专利名称：自动种子取样器及对种子进行取样、试验并散装的方法自动种子取样器及对种子进行取样、试验并散装的方法 本申请是申请日为2005年8月26日、名称为“自动种子取样器及对种子进行取样、试验并散装的方法”、申请号为200580036539. I的中国专利申请的分案申请，该在先中国专利申请是国际申请号为PCT/US2005/030478的PCT国际申请进入中国国家阶段的申请。相关申请的交叉参考本申请要求已向美国于2004年8月26日作过申请的、美国临时申请系列号60/604,604的申请的优先权，还要求于2005年6月15日向美国作过申请的美国临时申请系列号60/691，100的申请的优先权。在此将其全部结合于此作为参考。 本发明涉及用来从生物材料如种子中获取试样的系统及方法。在植株研制及改良中，可以通过选择育种或遗传操作来实现植株的遗传改良，当取得所需改良时，就可在播种及收获若干代种子后发展到商业数量。并不是所有的种子都表现出所需性状，因此就需要从种群中将这些种子拣选出来。为加快散装种群的速度，就要获取统计试样并对其试验以便将不充分表达所需性状的种子从种群中拣选出来。但这种统计取样法必然使一些不具备所需性状的种子留存在种群中，同时也会无意将一些具有所需性状的种子排除在所需种群之外。 发明概述本发明涉及从种子中无损取样的系统及方法。该方法尤其适于比先前实践更大规模的自动取样。由于本发明中至少部分实施例可施行无损取样，因此就有可能对种群中每粒种子进行试验，并将那些不表现所需性状的种子拣选出来。这大大加快了对给定种子种群散装的进程，并可产生改良的最终种群。本发明的各种实施例便利了对种群中大部分或全部种子在播种前的试验，从而就避免了在种植不具所需性状的植株时造成的时间及资源浪费。本发明的系统一般包括一个取样台；一个取样器，用来从取样台内的种子处去除材料；一个种子运送机，用来将种子从取样台送到种子托盘的隔间；还有一个运送机，用于把取自种子的材料运送到试样托盘内的相应隔间。依据本发明中方法，种子被逐个送达取样台；而且当从种子处获取试样时，种子是盛装在取样台中的。每个试样被运送到试样托盘内的至少一个独立隔间，每个种子被运送到种子托盘内的一个与相应试样送达的试样托盘隔间有某种已知关系的隔间。可对试样进行试验，还可根据试验结果对种子分类。本发明的此种系统及方法有利于对种子进行自动化无损取样。它们允许大量的试验及分类，因而便利了具有所需性状的种子种群的散装。这些及其余特征与优势一部分将不解自明，一部分将在下文中指出。附图简介图I为依据本发明原理构建的种子取样系统的第一实施例的透视图；图2为种子取样系统中种子取样器组件的放大透视图3为种子取样器组件中料斗及种子输送机构的放大透视图；图4为用来从种子处刮取试样的拉刀的透视图；图5为用来驱动拉刀的滑座的透视图；图6为料斗输送机构内的活塞的透视图；图7为其上装有多个种子托盘及试样托盘的工作台的透视图；图8为两维平移机构的透视图；图9为种子运送机入口的透视图；图10为种子运送机出口的透视图；
图11为试样运送机出口的透视图；
图12为用在种子及试样运送机中的空气倍增器的透视图；
图13为符合本发明原理的高通过量种子取样系统的俯视图；
图14为高通过量种子取样系统的侧视图；
图15为种子取样系统的正面透视图；
图16为种子取样系统的后侧透视图；
图17为高通过量种子取样系统中取样台的透视图；
图18A为符合本发明原理的部分种子取样台的局部透视图，其中拉刀处于收回状态；
图18B为符合本发明原理的部分种子取样台的局部透视图，其中拉刀处于伸出状态；
图19A为种子取样台的侧视图，其中拉刀处于收回位置；
图19B为种子取样台的侧视图，其中拉刀处于伸出位置；图20为种子取样台的纵剖图；图21为种子取样台的正面端视图；图22为种子取样台的横剖图；图23A为选种轮的侧视图；图23B为选种轮的分解图；图23C为选种轮的垂直剖视图；图24为输送机构的正视图；图25为输送机构的侧视图；图26A为输送机构的透视图；图26B为输送机构的侧视图；图26C为过图26B中线26C-26C所在平面对输送机构所作的纵剖图；图26D为输送机构的仰视图；图27A为取样机构的垂直纵剖图；图27B为图27A所示取样机构的局部放大垂直剖视图；图28A为取样机构的垂直横剖图；图28B为图28A所示取样机构的局部放大剖视图；图29为描述已经过探测某一特定SNP多晶型的PCR处理过的玉米胚乳组织试样的等位基因图。
在附图的若干视图中，相应的参考数字表示相应的部分。
优选实施例的详细说明在图I中，基本上以20来标示依据本发明原理构建的自动种子取样系统的第一实施例。种子取样系统20适合用于从料斗处隔离出一粒种子，将其送入取样台，从种子处刮取一个试样，将试样传到试样容器，并把种子送到相应的种子容器。如图I所示，种子取样系统包括支座22、支座上的框架24、取样器组件26、装在两维平移机构30上的工作台28、用来从种子取样器组件处传输种子的种子运送机32、以及用来把取自种子的试样传输到种子取样器组件的试样运送机34。
