Plga改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法【技术领域】，特别是涉及一种载生物因子且缓释的具有高活性的骨缺损修复材料的制备方法，该材料可应用于机体骨缺损的修复。[0002]脂联素(Adiponectin，APN)是动物及人类脂肪细胞分泌的一种激素，由247个氨基酸组成，存在2种受体(AdipoRl和AdipoR2)，成骨细胞和破骨细胞均表达脂联素受体。体外实验证明，脂联素激活AdipoRl / JNK, AdipoRl / p38信号通路诱导人成骨细胞的增殖及分化，促进其成骨功能。同时，脂联素处理小鼠单核细胞后，可抑制NF-kappa B通路的激活，进而抑制小鼠单核细胞向破骨细胞分化成熟。体内动物研究亦表明，过表达脂联素的腺病毒转染C57BL/6J小鼠后，成骨细胞功能被激活，破骨细胞骨吸收作用被抑制，最终表现为骨量增加。上述研究表明，脂联素在骨代谢过程中起重要的调控作用。[0003]骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)是目前发现唯一能够单独诱导成骨的生长因子，其中以BMP-2的成骨能力最强。但它们半衰期短，局部应用时很快被稀释和代谢。[0004]生物可降 解脂肪族聚酯材料PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)作为骨组织工程材料已经引起广泛关注。PLGA是一种优良的体内可吸收降解的医用高分子材料，可被机体分解为乳酸，后经代谢以二氧化碳和水排出体外，无任何残留。PLGA对人体不致敏、无毒、无刺激，并且易加工，已获得FDA认证，并作为医用生物材料在临床上广泛应用，如用于制作可吸收手术缝合线、接骨板和螺钉、血管吻合器和药物缓释载体。[0005]但脂肪族聚酯材料类材料的惰性表面没有可供细胞进行识别的特定位置信息，并存在亲水性和细胞亲和性不足等缺点，影响了成骨细胞和血管内皮细胞在其表面的黏附生长，成为制约其作为理想组织工程支架材料的主要障碍之一。纳米羟基磷灰石(nHA)和β磷酸三钙微结构类似于天然骨基质，并与天然骨内无机矿物质有相近的尺寸，有助于人体细胞和大分子对其识别，从而可提高材料的生物活性、利用度和生物相容性；同时nHA释放的钙和磷等离子可以参与骨代谢，能更好地促进骨的形成，但由于其强度低，脆性大，使应用受限。
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法，所制得的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料是一种机械强度较高，易于降解同时具有骨诱导特性的新型骨修复材料。
[0007]—种PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤:
[0008]步骤1，制备载药壳聚糖微球:将1500~2000重量份羧甲基壳聚糖溶于酸性溶液中形成第一溶液；将I~2重量份人重组脂联素(recombinant human globularadiponectin，rh-gAPN)和I~2重量份人重组骨形态发生蛋白(rhBMP-2)在酸性溶液中溶解形成第二溶液；将第一溶液和第二溶液溶于含2wt%斯盘-80的液体石蜡中，于室温(20~25°C)下搅拌均匀形成乳液；将交联剂缓慢滴入上述乳液中，通过搅拌使交联充分完成；依次用石油醚、异丙醇和双蒸水反复洗涤交联后的产物，冻干后即得载药壳聚糖微球；
[0009]步骤2，选用小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用改性剂对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66~1.5 ;然后在800°C~1100°C温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨粉；所述小牛关节头或胫骨的骨骺端优选新生小牛关节头或胫骨的骨骺端或月龄I至3的小牛关节头或胫骨的骨骺端。
[0010]步骤3，将5~8重量份聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氧六环中，加入2~6重量份改性煅烧骨粉，充分搅拌后加入I~5重量份所述载药壳聚糖微球并充分搅匀，倒入平皿中于冷冻过夜，冻干后即得PLGA改型载生物因子微球骨替代材料。
[0011]如上所述的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法，优选的:步骤1，制备载药壳聚糖微球:将1750重量份羧甲基壳聚糖溶于酸性溶液中形成第一溶液；将I重量份人重组脂联素和I重量份人重组骨形态发生蛋白在酸性溶液中溶解形成第二溶液；将第一溶液和第二溶液溶于含2wt%斯盘-80的液体石蜡中，于室温下搅拌均匀形成乳液；将交联剂缓慢滴入上述乳液中，通过搅拌使交联充分完成；依次用石油醚、异丙醇和双蒸水反复洗涤交联后的产物，冻干后即得载药壳聚糖微球。
[0012]如上所述的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法，优选的:步骤3，将4重量份聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氧六环中，加入6重量份改性煅烧骨粉，充分搅拌后加入5重量份载药 壳聚糖微球并充分搅匀，倒入平皿中于_20°C冷冻过夜，冻干72h后即得PLGA改型载生物因子微球骨替代材料。
