一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法及其应用的制作方法[0002]恶性胶质瘤作为神经系统中发病率最高的恶性肿瘤，在过去的10年里，即使经历了手术、放射和化学治疗的较大进展，其中位生存期也仅由10个月提高至14个月，并且在针对胶质瘤的多个大型、多中心的新药试验中，都未能取得令人满意的结果，绝大多数的药物在二期临床试验中折戟沉沙，未能体现出与体外试验时相一致的结论。这种体外试验与临床结果不相符的情况在抗胶质瘤治疗研究中普遍存在，预示着目前对于恶性胶质瘤的发病机制、发展特性及抗药机制的认识还有很多的空白，抗恶性胶质瘤肿瘤药物体外试验方法存在着进一步改 进的空间。[0003]近年来肿瘤干细胞的发现及研究进展，也为胶质瘤复发、转移及治疗抵抗等关键机制以及在此基础上研发诊疗新技术打开了新的视野，且越来越成为胶质瘤研究领域的热点。胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)因其自我更新、多向分化和对治疗抵抗的能力，是维持肿瘤恶性生长和复发转移的“种子细胞”，因此以GSCs为主要靶向的抗胶质瘤治疗研究也成为抗胶质瘤治疗的新兴重点方向之[0004]那么进行靶向GSCs治疗的研究首先就要求我们有一个针对GSCs进行体外培养的技术以及在此技术之上进行不同于传统的药物学试验方法。在我科以往的抗肿瘤新药研发中，我们主要按照传统的肿瘤药物体外试验方法，即以检测单层培养细胞对药物的反应来进行。该方法由美国国家癌症研究所(NCI)于上世纪八十年代创建，但在临床应用中，常发现体外试验敏感的药物效果与患者体内实体瘤临床评估的药效偏差较大。既有研究表明，这至少部分是由于单层培养的体外细胞生长丧失了三维空间结构，无法相对真实地反映体内肿瘤细胞的病理生理结构、生长状态以及相对耐药耐辐射的肿瘤干细胞水平。[0005]进入GSCs研究时代以后，目前最常用的GSCs体外培养方法是由1992年ReynoldsBA等人在从鼠纹状体进行神经干细胞的分离培养中发明的无血清悬浮培养法。该培养方法的特点为:无血清、添加高浓度生长因子的培养液，以及低黏附性培养环境。其优势为:可以比较简单、直观地从细胞层面上体现单个细胞的自我更新及分化能力；但缺陷也很明显:除了成球培养重复性较差，细胞球内难以观测等，更重要的是其与体内环境大相径庭。它无法迁移运动，由单细胞分裂成球而来，无法体现细胞与基质的作用，长期传代成功率极低，而体内肿瘤干细胞绝非悬浮状态，不可运动，其粘附于由其他细胞和基质支持组成的特殊微环境，即特定的“干细胞龛”内，也可以接触到血清成分。[0006]目前应用在制备3D细胞培养的主要材质包括:1.天然有机物:胶原、壳聚糖、葡萄糖氨基聚糖类、藻酸盐、丝心蛋白、琼脂糖、淀粉；2.无机大分子聚合物:PGA(聚乙醇酸)、PLA(聚乳酸)、PLC(聚己内酯)、POE (聚原酸酯)及其多相聚合支架如PLGA等。[0007]因此，目前继续一种新型的胶质瘤干细胞培养方法，以真实地反映体内肿瘤细胞的病理生理结构、生长状态以及相对耐药耐辐射的肿瘤干细胞水平。

[0008]本发明的目的是提供一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法，所述三维培养方法可为细胞提供良好的粘附与迁移环境，并具有良好的生物相容性、机械强度、降解系数和低免疫原性。利用三维细胞培养这种方法将有效的避免不必要的临床Ι、π期试验，从而减少病人资源和后续研究资金的浪费。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0010]一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法，利用三维胶原支架，并摸索出适宜的低血清培养浓度，所述培养方法包括以下步骤:
[0011]1)将三维胶原支架切割成的立方体，使用前Co60照射消毒过夜，4°C干燥环境储存备用，待接种细胞前，以细胞培养液浸泡预处理12小时；
[0012]2)将胶质瘤细胞株消化离心至单细胞悬液，再用PBS洗净2遍，以去除血清成份，并进行细胞计数，以每个三维胶原支架I X IO4~5 X IO4个细胞的密度将胶质瘤细胞接种于步骤I)处理后的三维胶原支架上，静置4小时，待细胞有效粘附于支架上后，置于细胞培养板中培养，每2日更换I次培养液，即得到3D胶质瘤细胞模型。
[0013]进一步的，步骤I)中所述的细胞培养液为添加I %胎牛血清的DMEM。
[0014]进一步的，所述三维胶原支架的平均孔径为50 μ m。
[0015]进一步的，所述三维胶原支架的材料为I型胶原。
[0016]进一步的，胶质瘤细胞株为U87细胞细胞。
[0017]本发明相比现有技术的有益效果是:
[0018]1、本发明中制备3D细胞培养的主要材质选用胶原，胶原是细胞外基质最主要的成分，可为细胞提供良好的粘附与迁移环境，并具有良好的生物相容性、机械强度、降解系数和低免疫原性；
[0019]2、利用本发明所述三维细胞培养，在少见恶性肿瘤的临床前药敏试验和药物筛选中，将有效的避免不必要的临床1、II期试验，从而减少病人资源和后续研究资金的浪费；
[0020]3、采用本发明所述方法培养得到的胶质瘤细胞，在三维支架微环境中可自发聚集成团块状，其细胞生长形态与二维培养细胞迥异，细胞膜表面结构较二维培养细胞含更丰富凸起样或纤毛样结构，与人体内生长胶质瘤细胞形态更接近，利于后续研究胶质瘤干细胞治疗药物；