如图I所示，在第一优选实施例中，支座22包括一个轮车40，它的四个支柱42前后由上纵梁44与下纵梁46连接起来，左右侧由上横梁48与下横梁50连接起来，并且其上还安有台面52。可在每个支柱42的底端安装一个小脚轮以便移动支座22。对于本发明来说，支座22的具体构造并不是关键性的，因此在不背离本发明原理的情形下，支座22可以是某些其它构型。同样如图I所示，框架24具有四个垂直伸展的支腿60，它们安装在台面52上并支承起一块平板62。取样器组件26装在平板62上，如下面详述的那样。在平板上还装有一个支杆64,它基本上沿水平方向延伸。支杆64的自由端具有第一与第二立柱66和68,分别用来安装种子运送机32及部分试样运送机34。对于本发明来说，框架24的具体构造并不是关键性的，因此在不背离本发明原理的情形下，框架可以是某些其它构型。如图I与图2所示，取样器组件26是安装在框架24的平板62上的。取样器组件包括一个料仓或料斗70、一个取样台72以及一个输送机构74，输送机构74把单个种子从料斗70传送到取样台。如图I与图3所示，工作台28适宜用来牢固地把多个种子托盘80及试样托盘82安装在固定位置及方向上。优先把每个种子托盘80及试样托盘82划分成多个隔间。种子托盘80内隔间的数量与配置优先对应于试样托盘82内隔间的数量与配置。这有利于种子与其试样间一对一的对应。但在某些实施例中，对于种子托盘的每个隔间来说，可能需要在试样托盘内提供多重隔间，比如说要对试样实行多次试验，或者要从相同的种子处获取不同的试样(如取自不同深度的试样)的时候。工作台28是安装在一个两维平移机构30上的，在此优选实施例中，两维平移机构30包括有一个底座90，底座90上装有第一线性致动器92以及第二线性致动器96，第一线性致动器92具有一个平移滑架94，平移滑架94装在底座90上，第二线性致动器96具有滑架98，滑架98装在第一线性致动器92的滑架94上。工作台28安装在第二线性致动器96的滑架98上，因此通过操作第一与第二线性致动器92与96就可在两维方向上精确移动工作台28。种子运送机32包括一个导管100，其入口 102靠近取样台72，其出口端104装在框架24的支柱66上。在导管100的入口端102处安有第一文丘里装置106用以在导管内产生朝向导管出口端104的气流，在导管100的出口端104处安有第二文丘里装置108用以产生朝向导管入口端102的气流。操作第一文丘里装置106就会在导管内产生一股气流并沿第一端将一个种子从取样台吸入导管内。然后操作第二文丘里装置108就会在相反相反方向产生一股气流，从而减缓种子的速度以便在种子排出导管出口端104及被传入托盘隔间时降低对种子的伤害。在此优选实施例中，第二文丘里装置108实际上阻止了种子的运动，并使其在重力作用下落入其托盘90的隔间内。可在导管100上配备各种位置传感器以便检测种子是否存在，并确保种子运送机32的正确操作。试样运送机34包括一个导管120，其入口端122靠近取样台72，其出口端124装在框架24的支柱68上。在导管120的入口端122处安有第一文丘里装置126用以在导管内产生朝向导管出口端124的气流。在出口端安有分离器128用以从携带试样材料的气流中将试样材料分离出来，这样就不会将试样吹出托盘92的隔间之外。分离器还优先包含一个过滤器以防止试样的交叉混杂。如图2所示，种子取样组件26适合装在支柱140上的平板62上。种子取样组件26包括一个料斗安装板142、一个滑式安装板144及其间的四个滑式托脚支撑146。料斗70 (见图3)安装在料斗板142上，它将种子逐个送入取样台72。取样台72包括一个种子嵌套148，种子嵌套148装在嵌套架150上，一对托脚152从滑式安装板144处伸出支撑起嵌套架150。嵌套148有一个通向其底面的凹口，料斗70将单个种子送入凹口中。在种子嵌套148的顶部开有一道狭槽，凹口内的种子的一部分得以通过狭槽露出来。拉刀154(见图4)安装在拉刀架156内，拉刀架156装在程序控制滑座160上的滑移板158上，并带有一个拉刀夹紧板162。程序控制滑座160 (见图5)装在滑式安装板144的下方，它驱动拉刀154通过种子嵌套148上的狭槽以便从种子嵌套凹口内的种子处取出试样。如在图4中可清楚看到的那样，拉刀154具有多个刀齿164，其高度朝向近端渐增，从而当拉刀154在狭槽中行进时，就会逐渐加深地切入嵌套148凹口内的种子中。引发的逐级刮削降低了对种子的损伤，保护了其生命力。而且，如下面详细描述的那样，通过在不同时间以不同深度切割，就可将来自同一种子不同深度的试样进行分离以便分别分析。试样传送管166从种子嵌套148的凹口处延伸出来，在其一端上具有一个接头168以便连接到试样运送机34上。从图3可清楚地看到，取样台26还包含一个料斗70。