专利名称：一株具有广谱抗菌活性和动物肠道定植能力的芦荟内生细菌的制作方法自青霉素发现以来，人们一直热衷于抗生素的研究和使用。抗生素的发现无疑是人类医学史上一次重大的跃迁，特别是在一些细菌感染性疾病的防治上。但随着时间的推移，抗生素的频繁使用使得细菌耐药性问题不断显现，在一些地区已出现了几乎耐所有现有抗生素的超级细菌，所以新型抗生素研究和开发迫在眉睫。传统的抗生素生产大多来源于一些土壤微生物发酵的次生代谢产物，近年来，植物内生菌因其来源丰富并能产生多种具有不同抗菌活性的物质，逐渐受到人们的关注。1866年DeBary最先提出了植物内生菌(endophyte) —词，当时定义的是指生活在植物组织内的微生物，与植物表面微生物(印iphyte)区别开来。当今被大众普遍接受的定义是指那些生活在健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，在其生活史的一定阶段或全部生活过程中，宿主植物不表现出外在的病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离出，或者通过DNA扩增的方法来证明。植物与其内生菌一般都是互惠共生，一方面植物为内生菌提供光合产物和矿物质；另一方面内生菌的代谢物能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。近几年不断出现许多有关植物内生菌能产生抗菌物质或其它生理活性物质的报道，其中普遍报道了植物内生菌产生的抗生素不但种类多，而且其中存在很大一部分是未开发的新物质，是研发新型抗生素的重要资源。目前有关植物内生菌在动物肠道内的定植以及基于植物内生菌的动物微生态制剂研究尚未见报道。
本发明的目的是提供一株具有广谱抗菌活性、促动植物生长活性及具有固氮作用的植物内生细菌。根据形态学特征、生理生化及分子生物学技术将其鉴定为一个类芽孢杆菌属(Paenikicillus)的新型菌株，对其生物学特性进行深入研究，确定了其生长及抗生素产生的最适条件、所产抗生素的抗菌谱及动物肠道定殖能力。本发明通过以下技术方案来实现 本发明的菌株通过以下步骤分离鉴定而来申请人人工栽培3年生中华芦荟，取其根、茎、叶三部分对其表面消毒灭菌后切片， 采用马铃薯蔗糖培养基(PDA)，经培养和纯化得到不同类型的细菌，再分别转接到PDA液体培养基上进行菌体发酵，最后通过发酵液的抑菌实验确定能产生抑菌活性物质的细菌 (Aloe-Il)0根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，通过形态学观察、生理生化特征测定和16SrRNA 序列测定分析(AC:⑶481684)，确定Aloe-Il属于类芽抱杆菌属。本发明的植物内生细菌归属于类芽孢杆菌属，命名为Paenibacillus sp. Aloe-11，保藏在 CCTCC，保藏编号 No: M 2011237，保藏日期 2011. 07. 12。VXT^Paenibacinus sp. Aloe-Il 详细描述Paenibacillus sp. Aloe-Il菌株的形态特征与生理生化特征在马铃薯蔗糖固体培养基(PDA)上，菌落生长速度最快，呈乳白色，菌落表面湿润、隆起，在培养基表面成同心圆向周围生长，随培养时间的延长，形成较大的菌落。在高氏1号培养基、查氏培养基上生长较好，与PDA上培养的菌群比较，其菌落的形态颜色差异不大，但形成的菌落隆起较PDA上高。该菌株革兰氏染色阳性或阴性，菌体为杆状，大小为0. 8X3. 2 m，产芽孢，芽孢为长卵圆形，接触酶阳性，兼性厌氧，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》归属于芽孢杆菌属，结合16SrRNA 序列测定分析，该菌为类芽孢杆菌属，拉丁文学名为/ ^^如以7ΛΛ5印.Aloe-Il0其生理生化特征如表1所示。表 1 HPaenibacilIus sp. Aloe-Il 的生理生化特征测试项目测定结果测试项目测定结果测试项目测定结果革兰氏染色+/-，杆状，0. 