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专利名称
直接克隆制作方法
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发明者
Y.张, J.付, F·斯图尔特
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公开日
2013年4月24日
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申请日期
2011年6月10日
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优先权日
2010年6月10日
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申请人
基因桥有限责任公司
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文档编号
C12N9/22GK103068995SQ201180038908
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关键字
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权利要求
1.一种用于在共享至少一段序列同源区域的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，其中所述方法包括在5’到3’外切核酸酶和退火蛋白的存在下，将所述第一核酸分子与所述第二核酸分子接触； 其中所述5’到3’外切核酸酶包含具有5’到3’外切核酸酶活性的区域并且至少包含 i)SEQ ID NO1的第564-587位氨基酸；或 ii)与SEQID NO1的第564-587位氨基酸在其24个氨基酸序列全长上具有至少70%同一性的24个氨基酸的序列2.根据权利要求1所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶是RecE3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述RecE包含或由SEQI D NO1的第564-866位氨基酸序列或其变体组成，所述变体包含长度为303个氨基酸的序列或由其组成，所述序列与SEQ ID NO1在其303个氨基酸序列全长上具有至少70%的序列同一性4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述RecE包含选自SEQID NO1的第1-866、141-866或564-866位氨基酸的序列或其变体或由选自SEQ ID ΝΟ1的第1-866、141-866或564-866位氨基酸的序列或其变体组成，其中所述变体与SEQ ID NO1在其序列全长上具有至少70%的序列同一性5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RecE与SEQI D NO1中所提供的RecE具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RecE是全长RecE7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述退火蛋白是RecT8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是线性核酸分子9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述同源重组在宿主细胞内进行10.根据权利要求9所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶是由异源DNA表达的11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶是RecE并且是由整合的原噬菌体的RecE基因表达的，其中RecE的表达是由异源启动子驱动的12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶的表达是由诱导型启动子驱动的，所述诱导型启动子如阿拉伯糖诱导型启动子或鼠李糖诱导型启动子13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二核酸分子是线性化的克隆载体，如线性化的BAC、线性化的基于pl5A起始区的载体、线性化的基于pBR322起始区的载体、线性化的粘粒、线性化的基于PUC起始区的载体或线性化的基于ColEl起始区的载体14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是线性的，并且所述方法进一步包括在所述5’到3’外切核酸酶和所述退火蛋白的存在下将第三核酸分子与所述第一和第二核酸分子接触，其中所述第一核酸分子与所述第二核酸分子共享一段同源区域并且与所述第三核酸分子共享一段不同的同源区域，其中所述第二核酸分子与所述第一核酸分子共享一段同源区域并且与所述第三核酸分子共享一段不同的同源区域，其中所述第三核酸分子与所述第二核酸分子共享一段同源区域并且与所述第一核酸分子共享一段不同的同源区域15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是线性的，并且所述方法进一步包括在所述5’到3’外切核酸酶和所述噬菌体退火蛋白的存在下将第三核酸分子和第四核酸分子与所述第一和第二核