取各中药，组成8g中药复方；
(2)按照步骤(1)的配方称量配方药，水浸泡lh，浸泡加水量为中药复方重量的4倍，然后再加入中药复方重量的 4倍的水量，煎煮20-30min，过滤得第一次煮液；再加入中药复方重量的5倍的水量，煎煮20min，过滤得第二次煮液。
[0009](3)合并2次煎液，于烧杯中加热蒸煮，定容至20ml，每毫升相当于0.2g生药；
(4)置凉，用离心机以转速为3000r/min离心10min，取上层清液存200ml容量瓶中，用
NaHC03溶液调pH值至7.0，经高压灭菌分装于4°C保存备用。
[0010]本发明采用的中药复方成分及其中药特性和在本发明中起到的作用如下:
本发明采用的夏枯草:性寒，味甘、辛、微苦，具有清泄肝火、清火明目、散结消肿、清热
解毒、祛痰止咳、凉血止血的功效。
[0011]本发明采用的鱼腥草:性微寒，味苦，归肺经、膀胱、大肠经。具有清热解毒、利尿通淋的功效。我们前期 研究证实:鱼腥草具有明显的抗猪繁殖与呼吸病毒的阻断作用。
[0012]本发明采用的柴胡:味苦，性微寒，归肝、胆经。具有透表泄热、疏肝解郁和升举阳气的功效。我们前期实验证明:柴胡对猪繁殖与呼吸病毒具有明显的阻断、杀灭和抑制作用。
[0013]本发明采用的芦根:性甘、寒。归肺经、胃经。具有清热生津、除烦、止呕和利尿等功效。

[0014]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0015]一种用于抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药复方，包含如下药物及其重量份:夏枯草3重量份、鱼腥草2重量份、柴胡2重量份、芦根I重量份。
[0016]所述的复方是指所含的中药种类及其中药在复方中的比重。
[0017]本申请书所述的重量份是指复方中各种药物占整个复方的重量比例。
[0018]下述实施例中所用实验材料如下:
(一)细胞与病毒
细胞:Marc-145细胞，由华南农业大学兽医微生物学与免疫学实验室惠赠，按常规方法传代、培养；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)由华南农业大学兽医学院惠赠。
[0019](二)主要试剂
胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养液均为HyClone产品；二甲基亚砜(DMSO)购自GIBICO公司；噻唑蓝(MTT)为SIGMA产品，以无Ca2+、Mg2+的PBS液配制成5mg/mL，过滤除菌分装，-20°C避光保存备用。
[0020](三)中药的提取
采用水煎煮方法进行粗提，具体步骤是:
(1)按夏枯草3/8重量份、鱼腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和芦根1/8重量份称取各中药，组成8g中药复方；
(2)按照步骤(1)的配方称量配方药，水浸泡lh，浸泡加水量为中药复方重量的4倍，然后再加入中药复方重量的4倍的水量，煎煮20-30min，过滤得第一次煮液；再加入中药复方重量的5倍的水量，煎煮20min，过滤得第二次煮液。
[0021](3)合并2次煎液，于烧杯中加热蒸煮，定容至20ml，每毫升相当于0.2g生药(SP200mg/mL)；
(4)置凉，用离心机以转速为3000r/min离心10min，取上层清液存200ml容量瓶中，用NaHC03溶液调pH值至7.0，经高压灭菌分装于4°C保存备用。
[0022]实施例1中药复方对Marc-145细胞安全浓度和猪繁殖与呼吸综合征病毒的半数毒性浓度(TCID50)的测定
1.中药复方对Marc-145细胞安全浓度的测定
取Marc-145细胞长成单层的96孔培养板，弃原液，PBS洗涤I次，以DMEM完全培养液对中药原液作2倍倍比稀释至第10孔，每孔100 μ L，第11、12孔为细胞对照，各稀释度重复4孔，37°C、C02培养箱培养至72h，每天观察细胞的形态变化及生长状况。72h后弃去培养液，以PBS液洗涤I次，加入MTT液20 μ L/孔，37°C继续培养4h后弃MTT液，加入DMS0150 μ L/孔，恒温振荡IOmin待结晶全部溶解,490nm波长下测定OD值。
[0023]根据公式以OD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率=(细胞对照组OD值-药物组OD值)/细胞对照组OD值，并结合CPE观察结果来判断复方中药毒性的大小，当生长抑制率为O则表明该中药对细胞无毒性作用，结合复方中药的起始浓度，来确定其最大安全浓度。
[0024]2.猪繁殖与呼吸综合征病毒的半数毒性浓度(TCID50)的测定
将待测病毒按10倍比系列稀释至10-10，按100 μ L/孔的剂量加入长至单层Marc-145细胞的96孔板，最后2列作细胞对照组，各组重复8孔，370C吸附1.5h后弃病毒液，各孔加入DMEM维持液100 μ L, C02培养箱37°C培养。
[0025]每天观察细胞病变作用(CPE)，72-96h后，以MTT法测定各孔OD值。根据下述公式计算:病毒对细胞的生长抑制率=(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)/细胞对照组OD值。采用Reed-Muench两氏法，计算病毒的半数毒性浓度(TCID50)，即距离比例=(高于50%的细胞生长抑制率-50%) / (高于50%的细胞生长抑制率-低于50%的细胞生长抑制率)。Log2TC50=距离比例X稀释度对数之间的差+高于50%细胞生长抑制率的对数。
[0026]3.数据处理
用SPSS19.0软件进行统计分析，先计算各中药不同浓度下的平均OD值(以X (—)土S.E表示),根据公式计算对细胞的抑制率或保护率。
[0027](I)复方中药对细胞的安全浓度
根据公式以OD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率，并结合CPE观察结果来判断复方中药毒性的大小，当生长抑制率为O则表明该中药对细胞无毒性作用，结合复方中药的起始浓度，来确定其最大安全浓度(结果见表1)。