8X3. 2 m耐盐性(Nacl浓度)0%-4%麦芽糖+，产酸，产气鞭毛染色周生鞭毛硫化氢产生-甘露醇+，产酸，产气芽袍染色+，长卵圆形硝酸盐还原+术糖+运动性+赖氦酸+尿素+接触酶+淀粉水解+，产酸，产气蛋氦酸-氧化酶+葡萄糖+，产酸，产气鸟氦酸+明胶液化+果糖+，产酸，产气苯丙氨酸+V. P试验+乳糖+，产酸，产气“ + ”代表测试结果为阳性，“_”代表测试结果为阴性。抗菌物质最佳发酵条件=Aloe-Il发酵最适碳源和氮源分别为蔗糖和硝酸铵(一般选用PDA培养基)，发酵最佳条件为适应温度范围10°C -45°C)、200r/min发酵72h， 装液量30%，接种量5%，初始pH值为pH 7-8 (适应范围pH 4_10)。经过添加无机氮、有机氮或不添加氮源几种处理后，培养72小时。与对照相比较，添加有机氮源会抑制活性物质的产生；而有机氮源的添加量为m时的抑制效果比0. 5%更明显。而从无机氮源的影响来看，除亚硝酸钠具有抑制作用以外，其它无机氮源在一定程度上有助于活性物质的产生，尤其当无机氮源的添加量为0. 5%时，增强了活性物质的抗菌活性。发酵常用促进剂甲醇既无法作为碳源被Aloe-Il利用，也对Aloe-Il产生活性物质无任何促进作用；而表面活性剂 (Tween-80)则对抗菌活性物质的产生起到抑制作用。Paenibacillus sp. Aloe-11抗菌活性该菌株产生的次生代谢产物对病原细菌和真菌都表现出良好的广谱抗菌作用。以大肠杆菌、克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型、苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌、小麦赤霉菌、桃红粉病原菌、白菜轮腐菌、油菜菌核菌、 桃褐腐病原菌、柑橘绿霉、灰霉、腐霉、鸡支原体等病原菌为抑菌测试菌，采用管碟法、抑制菌丝生长速率法、最小抑菌浓度(MIC)测定等方法，对内生菌Aloe-Il产生的抗菌活性物质进行了抗菌谱分析。结果表明Aloe-Il产生的抗菌活性物质对金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型、苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌及所测试的植物病原真菌均有很强的抑制作用，而对大肠杆菌、克雷伯氏菌等革兰氏阴性菌和鸡支原体效果不明显。Paenibacillus sp. Aloe-Il的固氮和促生长作用该菌在固氮菌分离培养基阿
须贝氏(Ashby)培养基上生长较好。把该菌与另一种能分解琼胶的菌混合后在无其它碳源
(仅含琼脂)和氮源的琼脂平板上进行培养，结果发现两种菌都生长的非常好，而单独在该培养基中都不生长。通过对该菌株全基因组的序列测定(基因组序列号AGFI00000000) 和基因比对分析，发现该菌株存在一系列能编码与利用无机氮和促植物生长功能相关蛋白的基因。Paenibacillus sp. Aloe-Il在动物肠道中的定植该菌能产生纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶等多种酶。通过对小鼠和雏鸡饲喂Aloe-Il菌的PDA发酵液发现，该菌在其各自的小肠中有大量定殖，在断喂该菌15天以后还能在其肠道检测到该菌，饲喂该菌后能显著提高饲料中纤维素的利用。


图1为Aloe-Il菌体(10 X 100)的形态特征图2为抗菌活性物质对杆菌绿霉的抗菌情况图3为抗菌活性物质对桃褐腐病原菌的抗菌情况图4为抗菌活性物质对桃红粉病原菌的抗菌情况图5为抗菌活性物质对油菜菌核菌的抗菌情况
本发明的优点是从芦荟中分离获得的一株内生菌All (I^enibacillus sp. Aloe-11)，其次生代谢产生一些具有广谱抗菌和促进生长等功能的活性物质，同时该菌还具有固氮和在动物肠道内定植的作用，所以本发明可以用来研发新型抗生素、促生长剂、动物微生态制剂等，具有潜在的商业开发和应用价值。