[0013]如上所述的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法，优选的:所述改性煅烧骨粉的骨基质晶相羟基磷灰石:β -磷酸三钙=1:3。
[0014]如上所述的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法，优选的:所述酸性溶液是体积分数为2%的乙酸溶液。
[0015]如上所述的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法，优选的:所述改性剂选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和磷酸中的一种或几种。
[0016]如上所述的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法，优选的:所述交联剂为三磷酸钠水溶液，优选质量分数为5%。
[0017]本发明方法所制备的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料中:微球直径均匀，载药支架孔径大小合适并相互穿通，支架材料对成骨细胞前体细胞具有促增殖作用。另外，PLGA改型载生物因子微球骨替代材料是一种新颖的双因子缓释复合载体，对于研究双因子缓释时的协同效应具有重要意义。
[0018]本发明方法有机结合各种骨缺损修复材料，制备了满足临床上骨缺损修复时的要求的骨替代材料，即本发明方法所制备的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料具有一定形态和机械强度，同时能缓释促进骨形成的生物活性因子，又能在骨缺损局部释放钙、磷离子。


[0019]图1为本发明实施例1所制备的载药壳聚糖微球示意图；
[0020]图2为本发明实施例1改性煅烧骨粉XRD衍射结果图；
[0021]图3为本发明实施例1PLGA改型载生物因子微球骨替代材料示意图；
[0022]图4为本发明PLGA改型载生物因子微球骨替代材料体外缓释实验结果；
[0023]图5为本发明PLGA改型载生物因子微球骨替代材料对成骨细胞增殖能力的影响实验结果。

[0024]以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0025]实施例1
[0026]PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法包括以下步骤:
[0027]制备载药壳聚糖微球:将900mg羧甲基壳聚糖溶于29ml体积分数为2%的乙酸溶液中形成第一溶液； 将500 μ g人重组脂联素和500 μ g重量份人重组骨形态发生蛋白(本实施例中为rhBMP-2,Genscript Pharmaceuticals,Korea)在Iml体积分数为2%的乙酸溶液中溶解形成第二溶液；将第一溶液和第二溶液溶于300ml含2wt%斯盘-80的液体石蜡中，于室温下搅拌均匀形成乳液；将70mL质量分数为5%的TPP溶液缓慢滴入上述乳液中，通过搅拌使交联充分完成；依次用石油醚、异丙醇和双蒸水反复洗涤交联后的产物，冻干后即得载药壳聚糖微球，其电镜扫描图如图1所示。
[0028]选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用磷酸氢二铵对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.5 ;然后在1000°C温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨粉。如图2所示，XRD衍射结果图表明，改性煅烧骨粉的骨基质晶相羟基磷灰石:β_磷酸三钙=1:3。
[0029]将720mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于12ml 二氧六环中，加入1080mg改性煅烧骨粉，充分搅拌后加入900mg载药壳聚糖微球并充分搅匀，倒入平皿中于-20°C冷冻过夜，冻干72h后即得PLGA改型载生物因子微球骨替代材料，其电镜扫描图片如图3所示。
[0030]实施例2
[0031]PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法包括以下步骤:
[0032]制备载药壳聚糖微球:将1500mg羧甲基壳聚糖溶于40ml体积分数为2%的乙酸溶液中形成第一溶液；将Img人重组脂联素和Img重量份人重组骨形态发生蛋白(本实施例中为rhBMP-2,Genscript Pharmaceuticals,Korea)在2ml体积分数为2%的乙酸溶液中溶解形成第二溶液；将第一溶液和第二溶液溶于500ml含2wt%斯盘-80的液体石蜡中，于室温下搅拌均匀形成乳液；将含5mg三磷酸钠的溶液缓慢滴入上述乳液中，通过搅拌使交联充分完成；依次用石油醚、异丙醇和双蒸水反复洗涤交联后的产物，冻干后即得载药壳聚糖微球。
[0033]选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用磷酸二氢铵对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.6 ;然后在800°C温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨粉。[0034]将500mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于IOml 二氧六环中，加入600mg改性煅烧骨粉，充分搅拌后加入500mg载药壳聚糖微球并充分搅匀，倒入平皿中于_20°C冷冻过夜，冻干72h后即得PLGA改型载生物因子微球骨替代材料。
