专利名称：用于治疗或诊断骨障碍和/或心血管障碍的组合物的制作方法用于治疗或诊断骨障碍和/或心血管障碍的组合物本发明涉及用于治疗或预防骨障碍和/或心血管障碍的组合物，其包含多核苷酸拮抗剂/抑制剂，要受到抑制的所述多核苷酸能够降低或抑制FZD3 (Frizzled-3)或其生物学活性衍生物的表达。这些骨障碍尤其包括，骨质疏松、骨量减少(osteopenia)、骨折、骨癌以及骨稳态破坏。要使用本发明的化合物治疗的心血管疾病可选自:梗塞、中风、高血压、血栓形成、血管腔狭窄、冠脉综合征、血管性痴呆、心衰竭、肾衰竭、压力相关心血管疾病、以及动脉粥样硬化。在这些医疗干预中要使用的优选的化合物为拮抗化合物如核酸分子，其针对能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物表达的多核苷酸。这种需要拮抗的多核苷酸的一个实例为miR-31或其5’或3’异构体或变体。而且，本发明还涉及用于诊断骨障碍和/或心血管障碍的方法和组合物。要在这些诊断方法中使用的化合物可以为能够检测到可降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物表达的多核苷酸的化合物(如引物和探针)。根据本发明，miR-31 (或miR-31或其5’或3’异构体或变体)为能够降低或抑制FZD3表达的多核苷酸。人们已经认同的是细胞和组织中损伤的累积为老化及年龄相关疾病的主要驱动力(Kirkwood, Cell (2005)，120:437-474)。成体干细胞及始祖细胞为反作用于这种功能衰退的一个组织水平上的修复系统。其自我更新及分化能力对于组织和器官的平衡至关重要。在人体的不同组织中都已经鉴别出具有高度分化潜能的成年人干细胞及始祖细胞，其代表了应维持高水平组织功能性的一群细胞。然而，其功能也随着年龄而衰退(Rando, Nature (2006)，441:1080-1086)。在异种共生的小鼠模型中已经鉴别出老的系统环境包含的因子或者不能促进或者活性抑制组织成功再生(Conboy，Nature(2005 ),433:760-764 )，而年轻动物的系统环境中包含的因子促进组织成功再生(Matsumoto, Eur Heart J (2009)，30:346-355)。内脏脂肪连生为人类老化的标志之一(Huffman, Biochem Biophys Acta(2009)，1790:1117-1 123)，而ASC的成骨分化潜能随年龄而下降。这种下降并非由于成骨前体的丢失(Zhu，J Tissue Eng Regen Med (2009)，3:290-301)，这表明其中涉及了改变细胞行为的因子。进一步地，由于脂肪组织沉积物中的前脂肪细胞和内皮细胞表现出紧密的关系(Hausman，J Anim Sci (2004)，82:925-934)体现出的ASC和内皮细胞在体内的联系，这一点支持了这些细胞类型之间存在旁分泌关系。然而，这些改变细胞行为的因子的来源迄今为止都是未知的，对于这些因子的特性罕有了解，其中似乎涉及到Wnt和TGF- P信号转导(Carlson, Aging Cell(2009 ),8:676-689 )。除了多种腺体外，分泌入血流的一个来源为内皮细胞自身，在更大的年龄时为衰老的内皮细胞，因为其在老化过程中在体内尤其是在动脉粥样硬化的位点发生累积(Erusalimsky, Handb Exp Pharmacol (2006), 213-248;Erusalimsky, Exp Physiol (2009), 94:299-304) ;Minamino, Circ Res (2007)，100:15-26)。已经鉴别出几种蛋白质随着衰老而增加(Chang, Exp Cell Res (2005)，309:121-136)，其中在衰老内皮细胞的上清中发现的白介素8的水平最多50倍高(Hampel, Exp Gerontol (2006) , 41:474-481 ) 对血液中的一种运输基质已有描述:多种因子包装成的外来体，通过胞吐作用分泌的有膜包被的颗粒，并且通过与靶标组织的细胞融合而在细胞-细胞或器官-器官通讯中起重要作用(Caby, Int Immunol (2005)，17:879-887)。外来体为大小为40-100nm的释放入细胞外环境的核内体来源的膜囊泡。