专利名称：一种水溶性蜂胶制品的制备方法及用途的制作方法 蜂胶是蜜蜂采集植物的树脂分泌物与蜂蜡等经咀嚼调制而成的一种树脂状物质。蜂胶在世界各地都有着很长的应用历史。近年来国内外对蜂胶的化学组成，生理药理作用有许多研究，发现蜂胶具有抗菌、抗病毒、抗炎症、降血脂、降血糖以及增强免疫等作用。目前，国内外的蜂胶制品基本上都是通过酒精浸提获取有效成分，但蜂胶的醇提液不易溶于水，吸收利用度低，且仍混有一定的杂质蜂蜡成分。目前，虽然有利用改变蜂胶提取液酸碱性(如发明专利97111643所公开的)，或用甘油、聚乙二醇加热浸泡蜂胶醇提物(如发明专利03141394.3、94118328.9所公开的)以及用多种表面活性剂助溶(如发明专利03150648.8所公开的)的方法来制备水溶性蜂胶。在现有技术中所得的水溶性蜂胶并公开其生理活性。在现有技术中还有使用了非天然的助溶成分以改善蜂胶的水溶性。由保加利亚Niklova等发明的水溶性蜂胶制备方法是用8％的氨基酸(L-赖氨酸)并加热来溶解乙醇或甲醇粗提过的蜂胶，获得水溶性蜂胶粉。
本发明提供一种将天然蜂胶转化为水溶性蜂胶制品的方法，特别是更为纯净的水溶性蜂胶制品，以及这种制品的用途。本发明的方法是将天然蜂胶粉碎后加入水中，经充分搅拌后进行浸泡提取，然后进行固液分离，再将固体用石油醚进行回流提取，在除去蜂蜡后，对提取液再用乙醇与丙酮混合溶液进行回流提取，其中的乙醇与丙酮可以是任意比例，将经乙醇、丙酮混合液回流提取的提取液进行蒸馏干燥处理，所得固体按每克100毫升的比例溶入L-精氨酸或者L-赖氨酸的水溶液中，其水溶液中L-精氨酸或L-赖氨酸与水的质量比为3～5％，待固体溶解平衡后滤出液体，再将溶液冷冻干燥处理。本发明的方法中乙醇与丙酮的最佳体积比为1比1，乙醇、丙酮混合液回流固体提取物最好是溶入含3％(质量比)的L-精氨酸水溶液中。本发明的制备方法中将固体溶于氨基酸中时可以将体系加热到30～80度。本发明方法所得到制品可用于制备增强记忆功能的药物。
本发明方法所得到制品可用于制备治疗老年痴呆症的药物。
采用本发明的方法制得的蜂胶制品其纯度高于现有技术，其有效成份也高于现有技术，以蜂胶中所含总黄酮含量为例，现有技术的制品其总黄酮含量(以槲皮素标准品计)一般在15％左右；而本发明中以水浸取蜂胶除去水溶性杂质(约占总质量4％)、农药残留及重金属离子；石油醚热回流除蜡(35％左右)；乙醇和丙酮热回流提取精制蜂胶(约占总质量40％)，其最终制品的总黄酮含量仍以槲皮素标准品计)可高达28.6％。另一方面，本发明区别于现有技术中加入强酸强碱来改变蜂胶溶解性的做法，可有效地富集浓缩蜂胶中包含总黄酮在内的各有效成份，并保持其天然有效成分。
实验表明本发明中采用L-精氨酸水溶液可以显著提高水溶性蜂胶制品产率。
根据对比的试验表明，本发明的制品有特殊的活性，可用于制备增强记忆的药物和治疗老年性痴呆症的药物。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。
取蜂胶原料，粉碎后加入蒸馏水中，室温下搅拌过夜；静置后过滤，滤渣转入索氏回流提取器中，先以石油醚为溶剂热回流6小时除去蜂蜡；之后以乙醇(或乙醇∶丙酮以任意比例混合溶剂)热回流提取12小时，提取液经减压蒸馏，得到精制蜂胶。
对比实验表明采用3％的L-赖氨酸水溶液溶解前述所得精制蜂胶，或者采用总量为3％的L-赖氨酸与L-精氨酸混合的水溶液时溶解前述所得精制蜂胶，可提高水溶性蜂胶制品的收率，参见表1。