[0035]实施例3
[0036]PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的制备方法包括以下步骤:
[0037]制备载药壳聚糖微球:将2000mg羧甲基壳聚糖溶于50ml体积分数为2%的乙酸溶液中形成第一溶液df2mg人重组脂联素和2mg重量份人重组骨形态发生蛋白(本实施例中为rhBMP-2,Genscript Pharmaceuticals,Korea)在5ml体积分数为2%的乙酸溶液中溶解形成第二溶液；将第一溶液和第二溶液溶于600ml含2wt%斯盘-80的液体石蜡中，于室温下搅拌均匀形成乳液；将含8mg三磷酸钠的溶液缓慢滴入上述乳液中，通过搅拌使交联充分完成；依次用石油醚、异丙醇和双蒸水反复洗涤交联后的产物，冻干后即得载药壳聚糖微球。
[0038]选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用磷酸对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.66 ;然后在1100°C温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨粉。
[0039]将800mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于12ml 二氧六环中，加入200mg改性煅烧骨粉，充分搅拌后加入1OOmg载药壳聚糖微球并充分搅匀，倒入平皿中于-20°C冷冻过夜，冻干72h后即得PLGA改型载生物因子微球骨替代材料。
[0040]实施例4
[0041]PLGA改型微球骨替代材料的制备方法包括以下步骤:
[0042]制备空白壳聚糖微球:将900mg羧甲基壳聚糖溶于29ml体积分数为2%的乙酸溶液中形成第一溶液；将第一溶液溶于300ml含2wt%斯盘-80的液体石蜡中，于室温下搅拌均匀形成乳液；将含3.5mg三磷酸钠的溶液缓慢滴入上述乳液中，通过搅拌使交联充分完成；依次用石油醚、异丙醇和双蒸水反复洗涤交联后的产物，冻干后即得空白壳聚糖微球。
[0043]选用新生小牛关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水充分荡洗后利用磷酸氢二铵对骨原料行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.5 ;然后在1000°C温度条件下煅烧改性后的骨原料彻底去除骨材料的免疫抗原性，获得改性煅烧骨粉。
[0044]将720mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于12ml 二氧六环中，加入1080mg改性煅烧骨粉，充分搅拌后加入900mg空白壳聚糖微球并充分搅匀，倒入平皿中于_20°C冷冻过夜，冻干72h后即得PLGA改型微球骨替代材料。
[0045]实验例I
[0046]PLGA改型载生物因子微球骨替代材料体外生物活性因子缓释检测
[0047]将50mg实施例1制备的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料和5mLPBS缓冲液加入到离心管中，置于37°C恒温振荡培养箱中，IOd内每天同一时间取样I次，取样前先将样品悬浮液于12000r/min下高速离心5min，取液50 μ L，用BCA法检测PLGA改型载生物因子微球骨替代材料中生物活性因子的释放量。每次取样后向离心管中补加新鲜配的PBS缓冲液50 μ L。图4所示的实验结果证明PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的生物活性因子在体外稳定缓释至少可达60天。用实施例2和实施例3制备的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料重复上述实验，生物活性因子在体外稳定缓释至少可达56天。[0048]实验例2
[0049]PLGA改型载生物因子微球骨替代材料对成骨细胞增殖能力的影响
[0050]在96孔板中每孔加入5 X IO5个MC3T3细胞，隔日加入实施例1制备的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料的浸提液，于10%FBS的DMEM中复合培养24和48小时后终止培养，利用CCK8试剂盒进行检测，得到各组实验的OD值。以实施例4制备的PLGA改型微球骨替代材料为阴性对照，每个样品设5个复孔。使用本方法制备的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料，将其浸提液处理成骨细胞的前体细胞，观察PLGA改型载生物因子微球骨替代材料释放的生物活性因子在体外条件下是否具有促进成骨细胞的前体细胞增殖的作用。如图5所示结果表明，在24小时和48小时，用浸提液处理的细胞增殖情况均优于对照组，尤其是在48小时，细胞增殖是对照组的1.2倍。用实施例2和实施例3制备的PLGA改型载生物因子微球骨替代材料重复上述实验，在48小时细胞增殖均为对照组的1.15倍。
[0051 ] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任 何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。