Paenibacillus sp. Aloe-Il菌株的分离纯化与鉴定
材料西南大学人工栽培三年生芦荟。培养基马铃薯蔗糖培养基(PDA)，按常规配制方法配制。内生菌的分离取芦荟的根、茎、叶分别用水冲洗干净，用75%的酒精浸泡6分钟后再用无菌水冲洗3-4次；然后用0. 1%升汞浸泡50秒后无菌水冲洗5次。晾干后用无菌刀把根、茎从中切开之后切成0. 5cm长的小块，把叶片切成长0. 8cm宽0. 5cm的薄片，把它们置入PDA固体培养基表面，28°C恒温培养，待其边缘长出菌后，挑取菌落进行纯化培养，PDA 斜面4°C保存。菌体发酵PDA液体培养基，20%装量，接种1%培养16小时的种子培养液 150r/min摇床发酵培养72小时，121°C处理15分钟，离心取上清液做下面的抑菌实验。抑菌实验打孔法。用直径0. 5cm的打孔器在倒好培养基的培养皿内打孔，表面涂布被检测指示菌悬液，孔中加入发酵液，平放于37°C (细菌作指示菌)或(真菌作指示菌)恒温培养箱中培养，观察抑菌圈大小。再将唯出现明显抑菌效果的发酵液对应的细菌接种到PDA固体培养基上，恒温培养，使其形成单个菌落，保藏备用。菌株的鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，通过形态学观察和生理生化测定，该菌株为革兰氏阳性/阴性菌、杆状、产芽孢、接触酶阳性、兼性厌氧，结合16SrRNA序列测定分析，确定Aloe-11属于类芽抱杆菌属。实施例2:最佳发酵条件的确定
活化菌从-80°C接菌到PDA斜面，培养3 后，扩大进行种子培养，从斜面中挑取一环菌种接种于PDA培养液中，28°C、200r/min振荡培养15h。活性测定发酵液121°C灭菌15min，离心取上清液，以金黄色葡萄球菌为指示菌， 采用打孔法检测上清液中活性物质的抑菌圈大小。(1)装液量对抗菌物质产生的影响按10%、20%、30%、40%、50%的装液量在IOOml三角瓶中装入PDA液体培养基，接种5%的种子培养液，28°C,200r/min摇床培养72h，通过发酵液抑菌实验测定抑菌圈大小，由此确定Aloe-Il发酵最佳装液量。(2)初始pH值对抗菌物质产生的影响将PDA液体培养基的pH值分别调节为2、 3、4、5、6、7、8、9，接种5%的种子培养液，28°C、200r/min摇床培养72h，通过发酵液抑菌实验测定抑菌圈大小，由此确定Aloe-Il发酵最佳初始pH值。(3)接种量对抗菌物质产生的影响将培养好的All种子液按1%、5%、10%、15%、 20%、25%接种量接入发酵培养基中，28°C、200r/min摇床培养72h。观察发酵液粘度，并通过发酵液抑菌实验检测其产生的抗菌物质的活性大小，由此确定Aloe-Il发酵最佳接种量。(4)不同碳源对发酵液黏度及抗菌物质产生的影响以马铃薯浸出液为基础培养基，自然PH，按20%的装液量分装到IOOml三角瓶中，再按培养基体积的m分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、糊精、柠檬酸、甘油，以不加入任何碳源作对照，接种5%的种子培养液。^°C、200r/min摇床培养72h。观察发酵液粘度，并通过发酵液抑菌实验检测其产生的抗菌物质的活性大小，由此确定Aloe-Il发酵最佳碳源。(5)不同氮源对发酵液黏度及抗菌物质产生的影响以马铃薯浸出液为基础培养基，自然PH，按20%的装液量分装到IOOml三角瓶中，再按培养基体积的0. 5%和21分别加入硝酸铵、亚硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、鱼粉、豆饼，以不加入任何氮源作对照，接种5%的种子培养液。^°C、200r/min摇床培养72h。观察发酵液粘度，并通过发酵液抑菌实验检测其产生的抗菌物质的活性大小，由此确定Aloe-Il发酵最佳氮源。