因此本发明的最佳实施例应当是取前述精制蜂胶10克，加入1000毫升3％的L-精氨酸水溶液中，加热至30～80℃并持续搅拌；待溶解完全后，过滤；滤液冷冻干燥后可得36.2克褐色干粉状水溶性蜂胶制品。
本发明用于改善学习记忆功能的实例氢溴酸东莨菪碱是一种中枢神经抗胆碱能药，连续给予小鼠一定剂量的氢溴酸东莨菪碱可造成小鼠中枢神经抑制，空间学习记忆能力下降，在水迷宫测试中表现为给药小鼠通过相同训练找到水中隐藏平台的能力与正常小鼠相比明显下降，所需时间延长。由氢溴酸东莨菪碱所致小鼠学习记忆能力障碍的实验也是研究神经药物常用的行为学模型之一。
水迷宫实验取健康成年小鼠(雄性，25～30克)60只，随机平均分为6组。即正常组，损伤组，阳性对照组，精氨酸对照组，蜂胶小剂量组，蜂胶大剂量组。除正常组外，其余各组均从第一天起腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(0.1毫克/千克体重·天)，正常组则注射等体积生理盐水。每天注射开始前30分钟，给予治疗药物，正常组、损伤组灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃脑复康(临床用吡拉西坦，100毫克/千克体重*天)，精氨酸对照组灌胃L-精氨酸(100毫克/千克体重·天)，蜂胶小剂量组灌胃本发明所得水溶性蜂胶制品(50毫克/千克体重*天)，蜂胶大剂量组灌胃本发明所得水溶性蜂胶制品(100毫克/千克体重*天)。注射结束后30分钟开始水迷宫测试。测试共进行4天，测试前对每只小鼠编号标记，观察纪录其在每天的2次测试中找到水中隐藏平台的时间(以秒为单位)，取平均值作为该样本的观测数据，标准误差和方差分析则来自每组的10个样本。结果如表2显示

*方差分析是通过给药各组与损伤组相比较得到*表示p值小于0.05，差异显著；**表示p值小于0.01，差异极显著。
以上结果显示，本发明所得水溶性蜂胶制品(100毫克/千克体重)给予小鼠后，可显著改善由氢溴酸东莨菪碱所造成的小鼠学习记忆障碍，可能对老年性痴呆等症状有一定的治疗和改善作用。其效果优于吡拉西坦。本发明制品的作用可能由蜂胶中活性成分产生，也可能由蜂胶中活性成分与L-精氨酸协同作用产生。但单纯使用L-精氨酸在相关的实验中并未观察到有与本发明所得水溶性蜂胶制品相同的作用。
现代脑科学的研究表明，乙酰胆碱作为一种主要的神经递质参与哺乳动物的学习记忆活动。因此，动物脑中调控乙酰胆碱水平的重要水解酶—乙酰胆碱酯酶活性就在一定程度上反映了动物学习记忆的能力。一般而言，动物的学习记忆能力与乙酰胆碱酯酶活力在一定程度上呈负相关。现已知脑内乙酰胆碱含量与记忆密切相关，老年或痴呆病人脑内乙酰胆碱量减少。研究认为，肌碱酯酶抑制剂可延迟乙酰胆碱的代谢分解，从而延长突触后受体的兴奋。因此胆碱酯酶抑制剂被认为是一种缓解老年或痴呆病人的有效药物。
在哺乳动物的脑中，存在几个重要的部位，与学习和记忆有着密切的关系，其中位于两侧大脑半球面的结构—海马和杏仁体是记忆过程中的关键结构。而在哺乳动物的显性记忆过程中，海马起着重要的作用，海马具有显性记忆需要的可塑性。因此，检测海马和某些脑组织中乙酰胆碱酯酶水平的变化，可有效验证本发明制品改善东莨菪碱损伤小鼠学习记忆能力的生理生化机制，并与水迷宫实验所的结果相对应。
酶活性测定实验取健康成年小鼠(雄性，25±2克)12只，随机平均分为2组。损伤组灌胃生理盐水，蜂胶组灌胃本发明所得水溶性蜂胶制品(100毫克/千克体重*天)，给药后全部实验小鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(0.1毫克/千克体重*天)。连续给药四天后，处死小鼠，剥取小鼠脑组织，分离脑海马区和大脑皮层部分，组织匀浆后分别测量各部分乙酰胆碱酯酶水平及对应的蛋白含量。以每毫克脑组织蛋白能够水解特异性底物碘代乙酰胆碱(Acetylcholine iodide)从而引起光吸收(OD值)在410nm处的变化来表示酶活性的高低。
结果如表2所示

*(***表示p值小于0.001，差异极显著)。
以上结果表明，给予小鼠一定剂量本发明所得水溶性蜂胶制品(100毫克/千克体重)后，可以显著抑制由东莨菪碱引起的小鼠大脑关键记忆部位—海马区的乙酰胆碱酯酶水平的升高。这也表明本发明所得水溶性蜂胶制品可以改善健忘症小鼠的学习记忆能力，也可作为一种治疗或缓解老年性痴呆症的药物。


本发明涉及一种蜂胶中有效成分的提取方法以及这种水溶性蜂胶制品的用途。本发明的方法是将天然蜂胶粉碎后加入水中，经充分搅拌后进行浸泡提取，然后进行固液分离，再将固体用石油醚进行回流提取，在除去蜂蜡后，对提取液再用乙醇与丙酮混合溶液进行回流提取，将经乙醇、丙酮混合液回流提取的提取液进行蒸馏干燥处理，所得固体按每克100毫升的比例溶入L－精氨酸或者L－赖氨酸的水溶液中，待固体溶解平衡后滤出液体，再将溶液冷冻干燥处理。