其可通过允许蛋白质、脂类及mRNA和miRNA在细胞间进行交换而对细胞间通讯起作用(Valadi，Nat Cell Biol(2007),9:654-659;Viaud, PLoS One (2009)，4: e4942)。然后，所包含的因子如 miRNA、mRNA和蛋白质影响靶标细胞的行为。实例有内皮始祖细胞来源外来体，其在被摄取时诱导内皮细胞的血管形成(Deregibus，Blood (2007)，110:2440-2448);患有肺动脉高血压的病人中的内皮来源外来体(Bakouboula, Am J Respir Crit Care Med (2008)，177:536-543)；释放外来体并将组织微环境改变为有助于肿瘤进展的卵巢癌和神经胶质母细胞瘤的细胞(Keller, Cancer Lett (2009),278:73-81;Skog, Nat Cell Biol (2008)，10:1470-1476)。尤其是已有建议将肿瘤细胞释放的携带有被T细胞识别的抗原分子的外来体作为抗癌疫苗的无细胞抗原来源(Escudier, J Transl Med (2005) , 3:10; Iero, Cell DeathDiffer (2008), 15:80-88;Morse, J Transl Med (2005),3:9;Viaud, Horm Metab Res(2008), 40:82-88; Viaud, PLoS One (2009)，4:e49429)。然而，对组织再生或抑制组织再生中涉及的机制和因子仍然了解得太少，因此几乎不可能影响这些因子在组织再生中的作用。此项技术问题已经通过本文提供的实施方式及权利要求中提供的方案得到解决。因此，本发明提供了用于在受试者中治疗或预防骨障碍和/或心血管障碍的组合物，其包含多核苷酸抑制剂，要抑制的所述多核苷酸能够降低或抑制friZZled3 (FZD3)或其生物学活性衍生物的表达，这些在下文会进一步进行描述和示例性说明。而且，本发明提供了用于在患者中治疗或预防骨障碍和/或心血管障碍的方法，包括施用有效量的包含了多核苷酸抑制剂的组合物，要抑制的所述多核苷酸能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物的表达。如本文提供的，在此项医疗干预(即，本文公开的医疗/制药用途)和治疗/预防障碍的方法中要抑制 的多核苷酸可以为miR-31或其5’或3’异构体或变体。进一步地，本发明提供了用于在受试者诊断骨障碍和/或心血管障碍的组合物和方法。在本发明的上下文中，这些骨障碍的实例为骨质疏松、骨量减少、骨折、骨癌、骨稳态破坏或者。这些心血管障碍的实例为心血管疾病，如中风、梗塞、高血压、血栓形成、血管腔狭窄、冠脉综合征、血管性痴呆、心衰竭和肾衰竭、以及动脉粥样硬化(Erusalimsky, J Appl Physiol(2009)，106:326-32)。如附随的实施例中所描述的，还意外地发现miR-31在压力诱导的衰老内皮细胞及压力诱导的早熟衰老的内皮细胞中有特异性增加。因此，miR-31的拮抗剂/抑制剂还用于本发明的上下文中用于压力相关心血管障碍的医疗干预，如由于氧化压力或缺氧/再灌注损伤造成的心血管障碍。根据上文及本文提供的实验数据，本发明涉及用于治疗或预防骨障碍和/或心血管障碍的组合物，其包含能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物表达的多核苷酸的拮抗剂/抑制剂和/或miR-31或其5’或3’异构体或变体的拮抗剂/抑制剂。优选地，所述受试者为人受试者。还提供了用于在受试者中治疗或预防骨障碍和/或心血管障碍的方法，所述方法包括施用有效量的包含能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物表达的多核苷酸的拮抗剂/抑制剂的组合物和/或施用有效量的包含miR-31或其5’或3’异构体或变体的拮抗剂/抑制剂的组合物。再次地，要使用本治疗方法治疗的最优选的受试者为需要医疗干预的人受试者。在本发明的上下文中，意外地发现了衰老的外来体(尤其是来源自衰老细胞的外来体)是如何影响成体干细胞从而影响组织再生的。出于此目的，本发明者研究了这些干细胞的两项主要特征:自我更新/细胞分裂以及分化潜能。选择来源自脂肪组织的干细胞(ASC)作为模型研究衰老内皮外来体对成体干细胞可能的效应。