专利名称：一种非连接依赖性的快速克隆方法连接酶依赖性的DNA定向克隆技术的建立是上世纪生物学领域中里程碑式的成就。这一技术的建立及应用使得人们可以在一定范围内修改重组遗传物质DNA，从而为探索基因在生物体内的具体功能提供可能性。随着生物学的不断发展，特别是PCR技术的发展以及DNA定点突变技术的建立，DNA定向克隆现已成为整个分子生物学领域的基础。DNA定向克隆是指将供体DNA片段克隆至受体DNA上特定位置，比如说多克隆位点。传统的DNA定向克隆通常包含以下步骤:I)使用5’端添加特定限制性酶切位点的引物扩增供体DNA片段；2)供体DNA片段扩增产物纯化后连接至T载体中；3)使用预先设计好的酶切位点将目标片段从T载体中酶切分离出来并进行纯化；4)使用同步骤3)同样的酶切位点将受体DNA线性化，并进行纯化；5)使用步骤3)和4)中纯化得到的供体DNA与受体DNA按一定比例进行连接反应；6)将步骤5)中的连接产物转化至感受态细胞中； 7)单克隆鉴定、提取正确连接的重组DNA。由此可见，传统的DNA定向克隆是一件非常耗时耗力的工作，且克隆效率差，成功率低。此外，由于供体DNA片段中常常包含多种酶切位点，因此能否选择到合适的用于克隆的限制性内切酶成为制约这种技术发展的最大障碍。在生物学飞速发展的今天，伴随着DNA测序技术以及合成生物学的极大发展，低效率的传统克隆方法已无法满足日趋多样化和复杂化的克隆需求，尤其是无法满足高通量克隆需求。新型的基于重组原理的克隆方法可以有效消除酶切位点对克隆策略的限制，具有适用性广、通量高等诸多潜在优点。目前已有几种可以满足高通量克隆需求的重组克隆系统相继问世:通用载体质粒融合系统UPS、GateWay入门克隆系统和MAGIC克隆系统。其中，通用载体质粒融合系统UPS、GateWay入门克隆系统是基于体外位点特异性重组原理开发的，而MAGIC克隆系统是基于体内同源重组和细菌杂交原理而开发的。以上三个克隆系统可以完成任意DNA片段在不同背景下的无缝穿梭，且操作流程具有通用性，在一定程度上可以满足多样化、高通量的克隆需求。然而令人遗憾的是，这些非连接依赖性的克隆系统都存在着一些自身无法避免的缺陷。首先，和传统克隆方法相比，除了 Gateway克隆系统之外的另外两种方法对最初的基因克隆都没有明显优势。而Gateway克隆需要使用极其昂贵的酶来完成最初的基因克隆，而且引物设计时需要添加特定的一段很长的包含重组位点的序列。其次，这些克隆系统要求最初的基因克隆必须在固定的载体上进行，如果需要将目的基因克隆至指定载体中，这些系统是不能使用的。第三，这些克隆系统只能容许一次克隆一个供体DNA片段，不适用于复杂的多供体片段一次性拼合克隆。由于上述种种缺陷，这三种位点特异性重组克隆系统无法得到广泛的应用。同源重组是发生在生物体内的另一种DNA重组形式。相比较位点特异性而言，同源依赖性的重组具有极大的优势。首先，同源性依赖的DNA重组不需要特定的DNA序列，仅仅需要供体DNA和受体DNA在重组位点有一定长度的可以完全匹配的同源序列即可，而位点特异性重组需要特定的DNA序列才能实现。因此，如果用同源重组代替位点特异性重组进行共同体DNA克隆，可以消除其最初的基因克隆只能向指定载体上进行这一限制，使得供体DNA克隆具有更高的灵活性和选择性。其次，基于同源重组的克隆策略，容许对多个供体片段进行一步的拼合克隆，即同时完成多个供体片段的连接拼合并克隆至受体DNA。这一优点为复杂的基因或者载体改造提供了一种一步式的解决方案。由此可见与位点特异性重组相比，同源重组克隆系统具有无可比拟的优势。Clontech的In-FusionTM PCR克隆试剂盒就是基于同源重组原理开发而成的。使用该试剂盒，供体DNA PCR产物可直接克隆至任意受体DNA中，无需酶切、连接、末端补平等繁琐步骤。