酸分子接触，其中所述第一核酸分子与所述第二核酸分子共享一段同源区域并且与所述第四核酸分子共享一段不同的同源区域，其中所述第二核酸分子与所述第一核酸分子共享一段同源区域并且与所述第三核酸分子共享一段不同的同源区域，其中所述第三核酸分子与所述第二核酸分子共享一段同源区域并且与所述第四核酸分子共享不同的同源区域，其中所述第四核酸分子与所述第三核酸分子共享一段同源区域并且与所述第一核酸分子共享一段不同的同源区域16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一核酸分子包含感兴趣的序列，所述第二和第四核酸分子是短的寡核苷酸，所述第三核酸分子是克隆载体17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子包含长度为2kb或更长的感兴趣的序列18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子包含的感兴趣的序列是基因族19.根据权利要求18所述的方法，其中所述基因簇编码次级代谢产物途径或脂肪酸合成途径20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子是基因组DNA的片段21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子是线性化的BAC，所述方法用于将来自BAC的感兴趣的序列亚克隆至克隆载体中22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少第一和第二核酸分子是线性的，并且所述方法进一步包括在Red α和Red β或截短的RecE和RecT的存在下，将所述至少第一和第二核酸分子之间的线性到线性同源重组反应的产物用于在线性到环状同源重组的第二步中23.根据权利要求22所述的方法，其中所述线性到线性同源重组在全长RecE和RecT的存在下在体外进行，其中所述方法进一步包括将所述线性到线性同源重组反应的产物与宿主细胞中的另外的核酸分子接触，并在Reda和Redii以及优选还包括Red Y的存在下在体内进行线性到环状同源重组24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子是线性的并且在邻近它的5’端处包含硫代磷酸酯化以及在邻近它的3’端处包含硫代磷酸酯化25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二核酸分子是线性的并且在邻近它的3’端处包含硫代磷酸酯化但是在邻近它的5’端处不包含硫代磷酸酯化26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法用于生成cDNA文库27.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是线性的，并且其中所述方法进一步包括在所述5’到3’外切核酸酶和退火蛋白的存在下将所述第一和第二核酸分子与一个或多个其它核酸分子接触以产生线性产物28.根据权利要求27所述的方法，其中所述线性产物是基因、操纵子、染色体或整个基因组29.表达如权利要求1-6中任一项所述的5’到3’外切核酸酶的宿主细胞30.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中还包括编码Reda和RedP的基因，其中所述5’到3’外切核酸酶在与Reda和RedP不同的启动子的控制下31.一种包含在整合的原噬菌体上的recE基因的宿主细胞，其中所述recE基因在异源启动子的控制之下32.包含编码权利要求1-6中任一项所述的5’到3’外切核酸酶的核酸的试剂盒，所述试剂盒用于同源重组方法33.包含权利要求1-6中任一项所述的5’到3’外切核酸酶的试剂盒，所述试剂盒用于 同源重组方法34.一种用于提高同源重组效率的方法，所述方法通过在至少一个与经历同源重组的核酸分子没有序列同源性的单链寡核苷酸的存在下进行同源重组，其中所述同源重组的效率相对于当所述至少一个单链寡核苷酸分子不存在时进行的同源重组提高35.根据权利要求34所述的方法，其中所述至少一个单链寡核苷酸包含或由DNA组成36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述至少一个单链寡核苷酸的长度为10-100个核苷酸37.根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一个单链寡核苷酸的长度为约40个核苷酸38.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述至少一个单链寡核苷酸在每次电穿孔中使用的浓度为l-200pmol39.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述同源重组由RecE和RecT介导40.根据权利要求39所述的方法，其中所述RecE是截短型的RecE41.根据权利要求34-39中任一项所述的方法，其中所述同源重组方法是根据权利要求1-28中任一项所述的方法42.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述同源重组由Reda和Red^介导43.包含权利要求34-37中任一项所述的至少一个单链寡核苷酸的试剂盒,所述试剂盒用于进行同源重组44.根据权利要求32、33或43中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有编码RecE的核酸的宿主细胞45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述宿主细胞是如权利要求24-26中任一项所述的细胞46.