料斗70包括左右料斗安装板170与172、圆柱安装板174以及圆柱上托架176。料斗70还具有一个前板178、一个后板180、第一与第二侧板182与184以及底部186。隔板188将料斗分成第一与第二隔间190与192。第一隔间190盛装一定量的种子，这些种子将被逐个转入第二隔间192。活塞致动器194控制活塞196用来将一粒种子提出第一隔间外。喷气组件198将种子从活塞196端部传送到第二隔间192。第二隔间具有一个成形底部200，成形底部200有一个凹窝202用来接收种子并将其定位。活塞致动器210控制活塞214用来将一粒种子提出第二隔间192之外。在种子拣取过程中，喷气组件216用来搅拌种子。如图7所示，工作台28的托架220用来对正安装种子托盘90与试样托盘92，从而种子运送机及试样运送机就能将种子与试样送入各自托盘的对应隔间。试样托盘92 (如图所示)适合用来固定单个小瓶。当然，可以使用不同构型的托盘，比如当从同一种子处取得的多个试样配有多个隔间的时候。又比如一个试样被分成若干试样或从不同深度获取的试样被分离开来的时候。如图8所示，两维平移机构30还包含一个滑座230，滑座230具有导轨232和滑块234，且平行第一线性致动器92安置。第二线性致动器96安装在滑架94上，滑架98装在第一线性致动器92的滑架94上。工作台28安装在第二线性致动器96的滑架98上，从而、通过操作第一与第二线性致动器92与96就能在两维方向上精确移动工作台28。恰当控制平移机构就可使种子托盘90及试样托盘92的各个隔间对准种子运送机与试样运送机的出□。如图9所示，在种子运送机32的导管100入口端102处，托架240上装有一个空气倍增器242及一个种子检测管244。托架240包括区段246、248、250、252与254。如图2所示，托架240是安装在料斗安装板142上的。空气倍增器242 (如
图12所示)适合于连接到压缩气源上。当将空气应用于空气倍增器时，空气倍增器就会在文丘里效应下生成一股气流通过导管100。检测管244携有种子检测器256用以检测种子的通过情况。检测器256优先为光学检测器，而且对准检测管244的开孔，它能光学检测种子的通过情况。如
图10所不，种子排放组件260安置在种子运送机32的导管100出口端104处。排放组件安装在支柱66上，它配有托架262及排放支撑264。种子检测管266安装在托架 262上且携有种子检测器268以便检测种子的通过情况。检测器268优先为光学检测器，而且对准检测管266的开孔，它能光学探测种子的通过情况。空气倍增器270连接到种子检测管266上。空气倍增器(见
图12)适于连接到压缩气源上。当将空气应用于空气倍增器时，空气倍增器就会在文丘里效应下生成一股气流通过导管100。在空气倍增器270下方是一个连接管272，再往下是一个敞开式种子排放管274，敞开式种子排放管274也由种子排放管夹板276支撑，而种子排放夹板276是携装在种子排放管致动器278上的。试样运送机34的导管120入口端122通过接头168连接到试样排放管166。如
图11所示，导管120的出口端124连接到试样接头280上，试样接头280依次连接到空气倍增器282上，空气倍增器282又连接到晶片喷嘴组件284上。晶片喷嘴组件284安装在种子排放管夹板286上，而种子排放管夹板286是携装在排放致动器288上的。排放致动器安装在支柱68上。过滤器290安装在晶片喷嘴组件284的出口上以防止排出的种子混杂到其它隔间。
取样系统的操作在操作中，多粒种子，比如说，大豆种子沉积在料斗70中。种子输送机构74将单粒种子运送到取样台72。在取样台处，以最小程度影响种子生命力的方式从种子上取出试样材料。试样运送机34将试样从取样台72处除去。文丘里装置126在导管120内生成一股朝向出口端124的气流。试样材料被吸入导管中并朝向与导管120出口端124对准的试样托盘的隔间。分离器128将试样从承载它的气流中分离出来，并使试样落入隔间内。在一些实施例中，试样可能被分配到试样托盘内的两个或更多隔间，在这种情况下，两维平移机构30会使一个或更多附加隔间与出口 124对准。通过取样台72的操作就有可能准确协调试样托盘的运动，从而就能将来自种子不同部分尤其是不同深度的试样送到试样托盘的各个隔间。在完成对种子的取样后，种子运送机32将种子从取样台处除去。操作第一文丘里装置106就会在导管内产生一股气流并将一粒种子从取样台72吸入导管100中。然后操作第二文丘里装置就会在相反方向产生一股气流，从而减缓种子的速度以便在种子排出导管100出口端104及被传入种子托盘92隔间时降低对种子的伤害。第二文丘里装置108优先阻止种子的运动，并使其在重力作用下落入其托盘90的隔间内。可以定时操作第一与第二文丘里装置106与108，也可以由监测导管100的位置传感器来触发它们。在
图13-26中基本上以500来标示一种高通过量种子取样系统的实施例。如