使用该系统时，需要在PCR引物的5’端引入至少15个碱基同源序列。这15个碱基必须分别与线性化目标载体的5’和3’末端能够完全匹配。PCR反应结束后，纯化过的供体DNAPCR产物与线性化受体DNA在In-FusionTM重组酶的催化下反应30分钟，末端的同源序列即可融合在一起。反应产物直接转化至大肠杆菌感受态即可完成克隆过程。In-FusionTMPCR克隆系统真正实现了供体DNA片段的一步式克隆，大大的简化了克隆过程，并在一定程度上显著提高了克隆的成功率。然而，由于该重组酶难于获得、成本昂贵且性质不稳定，这种系统目前也未能得到广泛的推广技术内容针对上述问题，本发明提供了一种通过DNA外切酶以及单链结合蛋白来实现体外DNA定向重组的方法。首先设计供体DNA片段特异性扩增引物，在其正反向引物5’端分别添加至少12bp的与受体D NA末端同源的序列，如果需要还可以添加用于供体DNA线性化的酶切位点。使用该引物对扩增供体DNA片段，将扩增产物通过胶回收试剂盒或者乙醇沉淀进行纯化回收。其次，将受体DNA使用合适的限制性内切酶进行线性化并纯化回收。最后，供体DNA和线性化受体DNA片段在DNA外切酶和单链结合蛋白的共同催化下可以在体外高效的形成重组中间体。该重组中间体直接转化感受态细胞即可完成克隆过程(见附图1)。此发明方法可以用来实现单个供体DNA片段的定向克隆，也可实现多个目标DNA片段的一步克隆，完成DNA的无缝拼接，还可以用作DNA定点突变。本发明优选的用于单供体DNA定向克隆的PCR扩增引物设计原则为:正向引物:5’ -15bp受体DNA 5’端同源序列+酶切位点+供体DNA特异性正向扩增引物-3’;反向引物:5’-15bp受体DNA 3’端同源序列+酶切位点+供体DNA特异性反向扩增引物_3’。所述15bp受体DNA 5’端同源序列指受体DNA5’端反义链末端最后15bp DNA序列，方向为5’至3’ ；所述15bp受体DNA 3’端同源序列指受体3’端正义链末端最后15bp DNA序列，方向为5’至3’。所述同源序列的长度为至少12bp，在本发明的一个优选例中其长度为15bp。所述酶切位点为受体DNA线性化所用限制性内切酶酶切位点的全长或者一部分，方向为5’至3’。所述供体DNA特异性正(反)向扩增引物是指供体DNA PCR用扩增引物，方向为5’至3’(见附图2)。本发明优选的用于多供体DNA定向拼接克隆的PCR扩增引物设计原则为(以两供体片段拼接克隆为例，设定拼接顺序由5’至3’方向分别为:供体片段A、供体片段B):供体A正向引物:5’ _15bp受体DNA 5’端同源序列+酶切位点+供体A片段特异性正向扩增引物-3’ ；供体八反向引物:5’ -供体A片段特异性反向扩增引物-3’ ；供体8正向引物:5’ -15bp供体A片段3’端同源序列+供体B片段特异性正向扩增引物-3’ ；供体B反向引物:5’-15bp受体DNA 3’端同源序列+酶切位点+供体DNA特异性反向扩增引物-3’。所述15bp受体DNA 5’端同源序列指受体DNA 5’端反义链末端最后15bp DNA序列，方向为5’至3’ ；所述15bp供体A片段3’端同源序列指供体A片段3’端正义链最后15bp DNA序列，方向5’至3’ ；所述15bp受体DNA 3’端同源序列指受体3’端正义链末端最后15bp DNA序列,方向为5’至3’。所述同源序列的长度为至少12bp,在本发明的一个优选例中其长度为15bp。所述酶切位点为受体DNA线性化所用限制性内切酶酶切位点的全长或者一部分，方向为5’至3’。所述供体A片段(B片段)特异性正(反)向扩增引物是指供体DNAPCR用扩增引物，方向为5’至3’。