专利名称：改变PCR产物Tm值达到多重荧光PCR的方法和用途的制作方法实时荧光定量PCR是近年发展起来的ー种新的实时定量检测特定核酸技术，与普通PCR相比，具有定量准确、快速、灵敏度高和特异性强等特点，它已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域，如单细胞或活细胞中RNA的定量、细胞因子的研究、单核苷酸多态性的检测、病毒筛选、细菌病原体检测等。从原理上讲有两大类荧光模式第一种为荧光杂交 探针，如Taqman、分子信标等，基于能量共振转移的原理(FRET);第二种为DNA结合染料，主要为Sybr Green I。前面ー种方法特异性好，除需要合成序列特异引物外，还需要合成高成本的荧光探针，成本较高；后ー种方法经济，只需合成序列特异引物，但特异性相对较差，受引物ニ聚体的影响。实时荧光染料法检测扩增产物的代表是Sybr Green I荧光染料，新型荧光染料EvaGreen也能用于荧光PCR技术。EvaGreen只与DNA双链结合，插入DNA双链时发出荧光；DNA双链解链时释放出来，荧光信号急剧减弱。在加入了荧光染料的体系内，其信号強度代表了双链DNA分子的数量。相对于Sybr Green I来说消除了“染料重分布”的缺陷，且对PCR扩增的抑制作用很小。目前发展起来的多重实时荧光染料PCR技术可以在同一个PCR反应中，通过Tm值分析来区分不同的核酸片段。多重实时荧光PCR技术因具有高效快捷、高产率、高度特异敏感、能降低实验成本以及加速实验进程等优点而得到广泛的应用。研究证明升温速率在O. I0C /s-0. 2V /s时熔解曲线可以区分Tm值差距2°C左右的不同扩增产物，这给引物设计增加一定困难的同时，也限制了部分达不到标准升温速率的实验仪器的应用。因此，在现有较为普遍的实验环境条件下，建立一种准确、快速改变产物Tm值达到多重实时荧光PCR的方法，具有广泛的科研价值和应用前景。
本发明要解决的技术问题是提供一种准确、快速改变PCR产物TM值达到多重荧光PCR的方法，使不同PCR产物的Tm值差距至少大于2°C，采用该方法能够在不同型号的实时荧光定量PCR仪器上有效的区分不同的产物。为了解决上述技术问题，本发明提供一种准确、快速改变PCR产物Tm值达到多重荧光PCR的方法；在原有不同扩增片段Tm值的基础上，选择性地挑选至少I种目的片段小的产物，并在所述产物原有上下游引物5’端基于引物设计原则有针对性地添加碱基，当期望产物TM值变大则相应地多增加碱基GC，当期望产物Tm值变小则相应地多增加碱基AT，从而改变整个扩增片段GC%的比值，以致达到期望的扩增片段Tm值，从而通过熔解曲线能够有效的区分不同扩增片段。作为本发明的准确、快速改变PCR产物Tm值达到多重荧光PCR的方法的改进I)、PCR 引物设计；2)、样品总RNA的(少量)抽提；3)、反转录合成cDNA ；4)、多重荧光PCR扩增；5)、根据多重荧光PCR扩增结果调整步骤I)中的PCR引物，调整规则如下当任意2种扩增片段的Tm值的差<2时，选取其中ー个进行改变；改变规则为在该扩增片段所对应的原有上下游引物5’端基于引物设计原则有针对性地添加碱基当期 望产物Tm值变大则相应地多增加碱基GC，当期望产物Tm值变小则相应地多增加碱基AT。作为本发明的准确、快速改变PCR产物Tm值达到多重荧光PCR的方法的进ー步改进多重荧光PCR 反应体系为5μ I 的 10XPCR buffer, 5 μ I 的 25mM MgCl2,4 μ I 的dNTP(10mM，每种 2. 5mM), 2. 5 μ I 的 EvaGreen, O. 5 μ I 的 DNA 聚合酶，2 μ I 步骤 3)合成的cDNA以及步骤I)所设计的引物(为引物对，包括上、下游引物)中的至少2种(即任意两种组合、任意三种的组合、或任意四种的组合等等)，每种引物各O. 