图13与14所示，种子取样系统500包括一个取样台502、一个试样处理台504及种子处理台506。需要，但不是必需，将种子取样系统500安装在一个或多个能通过普通门道的轮车上，从而就可方便地运输该系统。在此优选实施例中，种子取样台502安装在手推车508上，试样处理台安装在手推车510上，而种子处理台安装在手推车512上。种子取样台502包括一个种子进给器514及一个种子切片机516。多个柱架518从手推车508表面处垂直向上伸展。平台522安装在柱架518顶端并支撑起种子切片机514。两个L形托架524从柱架518处水平延伸并支撑起平台526。工作台528由多个支柱530安装在平台526上并支撑起种子进给器514。多个柱杆532从板522处向上伸展。板534安装在柱杆532上。多个支柱536垂 挂在板534上并支撑起架板538。如
图13、14、15及16所示，种子进给器514包括一个料斗550，它的一个成形表面适于用来将沉积在料斗内的种子传送到分离轮552(见图23A到23C)。分离轮552在靠近料斗550的一个垂直平面内旋转，它具有多个彼此有间距的凹口 554，每个凹口 554内对应有一个开孔556与真空系统(无图)相通。分离轮552与变位电动机560 —起行进。分离轮552上的凹口 554逐个拣取种子，真空系统经由开孔556通过抽吸作用将种子固定在凹口内。刮种器562将种子逐个刮出凹口 554,使其通过导向件564落入分配器566的开孔中。如图24-26所不，分配器566包括一个心轴568,心轴568上具有多个(在优选实施例中为六个)横向贯穿的通道570。轴套572与574滑动安装在心轴568的各端以便在第一(内侧)与第二(外侧)位置间移动。在轴套572与574的相反两侧具有多对对准的开孔576与578。开孔576是狭长的，对开孔576与578要如此定尺寸及安置当轴套572与574位于其第一(内侧)位置(在图24中为左侧)时，一部分狭孔576与心轴568的通道570对准；而当轴套位于其第二(外侧)位置时，一部分狭孔576与第二开孔578与通道对准(在图24中为右侧)。致动器580有选择性地使轴套572与574在其第一与第二位置间滑动。分配器566借助托架582安装在线性致动器586的滑架584上，它相对导向件564平移并陆续使心轴568的每个通道570与导向件564对准，从而可使种子沉积于其中。可在导向件564附近装一种子检测器(无图)以确保有一粒种子沉积在各个通道570内。在工作台528上安装多个喷气嘴590，当致动器586将分配器566移动到其分配位置时，喷气嘴590与通道570对准。各个导管592与每个通道570对准，且每个导管都连接到种子切片机516的其中一个种子取样台600上。轴套572与574平移而使通道570内的种子落入导管592中。一个喷嘴590与各个通道570对准，并被驱动以利于来自通道570的种子通过导管592移到其各自的种子取样台600。优先有一开口 596穿过料斗550，当分离轮552转动时，开口 596与各个凹窝554内的开孔对准。可将开口 596连接到真空装置上以便抽吸任何污物或种子外皮碎片或者是可能阻塞凹窝554内开孔556及削弱分离轮552从料斗550处逐个选取种子能力的种子。种子切片机516至少包括一个取样台600，在此优选实施例中为六个。各个种子取样台600从传送到此的种子处去除试样材料。在此优选实施例中，每三组取样台600中的两组组配成一套，但取样台的数量及配置也可有变化。试样处理台504接收从种子处除去的并被运离各个取样台600的组织试样。与之相似，当已从种子处除去试样并将种子运离取样台600之后，种子处理台506接收该种子。每个种子取样台600都具有一个入口环602，入口环602连接到朝向小室604的导管590上。小室604的底面由致动器608 的推杆606端部形成。底部表面低于入口环602以确保整个种子都落入小室604中且不会只是部分处于小室中。在与入口环602相反侧可安置一个排气孔610以便将喷气嘴590处的空气放出。可在排气孔610上覆盖一个格栅以防止种子漏出小室604，而且在将种子送入小室中时能缓冲对其的冲击。推杆606将一粒种子提出到小室604外部并送入种子取样板616下侧的种子接收凹口 614中。取样板616具有一个取样孔618，种子接收凹口内的种子穿出取样孔618来。在取样板616的顶面形成一个取样槽620，这样凹口 614内种子的一部分就突进到沟槽中。取样板616上还有与种子接收凹口 614对准的侧向孔622与624。当推杆606将一粒种子提送到取样台600并送入平板616的凹口 614内时，机械手626与628就横穿过开孔622与624，并有所致动器630驱动而嵌入种子中并对其压缩。现已发现在取样过程中压缩至少某类种子可以改善取样后种子的生命力。对于某些种子如大豆种子来说，现已知压缩力能增强种子生命力，压缩力约在2. 5-5磅之间就足以增强生命力。