[0021]4、本发明率先研究以三维胶原支架为胶质瘤干细胞培养的新技术，更好的模拟体内胶质瘤干细胞微环境，为进一步研发靶向胶质瘤干细胞治疗药物提供新的体外实验平台。



[0022]图1为激光共聚焦显微镜显示细胞分布情况；
[0023]图2为扫描电镜显示细胞生长形态；
[0024]图3为流式细胞术检测培养体系内肿瘤细胞生存情况。
[0025]实施例1
[0026]一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法，利用三维胶原支架，并摸索出适宜的低血清培养浓度，所述培养方法包括以下步骤:
[0027]I)将三维胶原支架切割成的立方体，使用前Co60照射消毒过夜，4°C干燥环境储存备用，待接种细胞前，以细胞培养液浸泡预处理12小时；
[0028]2)将胶质瘤细胞株消化离心至单细胞悬液，再用PBS洗净2遍，以去除血清成份，并进行细胞计数，以每个三维胶原支架I X IO4~5 X IO4个细胞的密度将胶质瘤细胞接种于步骤I)处理后的三维胶原支架上，静置4小时，待细胞有效粘附于支架上后，置于细胞培养板中培养，每2日更换I次培养液，即得到3D胶质瘤细胞模型。
[0029]进一步的，步骤I)中所述的细胞培养液为添加I %胎牛血清的DMEM。
[0030]进一步的，所述三维胶原支架的孔径为50 μ m。
[0031]进一步的，所述三维胶原支架的材料为I型胶原。
[0032]进一步的，胶质瘤细胞株为U87细胞。
[0033]实施例2
[0034]本实施例是在实施例1的基础上的优选化方案，提供了一种新型胶质瘤干细胞的三维培养方法。本实施例中与实施例1相同的部分，请参照实施例1中公丌的内容进行理解，实施例1公丌的内容也应当作为本实施例的内容，此处不作重复描述。
[0035]所述三维培养方法包括以下步骤:
[0036]常规二维培养的U87细胞消化离心后，制备成单细胞悬液，再接种于孔径约50 μ m的胶原支架上，在1%胎牛血清(FBS)+DMEM培养液条件下进行培养。观测细胞是否能与较好粘连于支架胶原基质上并生长，荧光显微镜观测转入绿色荧光蛋白(GFP)的U87细胞增殖情况，扫描电镜(SEM)及HE切片观测细胞生长形态，流式细胞术检测培养体系内肿瘤细胞生存情况(AnnexinV+PI法)，激光共聚焦显微镜三维重建法观测细胞在支架内分布情况。参见图1、图2。其中图1，A.转染GFP的U87细胞可在支架上增殖性生长；B，C，D.激光共聚焦显微镜显示细胞在支架上的分布情况，其中在64-125 μ m的范围内细胞分布较多；E.显示不同的增殖速度，3D培养的U87细胞增殖速度慢于2D单层培养的，其生长趋势较平缓；F.显示3D培养中的细胞凋亡比例高于2D培养的，这也反映了与2D培养不同的增殖特性。
[0037]本实施例中所述支架山中科院发育生物所制备提供，材质为I型胶原。所述支架请参见文献，CHEN L, XIAO Z, MENGL, et al.The enhancement of cancer stem cellproperties of MCF_7cells in3D collagen scaffolds for modeling of cancer andant1-cancer drugs[J].Biomaterials,2012,33(5):1437_44。
[0038]观测三维胶原支架培养对胶质瘤细胞干性影响:将不同方式(二维vs三维)及不同血清条件(10% vs3%vsl%vs0)培养的细胞消化成单细胞悬液后，用流式细胞术检测胶质瘤干性细胞(U87CD133+U87细胞)的比例。摸索出三维胶原支架富集培养胶质瘤干细胞的适宜条件，包括不同血清浓度培养液，不同时间段收集细胞以及与悬浮成球细胞比较等，在此基础之上寻找三维胶原支架培养胶质瘤干细胞的方法。所述适宜条件为:将支架内细胞浸没于I %胎牛血清+DMEM培养液，在37°C、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，一般收集细胞时间以5天左右。
[0039]胶质瘤U87细胞在三维胶原支架中可进行性增殖生长，但增殖速度较二维培养显著性减慢，其差异有显著性，参见图1。进一步采用HE切片和SEM观测胶质瘤细胞在三维胶原支架内生长情况可发现，胶质瘤细胞在三维支架微环境中可自发聚集成团块状，其细胞生长形态与二维培养细胞迥异，细胞膜表面结构较二维培养细胞含更丰富凸起样或纤毛样结构，与人体内生长胶质瘤细胞形态更接近，参见图2。在不同浓度下进行三维培养对胶质瘤U87细胞干性影响的观测，在1% FBS浓度条件下进行三维培养可对胶质瘤细胞干性明显提升，且干细胞比例不弱于经典的悬浮成球方法。进一步进行干性基因、耐药基因RT-PCR和western blotting的检测，发现Q)133、Sox2、Nanog等干性基因及MGMT等耐药相关基因表达均显著上调，尤其以Sox2、MGMT上调最显著，参见图3。流式细胞术显示I %血清条件下，三维胶原支架中培养胶质瘤干细胞(U87CD133+)比例上调(A10% FBS, B3% FBS, Cl%FBS，D无FBS)，该条件下，RT-PCR显示干性因子基因表达上调(E)，部分耐药基因上调，MGMT最明显(F)。Western blotting显示相关因子蛋白水平上调(G)。验证了 1%FBS+DMEM利用三维胶原支架培养胶质瘤U87细胞可上调细胞干性，富集培养干细胞，所培养的细胞同时耐药基因及蛋白上 调。