1-1 μ Μ，反应体系总体积 50 μ I (dd H2O 补足)；所用仪器为ABI 7000荧光定量PCR仪，荧光PCR扩增程序为95 V 3min ；95°C 15s ；58°C 30s ；72°C 30s，熔解曲线程序为 95°C 15s, 60°C 30s, 95°C 15s ;从60で开始收集突光信号。本发明还同时提供了利用上述方法所得的改变PCR产物Tm值的用途准确、快速的达到多重实时荧光PCR。本发明的目的在于解决以下问题(I)、多重实时荧光PCR引物设计要求条件较高，每ー对引物都要在保守区域内设计，扩增片段在200bp以下，且无非特异性扩增和引物ニ聚体的生成，另外多种引物对在ー个体系内也必须无相互干扰，无引物ニ聚体生成。往往满足这些严格的要求之后，每种扩增产物相互之间Tm差值难以有效区分开。(2)、多重实时荧光PCR熔解曲线的制作对实时荧光定量仪器要求的条件较高，有研究证明升温速率在O. l°C/s-0.2°C/s时，熔解曲线可以区分Tm值差距2°C左右的不同扩增产物，反之较大的升降温速率则容易使相邻的两种扩增产物的熔解曲线峰发生融合，但是目前普遍使用的荧光定量仪都达不到O. I0C /s-0. 2V /s的升温速率，例如ABI 7300荧光定量仪的升温速率就高达I. I0C /S。因此建立一种准确、快速改变产物Tm值达到多重实时荧光PCR的方法可使多重实时荧光PCR发挥更大的应用价值。为了达到上述目的，本发明的技术方案是对多重荧光PCR产物中某种或者某几种产物进行简便有效地调节产物Tm值。在反应体系离子浓度一定的条件下，Tm值主要由产物长度，GC含量及GC分布结构決定的。在不改变原有产物的基础上，结合引物设计原则在上游引物和下游引物的5’端添加若干碱基，改变整个扩增产物的GC%，期望产物TM值变大则相应地增加GC碱基，期望产物Tm值变小则相应地増加AT碱基，改变整个扩增片段GC%的比值，以致达到期望的扩增片段Tm值，从而通过熔解曲线能够有效地区分不同扩增片段。且若扩增片段越短那么在引物上人为增加一些碱基对整个扩增片段的Tm值影响越显著，从而达到改变整个扩增产物Tm值的目的。本发明具体可通过以下技术方案实现第一歩PCR引物设计本发明以4种马铃薯病毒马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)，马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY),马铃薯卷叶病毒(Potato virus, PLRV)及马铃薯 A 病毒(Potatovirus, PVA)为试验对象。从NCBI中下载目前已登记的马铃薯病毒PVX、PVY、PLRV和PVA所有的序列，应用引物设计软件分别设计引物，选择各病毒扩增产物理论Tm值相差2°C左右的引物对组合，根据下述实验测得的4种病毒扩增产物Tm值，利用上述设计原则，即有针对性地添加碱基，进行调整，最終设计出可以有效区分4种病毒扩增产物Tm值(形成不同熔解曲线峰)的引物对组合，设计引物的时候注意扩增片段长短以及引物自身和引物间ニ聚体的问题。 注表I中的PVX、PLRV-1、PVY、PVA-1所选用的引物，根据形成的引物对所对应的扩增产物理论Tm值，选择各病毒扩增产物Tm值差距2 °C左右的引物对。表I本发明中所设计的PCR弓丨物本发明公开了一种准确、快速改变PCR产物Tm值达到多重荧光PCR的方法；在原有不同扩增片段Tm值的基础上，选择性地挑选至少1种目的片段小的产物，并在所述产物原有上下游引物5’端基于引物设计原则有针对性地添加碱基，当期望产物TM值变大则相应地多增加碱基GC，当期望产物Tm值变小则相应地多增加碱基AT，从而改变整个扩增片段GC％的比值，以致达到期望的扩增片段Tm值，从而通过熔解曲线能够有效的区分不同扩增片段。利用上述方法所得的改变PCR产物Tm值的用途是准确、快速的达到多重实时荧光PCR。