取样拉刀650的多个刃口 652在沟槽内往复运动，从而刃口 652就能从凹槽614内刮取出一粒由推杆606与机械手626紧固的种子。刃口 652优先为平行状，并相对拉刀走向以小于九十度的倾角定位。需要，担不是必需，使刃口 652充分倾斜到使其中一个刃口始终与种子接触。使刃口成一定倾角从而就可在当前刀片脱离与种子的接触之前使下一个刀片与种子建立接触。在此优选实施例中，刃口定向角度约为六十度，当然这个角度在某种程度上还取决于拉刀的宽度。对于保持取样后种子的生命力来说，拉刀的宽度也是很重要的，而且可能根据种子类型及其湿度而改变。刃口 652交错排列，每次切割都较上次要深。可通过控制拉刀650的行进来控制试样材料的数量以及切割深度。试样较小且切割深度较浅，拉刀650的冲程就较短，试样较大且切割深度较深，拉到的冲程就较长。对于局部冲程来说，从种子上取得的组织可能挤夹在刃口 652之间。可通过拉刀650的行进与收回来帮助释放所有试样。比如说，在释放种子之后，可由拉刀650的行进与收回来除去挤压在刃口间的种子组织。
图19A及19B显示了拉刀650的全部行程。优先由线性致动器654来驱动取样拉刀650。在优选实施例中，单个致动器654驱动三个拉刀650。使用单个致动器操作多个拉刀可节省空间，且更经济。试样传输系统656包括一个管道658，管道658的入口 660与朝向取样孔618的通道662相通，取样板616上的沟槽620把取样拉刀650刃口 652产生的组织试样除去。管道658将试样传输到出口 664,在此处试样沉积在试样处理台504的专用试样固定器中。此种试样固定器可以是安装在手推车510的x-y变位盘670上的托盘668上的凹窝666,从而就可确定试样与其各自种子间的关系。试样传输系统656包含有一个喷气管672，喷气管672生成气流通过管道658以便将试样移过管道。可在线性致动器654上安装一个第二取样机构，并使其与拉刀650 —起移动。第二取样机构可包括一个取心装置674，取心装置674的取心工具676用来从拉刀650做出的种子切口出获取种子的插入取样。在此试样中的此种组织来自比拉刀650刮取的组织更深的地方，而且提供了不同的信息。在某些实施例中，由拉刀650取得的材料会被丢弃，而只保留取心装置674获取的试样。在某些实施例中，这两种试样都得以保留并分别保存以便分别测验。在另一些实施例中，唯一保留的试样是由拉刀650取得的试样。在不具备第二取样机构的实施例中，可由一个带有简单推杆的致动器来替代取心装置674及取心工具676,简单推杆伸过取样孔618以便将一粒种子推入凹口 614中。种子传输系统680在邻近凹口 614的地方有一入口 682以便在机械手626及628释放种子且推杆606将取样操作后的种子放低以后吸入种子。种子传输系统680将种子运输到手推车512上种子处理台506内的专用种子固定器中。此种种子固定器可以是安装在手推车612上x-y变位盘688上的托盘686上的凹窝684，从而就可确定试样与其各自种子间的关系。种子传输系统680包含有一个喷气管690，喷气管690生成气流通过管道680以便将试样移过管道。
操作说明在操作中，多粒种子,如大豆种子,被倒入取样系统500的料斗550内。这些种子流在重力作用下流向圆盘552，通过开口 556的抽吸作用每个孔穴554固持一粒种子。当变位电动机560带动圆盘552旋转时，刮种器562从圆盘处逐个刮取种子，种子在重力作用下通过导向件564落到出口。线性致动器586移动分配器566使分配器的各个通道570与导向件564对准以便通过开孔576将一粒种子装入通道570。当分配器566的所有通道570都填满后，线性致动器586将分配器移动就位以便将其种子装入种子切片机516的取样台600内。致动器580使开孔578与通道570对准，并移动轴套572与574使通道570中的种子落入通向取样组600的导管内。喷嘴590发出一阵气流促使种子从通道570处通过导管590并到达取样组600的小室604。所有的通道570优先顺序承载并同时将其种子排放到取样组600，但也可用其它某种方式对分配器进行程序操作。一旦种子到达取样台600，推杆606就将种子提入到平板616下侧的凹口 614内。可对推杆定形定尺寸以便实现种子的最优取向。在凹口 614内，种子的一部分突出取样孔618并突进到沟槽620中。拉刀650在沟槽620内平移，其刃口652从突进到沟槽620内的种子部分上去除材料,并在种子上形成小的切口。当各个拉刀650去除材料时,试样运输系统656吸取试样材料通过通道662并吸入入口 660。试样在管道658内行进,逐渐远离取样台600行向试样存储点，入试样托盘668上的凹窝666。可由取样装置674的取心工具676通过取样板676上的开孔618来获取第二试样。在取样完成后，推杆606收回，当种子落下时，取样后种子运输系统680将取样后种子运输到种子存储点，比如种子托盘686上的凹窝684。移动变位盘670及688使不同的凹窝对准试样运输系统656及种子运输系统680的出口，取样过程重复进行。当试样托盘668上所有凹窝666都装满后，就可对试样托盘内的试样进行试验，并根据对试样的试验结果来选择相应的种子托盘686上的种子。取样工作基本上优先不损害种子的生命力。