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括表达Reda和Red3的宿主细胞47.根据权利要求44或45所述的试剂盒，其中所述宿主细胞还包括编码Redy、RecA、Reda和Redii中一个或多个的核酸序列48.根据权利要求32、33和43-47中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括一个或多个线性化的克隆载体49.一种用于在共享至少一段序列同源区域的至少第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，所述方法包括，在体内进行同源重组之前，使用稀有切割序列特异性DNA切割酶在体内线性化至少一个环状核酸分子以生成所述第一和/或第二核酸分子的步骤50.根据权利要求49所述的方法，其中所述稀有切割序列特异性DNA切割酶选自归巢内切核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)51.根据权利要求50所述的方法，其中所述归巢核酸内切酶选自1-Scel、1-CeuI,1-CreI,1-ChuI,1-Csm1、1-DmoI,1-PanI,1-SceII,1-SceIII,1-SceIV, F-Sce1、F-SceI1、P1-AaeI, P1-ApeI, PICeuI, P1-CirI, P1-CtrI, P1-DraI, P1-MavI, P1-MfII, P1-MgoI,P1-Mja1、P1-Mka1、P1-MIe1、P1-Mt ul、P1-MtuH1、P1-PabII1、P1-Pfu1、P1-Pho1、P1-Pko1、P1-Psp1、P1-RmaI, ΡΙ-Sce1、P1-Ssp1、P1-TfuI, P1-TfuI1、P1-Tlil、P1-Tlill. P1-Tsp1、P1-TspI1、P1-Bsp1、P1-MchI, P1-Mfa1、P1-Mga1、P1-MgaII, P1-Min1、P1-Mma1、P1-MshI,P1-MsmII, P1-MthI, P1-Tagl、ΡΙ-ThyI1、1-NcrI,1-NcrII,1-PanII,1-TevI,1-Ppol、1-DirI,1-HmuI,1-HmuII,1-TevI1、1-TevII1、F-SceI, F-SceII (HO)、F-SuvI, F-TevI 和F-TevII52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述同源重组由RecE和RecT介导53.根据权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述同源重组的方法是根据权利要求1-28或34-42中任一项所述的方法54.根据权利要求29-31中任一项所述的宿主细胞，还包括如权利要求50或51中所述的稀有切割序列特异性DNA切割酶55.一种用于进行同源重组方法的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个如权利要求50或51中所述的稀有切割序列特异性DNA切割酶56.一种用于进行同源重组方法的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求54所述的宿主细胞
专利名称：直接克隆的制作方法直接克隆 从DNA混合物如基因组DNA或cDNA制备物中克隆DNA片段的标准程序包括从蛋白、脂质以及其它污染物中纯化DNA，通常在限制性酶切后将该DNA制备物连接到克隆载体上以制备文库。由于文库通常为克隆DNA片段的复杂混合物，因此回收特定的DNA片段需要采用几种费力的方法之一来筛选文库。特定的DNA片段通常不是包含在单克隆中的，而是需要由两个或多个克隆重新构建或者伴随需要移除的不需要的侧翼序列(flankingsequence)ο这些额外的亚克隆步骤使克隆的DNA文库方法更加费力。由于对人类疾病更加深入的了解，患者特定治疗方法的发展将变得更加普遍，包括患者特定基因修正方法的发展。理想地，患者特异基因修正可采用获得自患者的有问题的DNA区域，在实验室中修正并重新插入到患者体内。此外，下一代基因测序技术(例如454、Solexa或S0LiD4)的发展允许在不构建基因文库的情况下获得基因组序列数据。该方法称为“宏基因组学·，”目前在没有伴随基因文库资源的情况下，已经了解了许多种类的大量的基因组序列数据，所述基因组序列数据在原核基因组的情况下可以是完整的。但是，功能研究需要获得并且操纵编码待研究的基因的克隆的DNA。因此需要一种新的技术以直接从基因组DNA池中将特定的DNA区域克隆到载体中，在本文中称为“直接克隆。”此外，在合成生物学中线性DNA片段组装的需求增加。这些线性DNA可以是ssDNA，优选寡核苷酸，或dsDNA。DNA片段的合成生物组装已用于产生基因、操纵子、染色体，并且最近用于产生整个基因组(参见参考文献42)。包括多于10个不同DNA分子的组装方法通常使用传统的DNA连接或由Red操纵子介导的同源重组或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞的内源性机制。因此开发一种按照确定的顺序组装DNA片段的新方法的需求增加。之前已描述过通过同源重组进行直接克隆和亚克隆，也称为“缺口修复克隆”或“线性到线性”(1-4)。术语“克隆”涉及一种通过连接于载体并在宿主细胞中增殖而从初始来源扩增DNA片段方法，所述宿主细胞通常为大肠杆菌(E. coli)或酵母。