本发明优选的用于DNA定点突变PCR扩增引物设计原则为(以质粒DNA引入单碱基突变为例，设定以突变位置为M和质粒载体上3’方向与其相距500bp以上的另一位置为N，按5’至3’方向M和N两点将质粒载体分为两段，供体MN片段和受体N片段M段):供体MN片段正向引物与受体匪片段反向引物反向完全互补或部分互补，两引物之间重叠区域为15bp ;供体MN片段反向弓丨物与受体NM片段正向弓丨物完全互补或部分互补，两引物之间重叠区域为15bp。所述供体MN片段正向引物与受体匪片段反向引物互补区域内引入的单碱基突变。所述引物之间重叠区域至少为12bp，在本发明的一个优选例中其长度为15bp。本发明中供体DNA片段PCR扩增所使用的DNA聚合酶可以为任何形式的DNA聚合酶。鉴于对供体DNA保真度的要求，在本发明的一个优选例中选用高保真DNA聚合酶。所述受体DNA指任何可用于DNA克隆的DNA双链环，包括但不仅限于以下几种:质粒、BAC (人工细菌染色体)、YAC(人工酵母染色体)以及PhagemicK噬菌粒)等。所述受体DNA线性化可以使用限制性内切酶进行，也可直接使用以受体DNA为模板的PCR扩增产物。供体DNA片段与线性化受体DNA片段需进行纯化回收，纯化方式包含但不仅限于以下几种，柱式DNA纯化系统，乙醇沉淀等。鉴于DNA纯度要求，在本发明的一个优选例中，使用柱式DNA纯化系统对供体DNA和受体DNA进行纯化回收。本发明中供体DNA片段以及受体DNA片段的重组反应是在DNA外切酶和DNA单链结合蛋白共同催化下在体外完成的。所述DNA外切酶是指能够切割DNA末端的一类酶的总称，可以为任意一种5’一 3’DNA外切酶或几种该种外切酶的组合，包括但不限于以下几种:大肠杆菌外切酶VI1、T7外切酶基因6等；也可以为任意一种3’ 一 5’ DNA外切酶或几种该种外切酶的组合，包括但不限于以下几种:大肠杆菌外切酶1、大肠杆菌外切酶II1、T4聚合酶等；也可是两类外切酶一种或者几种的组合。所述DNA外切酶可以来源于原核生物，例如大肠杆菌；也可来源于真核生物，例如酵母、线虫、小鼠、大鼠或者人。在本发明一个优选例中选用大肠杆菌来源的DNA外切酶。所述单链结合蛋白可以为任一种能与单链DNA结合的蛋白，包括但不限于以下几种:大肠杆菌SSB、真核生物复制蛋白RPA、RecA、T4基因32蛋白等。所述单链结合蛋白可以来源于原核生物，例如大肠杆菌；也可来源于真核生物，例如酵母、线虫、小鼠、大鼠或者人。在本发明一个优选例中选用大肠杆菌来源的单链结合蛋白。本发明中可用于催化供体DNA片段以及受体DNA片段的重组反应的酶液可为任一种或几种外切酶和任一种或几种DNA单链结合蛋白的组合:包括但不限于以下几种:大肠杆菌外切酶I和大肠杆菌SSB、大肠杆菌外切酶III和大肠杆菌SSB、大肠杆菌外切酶VII和大肠杆菌SSB、T7外切酶基因6和大肠杆菌SSB、T4聚合酶和大肠杆菌SSB、大肠杆菌外切酶I和RecA、大肠杆菌外切酶III和RecA、大肠杆菌外切酶VII和RecA、T7外切酶基因6和RecA、T4聚合酶和RecA等。在本发明一个优选例中选用大肠杆菌T4聚合酶和大肠杆菌RecA，该组合可以高效介导供体DNA片段与受体DNA片段在体外发生同源重组反应。在本发明中，供体DNA片段以及受体DNA片段经纯化回收后，与DNA外切酶和单链结合蛋白混合后即可进行重组反应。反应体系中需包含缓冲液、盐离子以及ATP，PH可以为5.0-9.0。在本发明一个优选例中，重组反应体系包含如下组分:500mM Tris-HCL、200mMMg (AC) 2UOmM DTTUM NaAcUmM ATPUOmM BSA，反应液PH为8.0。以上组分都可以用物理化学性质相似的其他试剂代替，比如NaAc可用KAc代替。供体DNA与受体DNA可分别使用DNA外切酶处理后，再混合并加入单链结合蛋白进行重组反应；也可混合后加入DNA外切酶以及单链结合蛋白进行重组反应。反应时间可为10-60分钟，但反应时间太短或者太长都将导致重组反应效率下降。