进一步地,在本发明的上下文中,惊人地发现衰老内皮细胞分泌的miRNA包装成为外来体，这些囊泡被靶标细胞摄取，表明其可能具有旁分泌信号转导功能，还发现在体外的年轻的和衰老的内皮细胞之间具体miRNA的量有差异。如在本发明的上下文中发现的，有一种微小RNA (miRNA) 一miR-31在衰老细胞的上清中且在年纪较大的供体亚组的血液中有显著增加，其是由外来体保护和运输的。进一步地，在本发明的上下文中，发现ASC在接触衰老内皮细胞的上清或纯化的外来体时且在接触年老个体的血液来源外来体时摄取miR-31。在本发明的上下文中，鉴定出负责成骨抑制的miR-31的靶标为frizzled-3(FZD3 )，迄今对其描述只有其对神经系统发育有重要作用，因为FZD3敲除小鼠表现出轴突生长和导向的缺陷(Endo, Mol Cell Biol (2008 ) , 28:2368-2379; Stuebner, DevDyn (2010) , 239: 246-260; Wang, J Neurosci (2006) , 26: 2147-2156 ; Wang, J Neurosci(2002),22:8563-8573;Wang, J Neurosci (2006)，26:366-364)。进一步地，本文中发现miR-31抑制成骨分化并增加ASC的增殖。这些惊人的发现显示了降低或抑制FZD3表达的多核苷酸(例如但不限于)miR-31代表了生物学老化或年龄相关疾病(如骨质疏松、骨量减少、骨折以及骨稳态破坏，或心血管疾病，如中风、梗塞、高血压、血栓形成、血管腔狭窄、冠脉综合征、血管性痴呆、心衰竭和肾衰竭、或动脉粥样硬化等等)的新型标志物。进一步地，降低或抑制FZD3表达的多核苷酸的拮抗剂/抑制剂如miR-31或其5’或3’异构体或变体的拮抗剂/抑制剂代表新型治疗剂。因此，尤其是miR-31和/或其5’或3’异构体或变体是所有需要骨发生和骨形成的疾病中的新型治疗靶标，所述疾病如骨质疏松、骨量减少、骨折、骨癌、骨稳态破坏 、骨癌等等，以及心血管疾病，如中风、梗塞、高血压、血栓形成、血管腔狭窄、冠脉综合征、血管性痴呆、心和肾衰竭或动脉粥样硬化。miR-31的3’和5’异构体的实例显不于表3。在本发明的上下文中，检测了 ASC的增殖和分化能力以测试miR-31递送的功能性。如在本发明上下文中发现的，在一批之内达到的细胞数量较高，而衰老的外来体或单独miR-31部分抑制成骨分化。进一步地，在本发明的上下文中，惊人地发现miR-31在年老供体的血清中显著上调。这表明miR-31的外来体递送在细胞衰老过程中不仅在体外,也在血液中发现。进一步地，在本发明的上下文中，描述miR-31不存在于血清来源的外来体中。使用年老血液来源的外来体也再次观察到了骨发生的抑制。就此来说，因此，在本发明的上下文中，miR-31是一种有价值的工具，为老化及年龄相关疾病(如骨质疏松、骨量减少、骨折或骨稳态破坏，或心血管疾病，如中风、梗塞、高血压、血栓形成、血管腔狭窄、冠脉综合征、血管性痴呆、心和肾衰竭或动脉粥样硬化)的生物标志物。此外，在本发明的上下文中，miR-31除了在年老受试者中有上调之外，还发现miR-31在第一组实验的4个骨量缺少病人中的2个中有提高。如在所包含的实施例中所提供的，在更详细的实验中，10个在血清中发现有miR-31的骨量缺少的病人中有7个或者稳定患有骨质疏松，或者发展为骨质疏松。进一步地，如在附随的实施例中显示的，抑制miR-31增进了成骨分化，而瞬时增加miR-31导致成骨分化降低。这项发现表明抑制miR-31增进成骨细胞形成。这在骨障碍如骨质疏松的医疗干预中非常有用。进一步地，miR-31的表达提示了患有这些骨障碍(也提示了患有心血管障碍)。因此，本文还提供了用于检测miR-31的特异性测定。这项检测测定优选地是在生物学样品如血清和血浆等等上进行的。骨质疏松为一种疾病，特征在于骨质低、骨组织有结构退化，导致骨骼脆弱、对骨折易感度增加。骨质疏松为一种年龄相关的系统性病况，一般天然发生于哺乳动物中(主要是人)(Xu, Endocr Rev (2010),31 (4):447-505)。因此，本发明还提供了骨障碍如骨质疏松和/或骨量减少的良好且可靠的生物标志物。本文提供的生物标志物还可用于心血管障碍的诊断中。所附随的实施例还表明miR-31在压力诱导的衰老内皮细胞中提高。进一步地,如本文所显示的，miR-31在压力诱导的早熟衰老的内皮细胞的外来体中有所提高。