专利名称：一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物的制作方法人乳头瘤病毒的英文全称是human papilloma virus，简称HPV。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，全球范围内，宫颈癌是女性癌症死因的第二杀 手，每年新增约50万病例，其中有20%发生在中国。好发年龄呈双峰状，35 39岁和60 64岁。近年已明确，几乎所有的宫颈癌都由人乳头瘤病毒引起。其中，超过2/3的宫颈癌病 例可归咎于两种类型的HPV 16型和18型。发生宫颈癌的病因至今尚未完全明了，可能与性生活紊乱，过早性生活，早年分 娩，多产，地理环境等因素有关。分子生物学研究结果显示90%以上的宫颈癌伴有HPV感 染。宫颈癌以鳞状细胞癌最为多见，其次为腺癌和腺鳞癌等。高危型人乳头瘤病毒的感染 是诱发宫颈癌的必要条件，几乎所有的宫颈鳞癌中都可以检测到HPV-DNA的存在。目前治疗宫颈癌的只能采用手术、放疗，或两者联合使用。近年来，在上述方法基 础上加免疫治疗受到重视并取得较好的效果。单独应用一种治疗方法的并发症发生率为 3 11%，联合应用两种治疗方法的并发症发生率达到30%或以上。手术和放疗各有优缺 点。目前的趋势是强调综合治疗，把手术、放疗和化疗进行有机的结合，以达到提高治疗效 果、改善生活质量、减低并发症、尽可能保留生育功能和卵巢功能的目的。综合治疗宫颈癌的方法，归纳起来有以下几种1)手术治疗法切除标本的正常组织边缘距离肿瘤病灶最少达Icm以上。其缺点 是损伤大，不能凭肉眼发现受HPV病毒感染的细胞，因此，被感染的细胞清除不彻底。2)放射治疗法放疗包括外照射和腔内放疗。适用于各期患者，常和手术、化疗配 合使用。该方法主要缺点是虽然能够杀死受HPV病毒感染的细胞，但是，射线对正常组织 细胞损伤较大。3)化学治疗法化疗可用于术前、术后，或放疗前后，也常与放疗同时进行，以提 高放疗的疗效。迄今为止，已报道有M种细胞毒药物用于进展或复发宫颈癌的化疗，单药 化疗以顺钼的研究最广泛，疗效也最肯定。该方法主要缺点是虽然能够杀死受HPV病毒感染的细胞，但是，化疗药物对正常组织细胞的毒性较 大，出现诸如过敏性休克、呕吐、白细胞减少、抵抗力下降等副作用。
本发明的目的就是提供一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物，它 可以专门针对受HPV16型病毒感染的细胞进行有效地破坏，而且对人体无毒副作用。本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它的氨基酸序列为氨基 端-YICEDTSVTV-羧基端；利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。正常人体的外周血单核细胞(简称PBMC) —般不具有特异性溶破受到HPV16型病 毒感染的细胞的功能，本发明提供的多肽在体外与HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细 胞共同孵育，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 50% -80%，还可以诱导激活CTL溶破HPV16型阳性的肿瘤细胞，溶破率为60% -90%。本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的氨基酸序列，采用蛋白质表位 分子设计的原理和方法，对HPV16型的E2蛋白序列进行CTL表位分析，主要是基于量化基 序法确定E2蛋白的CTL表位，具体做法是从E2蛋白第1位氨基酸残基开始，逐个截取九 肽段或十肽段，共获得357条九肽段和356条十肽段。对于每一条肽段，在结合矩阵中查找 各位点氨基酸残基的结合系数，这九肽或十肽结合系数相乘后再乘以标准系数，即为该九 肽或十肽与HLA-A*0201的结合系数。最后，选取结合系数最高的几条肽段作为候选CTL表 位。以此方法找到了具有功能的本发明所述的氨基酸序列，即氨基端-YICEDTSVTV-羧基 端。合成本发明所述的氨基酸序列的方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方法 制成的采用标准Fmoc方案，起始选用0.0125mmol，PSC树脂(ABI公司生产，批号 A5F013)，分别按照权利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各 氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为0. Immol0各种氨基酸保护基团是各氨基酸 的 alpha 氨基为 Fmoc 保护，其余侧链保护基团，Arg (Mtr)、Tyr (tBu)、Thr (tBu)、Tyr (tBu)、 Asp(OtBu)0每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20%六 氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的 肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸0. 75g、酒石酸乙二胺 (EDT) 0. 25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)O. 5ml、去离子水0. 5ml、三氟乙酸10ml。在室温条 件下持续搅拌，反应时间为4. 5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将 混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和 滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1 anl，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后， 冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上 完成。本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以室温保存、运输，也可以自动化批量生产。使用现有的成熟技术，制备表达HPV16型E2蛋白的靶细胞，叫Caski细胞；按照本领域公知的方法获得HLA_A*0201阳性人体的外周血单核细胞(简称 PBMC)；培养上述PBMC细胞M小时后，取悬液O XlO6Ail) 4瓶。加入本发明所述的氨基 酸序列多肽(20yg/ml)，加入等量完全培养基作为对照组，37°C，5%C02环境下孵育。7天 后重复该刺激过程，共反复刺激3次。最末一次刺激后第3天收集悬浮细胞，这些细胞具有 针对HPV16型E2蛋白的靶细胞的细胞毒性(CTL细胞)，计数检测发现使用本发明涉及的 合成多肽药物或疫苗可以使CTL细胞数量较对照组增加50% -80%。将转染了 HPV16之E2基因的Caski细胞与上述CTL细胞共同孵育，发现该CTL细 胞可以溶破转染了 HPV16之E2基因的Caski细胞，溶破率得到60% -90%。由于采用了上述技术方案，本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点， 它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具 有人乳头瘤病毒16型相关肿瘤标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物，涉及一种生物医学领域，特别是一种关于人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物。其特征在于它的氨基酸序列为YICEDTSVTV；利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，将多个氨基酸序列形成特殊的连接方式。本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破带有人乳头瘤病毒16型相关肿瘤标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。