应用本发明提供了用于分析具有所需性状、标志或基因型种子的方法。从本发明的一个方面来说，分析方法使得一批或一堆种子种群得以分析，从而可逐个判定种子的化学及/或基因特征。本发明得到的试样可用来判定各种各样的物理、化学及/或基因性状。本发明方法中使用的化学分析示例有淀粉含量、蛋白质含量、油含量、脂肪酸分布判定等。在一种实施例中，本发明中的方法及装置可用在育种项目中用来选取具有所需性状或标志基因型的植株。本发明中方法可与任何育种研究法结合使用，而且可用来选取单代或多代。育种法的选择取决于植株繁殖模式、待改良性状的遗传性以及大批栽培品种的类型(如杂种、纯种等)。下面将陈述本发明中用于培育植株的有选择无限接近法。还要理解任何商业及非商业栽培品种都可用在育种项目中。各种因素，如应急活力、生长活力、受力容限、抗病能力、分支、开花、种子栽种、种子大小、种子密度、抵抗力及脱粒性能等将基本上决定选择。在一特定实施例中，本发明中方法可用来判定标志辅助育种项目中种子的遗传特征。此种方法可取得改善的标志辅助育种项目，其中在保持从种子取样器到田间个体同一 性的同时可实施无损直接种子取样。因而标志辅助育种项目产生一个高通过量平台，其中可在更短时间内更有效地对具有所需性状、标志或遗传型的种子种群进行散装，而只需较少的田地及劳动力资源。下面将更全面地描述这种优势。在一种实施例中，本发明提供了一种用以逐个分析具有遗传差异的种子种群中种子的方法。该方法包括在不影响种子发芽活力的情况下从种群内种子处去除试样，该试样中含有带DNA的细胞；对从试样中提取的DNA进行甄别以判断有无至少一项遗传标志；根据对DNA的甄别结果从种群中选取种子；用选取的种子栽培植株。如上所述，本发明中取样系统及方法保护了种子的发芽活力以便做到无损化。发芽活力指的是多数种子(即大于所有取样或种子的50% )在取样后仍保持活力。在一特定实施例中，至少约75%的取样后种子，而在某些实施例中至少约85%的取样后种子仍保持活力。应当注意的是，在一定条件下或对于某些应用来说，低比值的发芽活力也是允许的，比如说，在随时间增长而遗传成本降低，因为对于相通遗传成本来说可对更大数量的种子进行取样。在另一实施例中，在取样后发芽活力至少可保持约六个月以确保取样后种子的存活力，直到其到达田间以便栽种时。在一特定实施例中，本发明中方法还包括对取样后种子进行处理以便保持其发芽活力。此种处理基本上包含已知技术中在储存及运输时用于保护种子免受环境条件影响的任何方式。比如，在一种实施例中，在储存时或在栽种前运往田间图中用聚合物及/或杀菌剂对取样后种子进行处理用以保护取样后种子。可用精通技术的人员所知的能提供足够DNA产出量、DNA质量及PCR响应的任何DNA提取方法从种子中提取DNA。一种合适的DNA提取方法的无限示例为在离心作用下基于SDS的提取法。此外，可用那些精通技术的人员所知的任何放大法将提取出的DNA放大。举例来说，一种适当的放大方法为Amersham Biosciences制备的GetlOflliPhi DNA放大。对提取的DNA进行甄别以判断有无合适的遗传标志。那些精通技术的人员获知各种各样的遗传标志。对DNA甄别以判断有无遗传标志的方法可用在育种项目中来选取种子。甄别法可用作定量性状轨迹(QTL)、等位基因或染色体组区域(单模标本)。可用具有改进经典育种策略的最新分子生物技术使待选的等位基因、QTL或单模标本s —致化。
在一种实施例中，是根据与QTL有遗传联系的遗传标志的有无来选取种子的。通常令人关注的QTLs例子包含有，但不局限于，产出量、抗倒伏能力、高度、成熟度、抗病能力、防疫能力、营养缺乏抵抗力以及颗粒组成。或者，可根据与单模标本及QTL有遗传联系的标志的有无来选取种子的。此种QTL示例也包括无限制的产出量、抗倒伏能力、高度、成熟度、抗病能力、防疫能力、营养缺乏抵抗力及颗粒组成。对育种种群的选取最早开始于F2育种级，那时在起始育种杂交中使用纯合近亲繁殖母体。如果一个或多个杂交母体的杂合是为了关注的等位基因或标志的话，那么也可对Fl代取样并改进。育种人员可对F2种群进行甄别以找回种群中各个个体的标志遗传型。起始种群大小仅受可供甄别的种子数量的限制，而且可得以调整以达到成功识别所需个体数量的概率。参见Sedcole, J. R.的“恢复性状所需之植株数量” Crop Sci. 17 667-68(1977)。相应地，对于各种育种研究法及取样种群的近亲繁殖级来说，可以改变找寻所需遗传型的概率、起始种群大小以及目标种群大小。 可以根据育种研究法及目标来散装或分离选取后的种子。