(6)甲醇对抗菌物质产生的影响在PDA发酵培养液中接种5%的种子培养液， 28°C、200r/min摇床培养24h后，分别添加0%、1%、1· 5%、2%、2· 5%、3%、4%的甲醇溶液，继续 ^°C、200r/min摇床培养至72h，通过发酵液抑菌实验测定抑菌圈大小，由此确定甲醇对 Aloe-Il发酵的影响。(7)表面活性剂对抗菌物质产生的影响在PDA发酵培养液中接种5%的种子培养液，沘 °C、200r/min 摇床培养 24h 后，分别添加 0%、0. 01%、0. 05%、0. 1%、0. 15%、0. 2% 的 Tween-80溶液，继续^°C、200r/min摇床培养至72h，通过发酵液抑菌实验测定抑菌圈大小，由此确定表明活性剂对Aloe-Il发酵的影响。实施例3
发酵液活性物质的分离纯化与分析
(1)细菌发酵产物的制备将固体PDA培养基中的All菌落接种到配置好的种子液培养基中(每IOOmL三角瓶分装25mL种子培养基)，于恒温振荡培养箱中、200r/min培养 15h。将配置好的发酵培养基分装到500mL三角瓶中，每瓶分装120mL培养基；在无菌操作下将种子液分别接入各瓶发酵培养基中，接种量为5%。发酵培养基在^°C、200r/min条件下连续培养48h。(2)抗菌活性物质的粗提将48h的发酵液用3倍体积的无水乙醇进行沉淀、抽提。充分搅动、振荡后，将抽提液通过滤纸过滤，所得滤液通过旋转蒸发后得到粗提物，粗提物再用适量的甲醇溶解，所得溶液即为活性物质粗提液。(3)硅胶分离将250mL硅胶(200-300目)于110°C活化后，用1:9的甲醇乙酸乙酯充分溶胀后装入层析柱；用两倍于柱容的起始流动相(1:9的甲醇乙酸乙酯)对层析柱进行平衡，平衡时流速为lOmL/min;将6mL的粗提液上样于平衡后的硅胶柱，并用1:9， 2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,10:0的甲醇乙酸乙酯进行梯度洗脱，每个梯度洗脱体积为500mL，洗脱速度为5mL/min，每50mL收集一个组分；将收集到的各个组分用打孔法进行抑菌活性测试；具有活性的组分再次用300-400目的硅胶进行纯化，纯化试剂、方法同第一次硅胶纯化。(4)葡聚糖凝胶分离将第二次硅胶分离的活性组分合并后，通过旋转蒸发至干燥，干燥样品中加入少量甲醇溶解，所得溶液样品即为上样样品。将葡聚糖凝胶kphadex LH-20用甲醇溶胀(溶胀系数为4)后装入层析柱中；用2倍的甲醇(分析纯甲醇经0. 45um 有机滤膜过滤)平衡凝胶柱，平衡时流速为lmL/min ；将上述甲醇溶样品上样至葡聚糖层析柱中进行排阻层析分离，流动相为甲醇(分析纯甲醇经0. 45um有机滤膜过滤)，洗脱速度为 0. 3mL/min，洗脱体积为4倍的柱床体积。洗脱下的组分通过全自动部分收集器收集，每10 分钟收集一个组分；将收集的组分通过打孔法进行抑菌活性测试，将具有活性的组分进行
口井O(5)高效液相色谱法纯化将活性物质在200-400nm波长范围进行全波段扫描，确定紫外吸收最佳波长。采用梯度法使用半制备型高效液相色谱柱进行分离纯化每次上样体积为lmL，流动相为甲醇蒸馏水1:9，3:7，5:5，7:3，9:1 ；洗脱速度为lmL/min，每个梯度洗脱IOmin ；柱温为25°C ；收集每个层析峰对应的组分，并采用打孔发对各个组分进行抑菌活性测试；合并具有活性的组分。(6)质谱检测将具有活性的组分进行100倍稀释，将稀释后的溶液经0. 45um有机滤膜过滤，确保溶液中无任何不溶性异物；将处理好的样品进行质谱分析，离子源为电喷雾电离源(ESI)。(7)核磁共振检测将活性物质溶液在50°C烘箱中挥发至干；干燥的物质取 200mg以上的样品加入ImL氘代甲醇充分溶解；将上述溶解的样品进行核磁共振分析。实施例4
Paenibacillus sp. Aloe-Il抗菌活性物质的抗菌谱实验
