专利名称：非标记荧光pcr结合hrm分析技术检测阪崎肠杆菌的方法阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌，最近，国际上有学者建议将其更名为克罗诺杆菌属(Cronobacterspp)，但未得到官方正式确认。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和茵血症，死亡率高达50%以上。国际有众多学者针对阪崎肠杆菌生化特征和核糖体间隔序列等，将其分为两大分支，其代表菌株分别为美国菌种保藏中心的ATCC 51329和ATCC 29544。荧光PCR检测技术大致分为两大类荧光探针法(标记荧光PCR)和通用型的荧光 染料法(非标记荧光PCR)。前者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于扩增序列专ー检测，不过检测成本要高很多。而后者主要是利用荧光染料与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的増加，其优点是无需另外设计荧光探针，简便易行，成本较低。其中，荧光染料又分为非饱和染料(如Sybr Green)和饱和染料(如 LC Green 等)。相对Sybr Green等非饱和染料来说，Eva Green、LC Green、SYT09等饱和染料具有以下优点①饱和的染料对PCR反应没有任何抑制作用，因此可以在PCR反应之前加入，而其它非饱和荧光染料若较多加入到反应液中会抑制PCR反应，因此只能限量加入，从而对荧光PCR反应的指示收到限制。②DNA高温变性吋，非饱和荧光染料加入则会造成DNA双链高温变性吋，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，而饱和染料则不会出现此类情況。③高温稳定，对于高GC含量的PCR产物，Tm值较高，在DNA双链高温熔解吋，饱和突光染料结合核酸更稳定。高分辨熔解曲线(high-resolution melt, HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于基因突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是ー种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解曲线分析，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性(SNP)、甲基化、基因分型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。HRM利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录熔解曲线，从而对样品进行检測。虽然带HRM模块的荧光PCR仪与普通荧光PCR仪购买价格相差不大，但其温度均一性要高很多。如普通定量PCR仪温度均一性±0. 25 °C，温度分辨率为O. I °C，而Rotor-Gene 6000温度均一性为±0.01° C，温度分辨率为0.02° C。其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分，加上饱和性染料(LC Green、Eva Green等)的出现,使得HRM这ー技术的普及使用成为可能。目前，阪崎肠杆菌的检测方法主要有传统的培养方法和分子检测方法。其中传统的阪崎肠杆菌分离检测方法，依赖于生化和形态学特点，国际上通常以美国FDA颁布的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离计数”作为经典方法。2008年我国也參照制定颁布了阪崎肠杆菌检验国家标准(GBT 4789. 40-2008)，并于2010年进行了修订(GB4789. 40-2010)，规范了阪崎肠杆菌传统培养检测方法和分子检测方法。但传统的检测方法存在操作繁琐、耗时长、易漏检等缺点。分子检测方法中，包括了常规PCR方法，但是常规PCR需要扩增后进行电泳，操作复杂而且极易引起污染。而探针法PCR则存在检测成本很高，试剂保存期短等缺点。
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供ー种操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法。为了达到上述目的，本发明采用以下方案—种非标记突光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法,其特征在于包括以下步骤A、根据阪崎肠杆菌OmpA基因设计引物对；B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分型分析，确定阪崎肠杆菌的基因型。进ー步地，本发明按以下反应步骤进行(I)采用PRMER等软件，根据GeneBank发布的序列，针对阪崎肠杆菌OmpA基因设计的引物对，设计非标记荧光PCR扩增阪崎肠杆菌上游引物序列为5 ‘-GGTGAAGGAITTAACCGTGAACTT-3’序列，其下游引物为5 ‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’(2)标准品模板的制备以常规PCR方法扩增阪崎肠杆菌OmpA基因。PCR产物经1%凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选但菌落至含含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。(3)非标记荧光PCR扩增和HRM分析提取阪崎肠杆菌样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用带HRM模块的荧光定量PCR仪(包括Corbett Rotor公司的Gene 6000、Roche公司LightCycler 480等)对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物的Tm值和基因型。本发明中制备所述荧光定量PCR反应中所采用的反应液20 μ L，包含下列成分本发明公开了一种非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤A根据阪崎肠杆菌OmpA基因设计引物对；B提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；C应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分型分析，确定阪崎肠杆菌的基因型。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法。