因此，miR-31还提示有心血管障碍。一般地，根据本发明，在提到在本发明的上下文中要抑制的多核苷酸时，所述多核苷酸能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物的表达，这些在本文有详细的示例性描述。如在本发明中表明的，FZD3的表达可由本文描述的包含在衰老的外来体中的多核苷酸例如通过与FZD3的·mRNA杂交得到降低或抑制。因此，例如，可诱导FZD3mRNA的降解或阻止其翻译，这都可导致FZD3表达的抑制或降低。因此，抑制本文描述的抑制或降低FZD3表达的多核苷酸会增加FZD3的表达。在本发明的上下文中，测试了经过成骨分化的ASC中FZD3的转录。事实上，相对于以对照培养基处理的细胞，其在4天后上调(图7A)。此外，相比于以年轻外来体及对照处理细胞，FZD3水平在以衰老外来体处理后显著下调(图7B)。miR-31转染24h后，FDZ3也有所下调，但没达到显著水平，这可能是由于细胞不分化时FDZ3的mRNA水平太低(图7C)。因此，FZD3不仅代表了一种标志物，还是成骨分化的一个必要的因子，并成为本发明上下文中的ASC中要抑制的多核苷酸的直接靶标。如本发明中描述及示例表示的，对在本发明的上下文中要抑制的多核苷酸的抑制对于在受试者中治疗或预防骨质疏松、骨量减少、骨折、骨稳态破坏，或心血管疾病，如中风、梗塞、高血压、血栓形成、血管腔狭窄、冠脉综合征、血管性痴呆、心和肾衰竭、或动脉粥样硬化中尤其有用。在本发明的一个实施方式中，在本发明的上下文中要抑制的多核苷酸(B卩，其能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物的表达的多核苷酸)(如miR-31)，可为微小RNA(也缩写为miRNA或miR)或其前体、模拟微小RNA或其前体、siRNA或其前体、长链非编码RNA或其前体、snRNA (小/短发夹RNA)或其前体、stRNA (小瞬时RNA)或其前体、fRNA (功能性RNA)或其前体、snRNA (小核RNA)或其前体、snoRNA (小核仁RNA)或其前体、piRNA(piwi相互作用RNA)或其前体、tasiRNA (反式作用小/短干扰RNA)或其前体、aRNA (反义RNA)或其前体或小非编码RNA或其前体。根据本发明，上文提到的人工多核苷酸与上文提到的生理多核苷酸可对FZD3或其生物学活性衍生物的表达具有相同的效应(即，降低或抑制所述表达)，这些人工多核苷酸抑制剂可同时为这些生理多核苷酸的抑制剂。如本文所使用的，在本发明的上下文中要抑制的多核苷酸(即能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物的表达的多核苷酸)的“前体”可为相应多核苷酸成熟过程中的对应多核苷酸的形式。例如,在本发明的上下文中,微小RNA或模拟微小RNA的前体可为初级miRNA (pr1-miRNA)或前体miRNA (pre-miRNA),其都是在miRNA成熟过程中发生的形式。二者都是单链转录物(即ssRNA)，其折叠成特征性的称为“发夹环”的分子内二级结构，其含有一串大约18-23个碱基对，其中可能被错配打断。在本发明的上下文中，SiRNA的前体可为长链dsRNA分子或较短的“发夹环” ssRNA分子。这两种类型的SiRNA前体可含有一串没有任何错配的碱基对。目前用于哺乳动物miRNA成熟的模型为:初级miRNA (pr1-miRNA)的核裂解释放一段60 - 70nt的茎环中间物，称为直接miRNA前体或前miRNA。从茎环前体的一个臂上产生大约 18-23nt 长的成熟 miRNA (Bartel, Cell (2004)，116:281 - 297; Lee, EMBO J(2002), 21:4663 - 4670;Zeng and Cullen, RNA (2003)，9:112 - 123)。在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明要抑制的多核苷酸为微小RNA或其前体或模拟微小RNA或其前体。在本发明的上下文中描述的要抑制的多核苷酸可以为任何长度。优选地，所述核苷酸的长度为约15至约100个核苷酸，更优选地为约18至约27个核苷酸，最优选地为约20至约24个核苷酸。