(1)活性物质的制备在无菌操作台上用接种环挑取一环长势良好的Aloe-Il菌种接于固体PDA培养基上，28°C培养3 左右后备用。配制种子液培养基，分装到IOOmL的三角瓶中，每个装液量为25mL ； 121°C灭菌20min。将PDA培养基上培养好的Aloe-Il菌种挑取一环接种于种子液培养基中，然后放入、200r/min的摇床中培养1 备用。配制发酵液培养基，分装到500mL的三角瓶中，每个装液量为120mL ； 121 °C灭菌20min。在无菌条件下将培养好的种子液转入到发酵液培养基中，接种量为5%，然后放入^°C、200r/min的摇床中连续培养48h。发酵结束后，按每瓶3倍体积的量加入无水乙醇，充分混勻，待发酵液中固体物质充分沉淀一段时间后，用真空泵抽滤去除沉淀。滤液经旋转蒸发浓缩后，再经5000r/
7min离心10 min进一步去除沉淀，最后用0. 22 μ m滤孔的滤器过滤除菌。(2)指示菌菌悬液的制备细菌菌悬液制备一分别取菌种接种于相应的液体培养基中培养至对数生长期，平板计数法测定菌悬液浓度，并调整菌数在IO5CfuAiL左右作供试菌，分装备用。真菌菌悬液制备一将指示菌接于PDA平板上，25°C培养4天；每个平板用 IOmL无菌水洗下菌苔或孢子，用血球计数板在显微镜下计数，使其菌体或孢子浓度为IO6个 /mL左右，分装备用。(3)管碟实验法在无菌条件下吸取100 μ L各菌悬液在相应培养基平板上，用涂布棒将其均勻地涂布在平板表面，直到培养基上的液体变干为止，再用打孔器在培养基中打孔。打好后将每个孔封底，吸取50 μ L的抑菌活性物质粗提液加入孔中(不能溢出孔外)， 把培养皿放入恒温培养箱中培养24h左右。一般认为，抑菌圈在6 10mm，说明该物质具有抗菌性；IOmm以下为轻度敏感；11 15mm为中度敏感；16mm以上则为高度敏感。结果表明=Aloe-Il抗菌活性物质对致病金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型等革兰氏阳性及多种菌植物病原真菌有很强的抑制作用，对革兰氏阴性菌和鸡支原体无明显抑制效果。(4)抑制菌丝生长速率测定在无菌条件下，取IOmL粗提液与90mL已融化的无菌 PDA培养基混合均勻，倒入无菌培养皿中制成带药培养基平板。待凝固后接种直径7mm的供试病原真菌菌饼，每次处理重复3次，置培养，以无菌水处理为对照，4天后用十字交叉法测量菌饼直径，计算抑制率。结果显示在测试的8种植物病原真菌中，对小麦赤霉菌、桃红粉病原菌、油菜菌核菌、桃褐腐病原菌、柑橘绿霉、灰霉、腐霉等7种病原真菌有较好的抑制效果，其抑制率大于90%，对白菜轮腐菌抑制率较低，为69.(5)最小抑菌浓度(MIC)测定将粗提活性物质采用二倍稀释法稀释后备用，各稀释浓度分别为原液、1 2、1 4、1 8、1 16、1 32、1 64、1 128。分别取不同稀释度活性物质 lmL、指示菌菌悬液lmL、无菌培养基2mL于不同试管内混合，以不加活性物质但接种菌的试管作为阳性对照，以不加活性物质并且不接种菌的试管作为阴性对照，每个浓度做3次重复。将接种细菌的试管置于摇床(37°C，150 r/min)培养1 左右，将接种真菌的试管置于摇床(28°C，200 r/min)培养20h左右，测定0D630nm值。结果显示，对金黄色葡萄球菌、桃红粉病原菌、桃褐腐病原菌和柑橘绿霉的最小抑菌浓度为稀释度1:64，对油菜菌核菌的最小抑菌浓度是稀释度1:32，对小麦赤霉菌和灰霉、腐霉最小抑菌浓度则为稀释度1:16，而对革兰氏阴性菌大肠杆菌无抑制效果。


一株具有广谱抗菌活性和动物肠道定植能力的芦荟内生细菌Paenibacillussp.Aloe-11，从申请人人工栽培3年生中华芦荟中分离获得，根据形态学特征、生理生化及分子生物学技术将其鉴定为一个类芽孢杆菌，其发酵最适碳源和氮源分别为蔗糖和硝酸铵(一般选用PDA培养基)，发酵最佳条件为28℃，pH值适应范围pH4-10，其次生代谢产生一些具有广谱抗菌和促进生长等功能的活性物质，同时该菌还具有固氮和在动物肠道内定植的作用，所以本发明可以用来研发新型抗生素、促生长剂、动物微生态制剂等，具有潜在的商业开发和应用价值。