反应温度可为18°C -50°C，随着反应温度的上升反应时间应相应缩短，否则也将会导致重组反应效率下降。在本发明一个优选例中反应温度为30°C，反应时间为30分钟。供体DNA片段以及受体DNA片段经重组反应后形成重组中间体，因细胞自身所具有的修复机制，重组中间体可直接转化感受 态细胞即可完成供体DNA片段以及受体DNA片段的同源重组。从实施例1中克隆一段500bp λ DNA序列至roC19质粒的结果可得出如下结论:DNA外切酶(T4聚合酶)以及单链结合蛋白(RecA)可在体外高效介导DNA片段同源重组，从而完成DNA定向克隆，且克隆阳性率超过90%。本发明的优点在于:1.克隆效率高，克隆数目多且阳性率高；2.步骤简单，无需对供体DNA片段进行穿梭克隆或者酶切处理；3.供体DNA片段不需要限制性内切酶处理，因此彻底消除了供体DNA内在酶切位点对于克隆策略选择的限制；4.本发明方法不仅可以用作单个供体DNA片段的快速克隆，而且可用于实现多个供体DNA片段的无缝拼接和一步式克隆。上述说明不仅限于本发明和所述，本领域技术人员可以通过修饰、调整、改变来实施和应用本发明所述的技术方案，这些技术方案都落入本发明的保护范围内。

图1:本专利申请方法实验流程示意图。图2:本专利申请方法引物设计示意图。图3:实施例1单克隆PCR鉴定结果电泳图。M:DL2000 分子量标准，2.0kbp, 1.0kbp, 0.75kbp，0.5kbp，0.25kbp, 0.1kbp ；1-14:14个不同单克隆菌落PCR产物，阳性克隆扩增产物大小应为700bp。图4:实施例1单克隆EcoRI和BamHI双酶切产物电泳图。M:DL2000 分子量标准，2.0kbp, 1.0kbp, 0.75kbp，0.5kbp，0.25kbp，0.1kbp ;1_8:8个不同单克隆酶切产物，阳性克隆应产生2.6kbp和500bp两条谱带。


6.实验中所使用的无机盐均购自美国Sigma公司。实施例1.将λ DNA 一段500bp的序列定向克隆至载体roC19中EcoRI和BamHI之间。1.设计引物首先设计克隆片段PCR扩增引物正向引物:5，-ATCAGTCATTTCTCGCACATTG-3，，(SEQID N0.1)反向引物:5’-TTACGGGGTTGGAGGTCA-3’，(SEQ ID N0.2)正向引物5’端需添加的15bp载体同源序列以及酶切位点为:5’ -AAAACGACGGCCAGTGAATTC(EcoRI)-3’, (SEQ ID N0.3)反向引物5’端需添加的15bp载体同源序列以及酶切位点为:5’ -GACGATATCTCTAGAGGATCC(BamHI)-3，, (SEQ ID N0.4)因此正向引物最终序列为:5’-AAAACGACGGCCAGTGAATTCATCAGTCATTTCTCGCACATTG-3’，(SEQ ID N0.5)反向引物最终序列为:5’ -GACGATATCTCTAGAGGATCCTTACGGGGTTGGAGGTCA-3 ’，(SEQID N0.6)2.PCR 扩增PCR扩增体系:


本发明涉及一种对供体DNA片段进行快速克隆的方法。该方法首先通过在扩增引物5’端引入附加序列使得供体DNA两末端与受体DNA两末端分别有至少12bp的同源序列；接着将受体DNA线性化，最后供体DNA与线性化的受体DNA在核酸外切酶和单链结合蛋白的催化下在体外高效形成重组中间体，该中间体直接转化感受态细胞即可完成供体DNA至受体DNA的克隆过程。本发明所述方法不需要对供体DNA进行酶切处理，即可实现单个供体DNA片段的快速定向克隆，也可实现多个供体DNA片段的一步拼接克隆，还可以用作DNA定点突变。该方法能够为遗传学、分子生物学、生物化学等研究以及高通量克隆提供一个快速高效的操作平台。