在本发明的一个中，在本发明的上下文中要拮抗/抑制的多核苷酸(即，其能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物的表达的多核苷酸)和/或要拮抗/抑制的miR-31或其5’或3’异构体或变体可选自:(a)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸(即miR-31);(b)与(a)的多核苷酸有至少80%的同一性的多核苷酸；(c)包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列(即，miR-31的种子序列:GGCAAGAU)的多核苷酸；及Cd)根据(b)的包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列(即，miR-31的种子序列:GGCAAGAU)的多核 苷酸。根据本发明，多核苷酸的同一性水平指的是相对所参考的SEQ IDNO的核苷酸序列的全长的同一性，以碱基对的方式评估，其中每个缺口计为一个错配。例如，术语“同一性”可在本文用于本发明中要抑制的多核苷酸的情况下，其具有的核酸序列与包含或由SEQ IDNO:1 (成熟 miR-31)、SEQ ID NO: 2 (miR-31 的种子序列)或 SEQ ID NO: 3 (前体-miR-31)(也显不于本文的表I中)中任何一项的核苷酸序列组成的多核苷酸有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，优选地是全长范围的同一性。进一步地，在本发明的上下文中，在本发明的上下文中要抑制的多核苷酸还可具有核酸序列，其与以下多核苷酸具有至少 80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的同一性:包含 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 的序列组成的核苷酸序列(如本文表I所示)或由其组成，其包括相应种子序列5’末端和/或3’末端的对应的成熟-或前体-miRNA序列的一个、两个或更多的核苷酸。例如，在本发明的上下文中，在本发明的上下文中要抑制的多核苷酸可具有核酸序列，其与以下多核苷酸具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性:包含或由核苷酸序列AGGCAAGAUGC组成的多核苷酸，即，SEQ ID NO:1的种子序列,其在5’末端包括对应成熟序列的一个核苷酸并在3’末端包括对应成熟序列的一个核苷酸。如果通过序列比对比较的两条核酸序列同一性上有差异，则术语“同一性”指的是较短序列，还指的是较长序列匹配所述较短序列的部分。因此，当比较的序列不具有相同长度时，同一性程度优选地指的是较短序列中与较长序列中包含的连续核苷酸残基相同的核苷酸残基百分比或指的是较长序列中包含的与较短序列的核苷酸序列相同的连续核苷酸的百分比。当然，如上文描述的，作为“连续核苷酸部分”的缺口被计为错配。在此上下文中，技术人员容易确定较长序列“匹配”较短序列的部分。而且，这些序列比对的定义(例如，“同一性”值的建立)将用于本文描述及公开的所有序列。表I:miRNA>miRBaseID (miRBase:http://www.mirbase.0rg,版本号 15:公布于2010年4月)，以及成熟和前体-miR序列(种子序列由下划线表示)。本发明涉及用于治疗或预防骨障碍和/或心血管障碍的组合物，其包含多核苷酸抑制剂，要抑制的所述多核苷酸能够降低或抑制FZD3(Frizzled-3)或其生物学活性衍生物的表达。这些骨障碍尤其包括骨质疏松、骨量减少、骨折、骨癌以及骨稳态破坏。要由本发明的化合物治疗的心血管疾病包括梗塞、中风、高血压、血栓形成、血管腔狭窄、冠脉综合征、血管性痴呆、心衰竭、肾衰竭、压力相关心血管疾病、以及动脉粥样硬化。要在这些医疗干预中使用的优选的化合物为拮抗性化合物，如针对miR-31及其衍生物的核酸分子。另外，本发明还涉及用于诊断的方法，并涉及组合物用于诊断骨障碍和/或心血管障碍的用途。要在这些诊断方法和用途用采用的组合物可为能够检测能够降低或抑制FZD3或其生物学活性衍生物表达的那些多核苷酸的化合物(如引物和探针)。本文提供miR-31作为能够降低或抑制FZD3表达的多核苷酸。