术语“亚克隆”涉及一种已经通过前述的克隆或PCR从初始来源扩增的DNA片段在宿主细胞中增殖的方法。除前述的直接克隆外，也描述了线性到线性同源重组的亚克隆应用(例如，参见克隆试剂盒CkmeEZ PCR Cloning Kit http://www. genscript. com/cloneez_P CR_Cloning_kit.html;或 Cold Fusion Cloning Kit http://www.systembio.co m/cold-fusion-cloning/)。目前通过同源重组进行亚克隆的方法不是很有效。但是，由于底物DNA片段在亚克隆之前基本上是纯的，因此并不需要高效。已经使用酵母实现了从基因组DNA制备物中直接克隆基因(8-12)。但是，该方法存在技术上的挑战，并且由于在酵母中重组不可控，因此克隆的DNA分子在基因方面通常不稳定。因此在酵母中进行直接克隆仅仅限制于实验室(V. Larionov-参见Selectiveisolation of mammalian gene s by TAR cloning. Kouprina Nj Larionov V. Curr ProtocHum Genet. 2006May; Chapter5:Unit5. 17)。之前将该酵母技术商业化的尝试失败了(Biotech company"Caliper"in Boston 于 2002 年关闭)。由于表达rac卩遼菌体蛋白RecE和RceT,大肠杆菌sbcA菌株在线性到环状同源重组(在此处称为“LCHR”)中非常有效(5-7)。由于RecE和RecT与λ噬菌体蛋白中的Reda和RedP同源，Reda和RedP也显不可以介导非常有用和高效的同源重组。通过表达RecE/RecT或Red a /Red β，线性到线性同源重组(在本文中称为“LLHR”)也大大增加。目前RecE/RecT介导的同源重组使用了截短形式的RecE。AJ Clark最初发现的RecE为279个氨基酸的5’到3’外切酶(RecE588)(参见文献5)。在5’端缺少14个氨基酸的较短形式(RecE602)也显示出LCHR和LLHR活性。该形式已经被结晶(Structure.2009Mayl3;17(5):690-702. C rystal structure of E.coli RecE protein reveals atoroidal tetramer for p rocessing double-stranded DNA breaks.),并且与相似大小的5’到3’核酸外切酶Reda相当。这些RecE类型是原始的866个氨基酸长的rac噬菌体基因的截短形式。RecE的较短形式(RecE602)对应于最后的约265个氨基酸。换言之，与截短的RecE602相比，全长的RecE在其N-末端具有额外的601个氨基酸，而与截短的RecE588相比，全长的RecE在其N-末端具有额外的587个氨基酸。在大肠杆菌中，通过RecET介导的重组，DNA池中的基因可以通过一步反应克隆入线性载体中(7)。但是，该系统非常低效，不能常规的用于从基因组DNA制备物中直接克隆。特别的，它不能允许直接克隆随DNA池的复杂性而改变的超过一定大小的DNA片段。在复杂性较低的池中，如原核基因组DNA制·备物，已有的技术允许直接克隆一些大于IOkb的DNA区域。在复杂性较高的池中，如哺乳动物基因组DNA制备物，已有的技术仅允许以非常低的效率直接克隆短DNA区域(2kb左右)。本发明的一个目的是改进克隆方法。特别的，本发明的一个目的是提供一种直接克隆的方法，所述方法可以用作从DNA池中钓出感兴趣基因的方法。本发明的另一目的是提供一种改进的亚克隆方法。本发明的另一目的是提供改进的用于复杂DNA工程任务的方法，如将多个DNA片段组装成精确的产物。发明概沭在第一个方面中，本发明提供一种在共享至少一个序列同源性区域的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，其中所述方法包括在5’到3’核酸外切酶和退火蛋白存在下，将第一核酸分子与第二核酸分子接触；其中，所述5’到3’核酸外切酶包括具有5’到3’核酸外切酶活性的区域并且至少i)SEQ ID NO:1 的氨基酸 564-587 ;或ii)24个氨基酸的序列，所述序列与SEQ ID NO:1的第564-587位氨基酸在其24个氨基酸序列全长上具有至少70%的同一性。在第二个方面中，提供了一种在至少一个与经受同源重组的核酸分子无序列同源性的单链寡核苷酸存在的情况下进行同源重组而提高同源重组效率的方法，其中，与当所述至少一个单链DNA寡核苷酸不存在时进行同源重组相比，同源重组的效率提高了。在第三个方面中，提供了一种在共享至少一段序列同源性区域的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法，包括在进行体内同源重组之前采用稀有切割序列特异性DNA切割酶对至少一个体内环状核酸分子进行线性化以生成所述第一和/或所述第二核酸分子的步骤。发明详沭惊奇的发现可以采用RecE来介导同源重组，所述RecE含有不存在于现有同源重组技术中使用的截短型RecE中的内源性N-末端RecE序列的部分。此外，惊奇的发现采用这样的N末端延伸的RecE可以提高LLHR的效率。使用全长RecE可以获得最高的LLHR效率，因此本发明优选地包括使用全长RecE介导LLHR。来自大肠杆菌K12的全长RecE的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:1)一种用于在共享至少一段同源序列的第一核酸分子和第二核酸分子之间进行同源重组的方法。一种提高同源重组效率的方法。