比方说，当育种人员甄别F2种群的抗病能力时，可将所有具备所需遗传型的个体分装并栽种在育种苗圃中。反之，如果从给定种群中选取对一个性状如颗粒产量有多变效应的多个QTL，那么育种人员可保存个体一致性，到田间结合各种目标QTL来区分个体。在将种子从切片实验室运送到田间时，可用若干种方法来保持单个种子同一性，这些方法包含有，但不局限于，将选取的种子运送到种子带、盒式托盘或变位托盘，栽种在泥炭罐中，以及手工逐个种植种子束。可根据育种目标及遗传复杂性进行多轮选取。本发明中运用甄别方法的优势包含有，但不限制于，每种群或育种品系所需劳动力及田地资源得以减少，每单位田地上用来评估更多数育种种群的容量得以增加，在种植前用来甄别育种种群所需性状的容量得以增加。通过限制用来改进所需遗传型而需要的田地空间，每个种群所需田地资源得以降低。比方说，一个具有1000个个体的种群种在田间，假如总共有40行的话，那么每行可种25粒种子。运用普通的组织取样法，会通过划擦叶子组织对全部1000株植株施行标记并手动取样。在授粉前要求有分子标志结果，而只有那些含有所需遗传组成的植株得以授粉。因此，如果判定50粒种子含有所需遗传组成，那么普通育种研究法就需要种植1000株植株以获取50粒种子。相对来说，本发明中的甄别方法使育种人员可在实验室中甄别出1000粒种子并在栽种前选出50粒所需种子。假如只有两行各25粒种子的话，那么就可在田间种下50个个体。另外，本发明中的甄别方法不需要在田间作标记或取样，从而就大大地节省了所需人力资源。除了能减少每个种群所需田地行数外，本发明中的甄别方法还能增加育种人员在给定育种苗圃内所评估的种群数量。在上述示例中，每个具有1000粒种子种群中的50粒种子含有所需遗传组成，运用以上示例，育种人员应用该发明中的方法可以评估每个种群含有50粒种子的20个种群，每个种群所需田地面积与用普通野外组织取样技术时单个种群所用田地面积相同。即使选取种群是为了单个等位基因，对于F2种群运用I : 2 I的期望分离比值，育种人员也能够在与单个野外组织取样种群同样田地面积上评估四个种群。种子切削的另一潜在优势就在于可用它来降低将植株种植在某些地形如生长艰难或经历艰苦环境条件或可能遭暴风雨摧残的地形中的风险。比如说，可将带有“最佳”遗传型或标志组成的种子种在地形I中，而将带有“次最佳”遗传型的种子种在地形2中。在这种情况下，一旦地形I中栽种的植株发生任何问题，那么地形2就可作后备之用。而这对于从发芽植株中获取用于遗传的组织试样的传统方法来说是非常困难的，因为需要将这些植株连根挖出并移植到第二地形。使用本发明中的方法就避免了移植的问题。本发明中的甄别方法还可用在用来将性状基因渗入到植株中的育种项目中。此方法包括从种群内种子上去除包括带有DNA的细胞的试样，对于从每粒种子处提取的DNA进行甄别以判断有无至少一个遗传标志，根据对DNA甄别的结果从种群中选取种子；从种子中栽培增殖性植株；在与另一植株杂交中将增殖性植株作为母本或父本。用遗传甄别来选取种子以便性状整合的示例包含，但不限制于，母本等位基因高重复频率识别，追踪感兴趣的转移基因或甄别以判断并无不想要的转移基因，选取杂种试验种子以及接合性试验。运用本发明中的甄别方法来识别高重复对等位基因频率使得待栽种在给定田地 单位上的每个种群所用行数减少，而种群数量或近亲繁殖品系增加。从而本发明中的甄别方法还可有效节约完成近亲繁殖品系转化所需资源。通过确保在种植前识别并丢弃那些调整过的不想要的转移基因S，本发明中的方法还提供了质量保证(QA)及质量控制。本应用在QA容量可有效消除非故意释放违规。本发明中的方法还可用来识别杂种种子以便转移基因试验。比如说，在BCnFl工作台上的近亲繁殖转化中，育种人员可以有效地做出一类杂交种子(配子选取除外)，其中有50%对于感兴趣的性状是半合子的，而另外50%是缺乏性状的纯种，这样是为了生成以供试验的杂交种子。然后育种人员就可以对在试验杂交及识别中产生的所有Fl种子进行甄别并选取那些半接合性的种子。此种方法的优势在于从杂种实验中得出的结论能够表达关于性状接合性的大批杂种基因。本发明中甄别方法关于识别并追踪关注性状的其它应用具有与上述所需田地及劳动力资源方面同样的优势。一般来说，转移基因转化项目多施行于多季节地区，而这里的土地及管理成本结构非常高。因此，无论是每个种群所需行数减少还是在给定田地单位内种群增加对于适度应用的成本来说影响是非常显著的。还有，本发明中的法还可用来通过在单倍体工作台上选取所需遗传型并识别倍数级以避免处理并改善后的非单倍体种子运到田地，从而改善双单倍体项目的效率。这两种应用都导致了每个种群所需田地资源的减少并能够在给定田地单位内评估更多的种群。在一种实施例中，本发明还提供了一种对于特定关注基因(GOI)进行预测萌芽接合性的验定法。该验定法根据每个细胞或每个染色体组内GOI及内部控制(IC)基因的相对复本数量的比值来预测萌芽接合性。一般来说，该验定法使用了已知接合性如轨迹(每个二倍体细胞两个复本)上为纯种的一个IC基因来进行对GOI的规范化测定。IC复本数量相对GOI的比值预测了细胞内的GOI复本数量。在一个纯种细胞内，对于任意给定基因(或唯一基因序列)来说，基因复本数等于细胞内的倍数级，因为在所有同种异体染色体中，该序列都处在相同的轨迹上。当一个细胞是为特定基因而杂合时，基因复本数将低于细胞的倍数级。从而可由细胞内基因复本数来判定任何轨迹上细胞的接合性。在一种特定实施例中，本发明提供了一种用来预测玉米萌芽接合性的验定法。在玉米种子中，胚乳组织是三倍体，而萌芽组织是二倍体。为IC纯合的胚乳将含有三个IC复本。胚乳GOI复本数可从0 (纯合负)到3 (纯合正);在关于GOI的种子杂合(或如果GOI是转移基因那么对于GOI是半合子的)中发现胚乳GOI复本数为I或2。胚乳复本数反映了萌芽的接合性一个纯合(正或负)胚乳伴随一个纯合萌芽，杂合胚乳(无论GOI复本数为I还是2)反映一个杂合(G0I复本数为I)萌芽。可从胚乳IC复本数与胚乳GOI复本数的比值(从0/3到3/3，即从0到I)中判定胚乳GOI复本数(可从0变到3)，然后可用它来预测萌芽的接合性。正如在技术上已为大家所知的那样，可用任何方便的用以量化复本数的验定技术来判定GOI或IC的复本数。适当的验定法示例包含有，但不局限于，REALHME (QAQ MAN ) PCR(APPLIED BIOSYSTEMS, FOSTER CITY, CA)以及INVADER (THIRDWAVETECHMOLOGIES, MADISON WI)验定法。要优先如此发展此种验定法，这样IC与GOI序列的放大效率就相同或非常接近。举例来说，在REALTME TAQ MAN PCR骀定法中,从单复本GOI (源细胞被判定为对GOI是杂合的)得到的信号将会在迟于从双复本IC得到信号一个放大周期后被探测得到，因为GOI的量是IC的一半。对于相同的杂种试样来 说，INVADER 验定法测得G0I/IC比倌约为I 2或0.5。对于相对GOI及IC都为杂合的试样来说，GOI信号会在与IC信号(TAQ MAN )相同的时间被探测得到，invader验定法所测G0I/IC比值约为2 : 2或I。这些准则适用于任何多倍体细胞或单倍体细胞(如花粉细胞)，因为GOI或IC的复本数正比于细胞的染色体组复本数(或倍数级)。因此，这些接合性验定法可应用于三倍体组织如玉米胚乳上。
示例以下示例仅仅是阐述性的，并不表示在任何意义上限定于本公示。
示例I本示例描述了一种使用轨迹上内部控制(IC)基因纯种(即在二倍体萌芽内为两个IC复本而在三倍体胚乳内为三个IC复本)来描述玉米萌芽接合性的验定法。在二倍体(或高倍数)生物如玉米的近亲繁殖品系内，内生性内部控制是典型的纯种；在此生物内第一代(在玉米内称为“R0”)的转移基因结果是典型的半合子的(也就是说，转移基因只典型地存在于两个或更多同种异体染色体的其中之一内。玉米(ZEAMAYS)是二倍体生物，因此“单复本”RO结果在每个细胞内有一个复本，而在每个单倍体染色体组内由0. 5个复本，“双复本” RO结果在每个细胞内有两个复本，而每个单倍体染色体组内有I个复本，依此类推。在此示例中微管蛋白被用作IC基因，而GOI是转移基因编码新链丝菌素II(NPTII)，新链丝菌素被用来卡那霉素抵抗力选择。从种子处获取胚乳(三倍体)组织(或者手工取样又或使用本发明中的自动取样器来刮削种子)。胚乳取样后种子发芽，从成功发芽植株上取得的叶组织(二倍体)也被取样以便遗传分析。叶组织与萌芽接合性直接相关，因而被用来表明胚乳接合性基本上预测萌芽的接合性，还被用来从胚乳处确定纯合性回应数。从胚乳组织与叶组织处提取全部染色体组DNA，使用INVADER ◎验定法并结合专门用于关注基因、NPTII或专门用于内部控制基因、微管蛋白的低核苷酸探头对全部染色体组DNA进行量化分析。使用普通分子生物技术测量了 GOI对IC的比值。参见表I。多次实验的结果概述列于表2中。
结果显示胚乳接合性基本上预测了萌芽的接合性(如叶子接合性所显示的那样)并且能够对所有发芽种子可靠地进行预测纯合性。而且，胚乳接合性分析几乎不会给出伪负纯种预测(尤其是当用自动取样器获取胚乳组织时)。这些结果表明，对于已知倍数级的一个细胞来说，GOI复本数与IC复本数的比值显示了细胞的接合性。此外，本发明中的接合性验定法能够在一个组织接合性的基础上预测另一组织接合性，也就是说，验定法能够根据胚乳接合性来预测萌芽接合性。
表I


一种自动种子取样器包含有一个取样台；一个取样器，用来从取样台内的种子上去除材料；一个种子运送机，用来把种子从取样台运送到种子托盘内的隔间；一个运送机，用来把从种子上去除的材料运送到试样托盘内的相应隔间。本发明中方法包括将种子逐个输入取样台；从取样台内的种子上去除试样；将试样传到试样托盘内的隔间；将种子传到种子托盘内的相应隔间。可对试样进行试验，并可根据对种子对应的试样的试验结果对种子分类。